全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月1032
地被菊的再生与转化系统的建立
孙淑斌1 徐文君1 衣艳君2 刘兆普1,*
1 南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095；2 山东曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜 273165
提要 文章初步建立了地被菊品种‘早小春’组织培养植株再生系统和农杆菌介导的稳定转化系统。幼蕾管状花瓣诱导
培养获得再生植株的最适培养基为 MS+2.0 mg·L-1 ZT+0.5 mg·L-1 2,4-D，愈伤组织诱导率可达 95% 以上，不定芽的分化率
达到87%以上。以再生植株叶片为外植体进行遗传转化实验的结果表明：用MS液体培养基稀释的农杆菌液效果最佳，以
感染 8 min 左右, 共培养 3 d 为宜。同时附加 40 mg·L-1 卡那霉素和 500 mg·L-1 头孢霉素是地被菊转化的最佳条件。
关键词 地被菊；再生；转化；农杆菌
Establishment of the Efficient System for Regeneration and Genetic Transforma-
tion of Ground-cover Chrysanthemum (Rudbeckia hirta Linn.)
SUN Shu-Bin1, XU Wen-Jun1, YI Yan-Jun2, LIU Zhao-Pu1,*
1College of Resourceand Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2 College of Life
Sciences, Normal University of Shandong Qufu, Qufu, Shandong 273165, China
Abstract The research was conducted using petals of ground-cover chrysanthemum (Rudbeckia hirta Linn.)
cultivar ‘Zaoxiaochun’ as explants to establish a highly efficient regeneration system and its stable Agrobacterium-
mediated transformation system. The result showed that the rate of callus formation was 95%, on the improved
callus induction medium containing MS+2.0 mg· L
-1 ZT+0.5 mg·L-1 2,4-D. The differentiation rate of adventi-
tious buds on differentiation medium was 87%. The genetic transformation was performed. The results showed
that dilutcd Agrobacterium with MS was the best medium, the suitable infection duration was around 8 min,
and the appropriate co-culture duration was 3 d; the optimum concentrations of kanamycin and cephalosorine
for transformed leaves of ‘Zaoxiaochun’ were 40 and 500 mg·L-1 respectively.
Key words ground-cover chrysanthemum (Rudbeckia hirta Linn.); regeneration; transformation; Agrobacterium
收稿 2006-05-10 修定 2006-10-25
资助 国家“863”计划(2 00 3 A A 6 2 7 0 4 0 )。
*通讯作者(E-mail: sea@njau.edu.cn, Tel: 025-84396678)。
菊花(Dendranthema morifolium)起源于我国，
是世界上著名花卉之一，具有很高的观赏价值。
由于人们对传统菊花花大、色艳等品质因素的追
求，造成其抗逆性差、管理要求高，很难成片
成行栽种。地被菊(Rudbeckia hirta Linn.)又称黑
心金光菊，科属菊科金光菊属，具有花色鲜艳、
株型矮小紧凑、管理粗放且抗逆性强、适合于露
地栽植过冬等特点，越来越广泛地应用于城市绿
化。另外，农杆菌介导法以其经济、操作简单、
能够准确完整地将 T-DNA 转入受体细胞并以单拷
贝或低拷贝的形式插入到受体基因组中、以及植
物的转基因遗传较稳定等优点已广泛应用于双子叶
植物的遗传转化，自Lemieux (1989)利用农杆菌
介导法诞生第 1 株转基因菊花以来，菊花遗传转
化体系已逐步建立，但是目前在地被菊上的此类
研究还鲜有报道。
基于以上两点，本文以地被菊品种‘早小
春’为材料，建立了地被菊再生系统。再以组
培苗叶片为外植体，经农杆菌感染后, 在选择培养
基上诱导愈伤组织，并以产生抗性愈伤的频率为
指标，对影响农杆菌介导的地被菊浸染时间、共
培养时间、抗生素浓度等因素的优化进行了研
究。筛选出适合于遗传转化的再生体系，从而初
步建立了以农杆菌Ti质粒为载体的地被菊遗传转
化系统。
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月 1033
材料与方法
于2005 年 7、8 月取露地种植无病虫害和生
长健壮的地被菊(Rudbeckia hirta Linn.)幼蕾管状花
瓣作为外植体。大肠杆菌(Escherichia coli)为
JM101，农杆菌菌株为 LBA4404，植物双元表达
载体质粒pBI121 (为本实验室保存)。各种酶和生
化试剂分别购自上海生工、TaKaRa、上海华舜和
Sigma 等公司。
幼嫩花瓣用自来水冲洗10 min 后滤纸吸干，
在超净工作台上，用70%酒精浸泡30~60 s，0.1%
升汞消毒液浸泡15 min，无菌水冲洗5~6次， 用
镊子剥去外层鳞片，花瓣切成两半，接种于 MS+
0.5 mg·L-1 2,4-D+2.0 mg·L-1 ZT 培养基上。3~6 d
后，切口处开始膨大；10~15 d 切口边缘处有淡
黄色或淡绿色的愈伤组织产生；1 个月后形成愈
伤组织块， 随后分化出丛芽。继代培养时将初代
培养基的芽丛分离继代，获得再生植株。培养室
温度为(25±2)℃，每天光照 14 h，光照强度为
40~60 mmol·m-2·s-1。无菌苗叶片再生基本同上，
最适培养基为 MS+1 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA
(为本实验室成熟技术)。
制备表达工程载体时，参照拟南芥Na+/H+ 逆
向转运蛋白两端的序列设计引物，并引入酶切位
点，PCR 扩增目的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳
后用胶回收试剂盒回收，连接到 T 载体，测序确
定其准确性。限制性内切酶双酶切连入载体
pBI121，转化大肠杆菌 JM101，挑选单克隆，小
量提质粒后进行双酶切鉴定，确定阳性克隆，电
转化至农杆菌LBA4404 菌株(为本实验室保存)中
(Zhang 等 2001)。
作遗传转化实验时，将含有外源基因的Ti质
粒转入农杆菌，在含40 mg·L-1 卡那霉素的LB 培
养基上培育农杆菌24 h，最终使菌液OD600为 0.4~
0.6。
农杆菌介导采用叶盘法(Horsch 等 1985；
Nehra 等 1999)。从组培苗中获取无菌叶片在含
LBA4404 菌株悬浮液中轻摇 8 min，在不加抗生
素的再生培养基上共培养3 d后，移至含40 mg·L-1
卡那霉素和 500 mg· L-1 头孢霉素的再生培养基上
暗培养 6 d，再移至光照下培养。对照叶盘在无
菌培养液中悬浮 8 min 后，培养方法同上。取再
生芽的幼叶培养于含40 mg·L-1卡那霉素的再生培
养基上，观察其再生情况作为转化芽的早期鉴
定。
实验结果
1 地被菊花瓣愈伤组织诱导及再生苗的获得
取幼嫩花瓣，分别接种到含有不同种类和浓
度的生长素类似物和细胞分裂素类似物的培养基
中，观察愈伤组织诱导及再生苗分化情况的结果
表 明 ：
(1)不同浓度的IAA﹑ NAA和 2,4-D对地被菊
愈伤组织的诱导有明显差异(图1)。添加2,4-D的
诱导率较高，而且愈伤组织质地比较紧密，不易
褐化；NAA 虽然也有较高的诱导率，但生根情况
较多，不宜选用。所以，我们选用浓度为0.5 mg·L-1
的 2,4-D。
(2)在 MS 培养基中单独加2,4-D 时，愈伤组
织生长不良。如果 2,4-D 与 ZT 以一定的比例组
合， 则大量产生愈伤组织。花瓣外植体愈伤组织
诱导和生长最适宜的培养基为 MS+2.0 mg ·L-1
ZT+0.5 mg·L-1 2,4-D，其愈伤诱导率可高达 95%
(表 1)，愈伤组织生长良好，继代培养 1 次后，
由疏松、浅黄色的愈伤组织转变成翠绿而致密状
的愈伤组织，并进一步分化出不定芽。而高浓度
的 ZT 和 2,4-D 对愈伤组织的抑制作用较大。
2 地被菊的遗传转化
(1)农杆菌菌液的性质直接影响叶片遗传转化
图1 IAA、NAA 和 2,4-D 对诱导
地被菊愈伤组织形成的影响
Fig.1 Effect of IAA, NAA and 2,4-D on callus formation
of petals of ground-cover chrysanthemum
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的效率。在使用 LB 培养基上活化的农杆菌菌液
前，我们用不同的培养基来稀释它，以达到实验
所需的 OD600 为 0.4~0.6。用 MS 液体培养基来稀
释菌液浸泡叶片，愈伤能力较 LB 低一些，但一
旦生出芽体，芽生长健旺，且进一步形成根的能
力较强。以 LB 培养基作稀释时，外植体有较强
的愈伤组织生长能力，但分化成芽的能力则下
降，且芽的生长势较弱。YEB 与 LB 有类似的情
况(图 2)。
处理 10 盘，每盘摆放 20 片，用经过预培养的叶
片和MS稀释的菌液以不同的浸泡时间和共培养时
间进行转化试验(图 3)。
结果表明，农杆菌浸泡时间和共培养时间均
对地被菊的转化有明显的影响。相对而言，共培
养时间影响更大。另外，浸泡和共培养时间之间
存有一定的交互作用。总之，浸泡 8 min (与图
2 一致)及共培养 3 d 为宜，为两者的最佳组合。
表1 不同浓度ZT对地被菊愈伤组织和再生芽形成的影响
Table 1 Effect of different concentrations of ZT on callus
formation and bud regeneration of ground-cover chrysanthemum
2,4-D浓度/ ZT浓度/ 形成愈伤组织的 再生芽的外
mg·L-1 mg·L-1 外植体数/个 植体数/个
0.5 1.0 45 (32.14) 34 (24.2)
0.5 1.2 57 (40.71) 45 (32.1)
0.5 1.5 91 (65.00) 78 (55.7)
0.5 2.0 134 (95.71) 123 (87.8)
0.5 3.0 85 (60.71) 79 (56.4)
培养基上接种的叶盘数均为 140 个，括弧内为相对数。
图2 不同的培养基和农杆菌菌液浸泡
时间对地被菊叶片分化率的影响
Fig.2 Effect of different media and infection duration on
differentiation rate of ground-cover
chrysanthemum leaves
(2)对遗传转化的外植体的预处理、浸泡时间
和共培养时间同样影响着转化的效率。不进行预
培养，直接用农杆菌感染叶片，其再生频率极低
(程林梅等 2004)，因此，遗传转化之前，我们
将无菌叶片放置在MS培养基上预培养2 d。每个
图3 浸泡和共培养时间对地被菊叶片转化频率的影响
Fig.3 Effects of durations of infection and co-culture transfor-
mation on frequency of ground-cover chrysanthemum leaves
(3)卡那霉素和头孢霉素对叶片的再生能力有
很大的抑制作用(Joerso和Okkels 1996；Joersbo
2001；周翼明等 1996)，适量的卡那霉素与头孢
霉素是获得抗性愈伤组织和再生芽的关键。卡那
霉素浓度过高，对转化细胞会有强烈抑制，以致
大量的外植体在选择培养基上很快死亡； 而浓度
过低, 则对筛选不利，会产生假阳性。同样，头
孢霉素过高或过低，亦不能恰当控制农杆菌生
长，因而不能有效得到抗性芽。表 2 显示，当
培养基不含卡那霉素时，再生频率达100%；添加
10 mg·L-1 卡那霉素时，抗性再生芽的频率下降至
40% 以下；添加 20 mg·L-1 卡那霉素时，叶片再
生能力受到严重抑制，只有部分叶片能形成愈伤
组织；添加 40 mg·L-1 卡那霉素时，几乎不能形
成愈伤组织及芽；而50 mg·L-1 卡那霉素使叶片的
叶色迅速变白并死亡。因此，40 mg·L-1 卡那霉素
可能是筛选转化细胞的极限浓度。选择培养基中
添加500 mg·L-1 头孢霉素，则再生芽受到影响较
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分裂，而处在分裂状态的细胞更易整合外源
DNA；(3)在高渗培养基上进行外植体预培养还可
以减少伤口处的细胞伤流液，因而细胞内的液泡
减小并导致细胞发生一定程度的质壁分离，这样
农杆菌易于接触伤口周围的细胞，从而提高转化
率。我们的实验结果表明，预培养对外植体的分
化是有利的。不进行预培养直接用农杆菌感染叶
片，其再生频率很低，绝大部分叶片在 5 d 后腐
烂褐化；而在农杆菌菌液浸染之前预培养1 d，再
生频率可明显提高，且随着预培养时间的增加而
逐步提高。
农杆菌感染外植体时，菌液浓度(黄璐和卫
志明 1999)和浸染时间对地被菊转化有一定的影
响。地被菊品种‘早小春’外植体菌液适宜浓
度OD600 为 0.5，浸泡时间为 8 min，在此情况下
产生愈伤组织及不定芽效率高。当延长时间至十
几分钟时，转化效率下降，说明长时间菌液浸染
不利于转化。
本文获得的再生芽幼叶可在加40 mg·L-1卡那
霉素的培养基中生长并继代，说明再生芽具有卡
那霉素抗性，由于地被菊叶盘对卡那霉素具有较
强的敏感性，故初步认为外源 NPTII 基因转入叶
细胞中，其表达后的地被菊叶细胞再生芽具有了
卡那霉素抗性。有关转基因的地被菊植株中外源
基因的表达、遗传稳定性和遗传效应等正在进一
步研究中。
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表2 卡那霉素和头孢霉素对地被菊叶片再生的影响
Table 2 Effect of different concentrations of kanamycin and
cephalosorine on regeneration of ground-
cover chrysanthemum leaves
抗生素及其浓度/mg·L-1 愈伤组织诱导率/% 芽再生频率 /%
卡那霉素 0 100 100
10 72.3 35.6
20 35.1 10.2
30 21 8.5
40 17 2.6
50 0 0
头孢霉素 0 100 100
300 100 100
400 100 100
500 98.4 96.2
600 88.2 86
700 81 80
小；低于500 mg·L-1 头孢霉素不能控制农杆菌生
长；而浓度再增加，则会降低芽再生频率。我
们的结果表明同时加40 mg·L-1卡那霉素和500 mg·L-1
头孢霉素是地被菊转化体筛选的最佳条件。
讨 论
菊花后代表达不稳定，转基因沉默，共转化
效率较低(蒋细旺和包满珠2003)，因此建立高效
稳定的再生系统，特别是提高植株的转化率尤为
重 要 。
成功的基因转化首先依赖于良好的受体系统
的建立，一般要求是再生频率在 8 0 % 以上，且
具有稳定性和重复性。自Hill (1968)用芽尖通过愈
伤组织诱导成株建立菊花的再生系统以来，又相
继建立了以叶片、茎(Rout和Das 1997；Annadana
等2000)、管状花(Boase等1998；Chakrabarty 等
1999)和花梗等为外植体直接分化成株的再生体
系。本文以管状花瓣为外植体成功地建立起地被
菊的再生系统，获得大量无菌再生苗，从而为进
一步的高效转化系统建立提供充足的外植体。
在用农杆菌感染外植体之前，文献中外植体
是否需要预培养的结果很不一致。一般有以下几
种看法：(1)外植体预培养伤口周围的细胞之所以
修复，是因为伤口愈合过程中分泌的酚类物质可
诱导农杆菌的vir基因启动；(2)预培养可促进细胞
植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月1036
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