全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 2期，2004 年 4 月 235
收稿 2003-06-04 修定　 2003-10-23
资助　 国家自然科学基金项目(30100009)。
* 通讯作者(E-mail:xfli@bio.ecnu.edu.cn, Tel:021-
62233225)。
酵母双杂交技术及其在植物研究中的应用
朱金鑫 李小方*
华东师范大学生命科学学院，上海 200062
Yeast Two-hybrid Technology and Its Applications in the Research of Plants
ZHU Jin-Xin, LI Xiao-Fang *
College of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200062
提要 酵母双杂交技术能有效地检测蛋白质之间的相互作用。该文简单介绍了此技术的工作原理和操作程序，以及十
几年来此项技术在植物功能基因组学和蛋白组学研究中的应用情况。
关键词 酵母双杂交； 植物研究； 应用
酵母双杂交体系简称双杂交体系(two-hybrid
system)，又称相互作用陷阱(interaction trap)，是
1989年由Fields和Song[1]提出并初步建立的。这
一系统是在酿酒酵母中研究蛋白质间相互作用的一
种非常有效的分子生物学方法。上个世纪90年代
初期发展成为一种灵敏的真核细胞内鉴定基因的方
法，可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相
互作用的蛋白质的编码基因[ 2 ]。此技术以其简
便、灵敏、高效以及能反映不同蛋白质之间在活
细胞内的相互作用等特点得到广泛应用[3]。迄今
为止，在双杂交体系的基础上已发展了很多相关
技术，人们应用双杂交体系及相关技术已取得了
很多科研成果。本文介绍这一技术在植物研究中
的应用和前景。
1 工作原理[1]
酵母双杂交系统最初是根据真核转录调控的
特点建立的。真核生长转录因子含有两个相对独
立的功能区域：DNA 结合结构域(DNA binding
domain, DNA-BD)和转录激活结构域(activation
domain, AD)。前者负责识别结合上游顺式激活序
列(upstream activation sequence, UAS 如GAL4
U A S )，后者则与转录复合物的其它成分相互作
用，启动所调节基因的转录。B D 与 A D 可以人
为地分离，分离的 DNA-BD 和 AD 单独分别作用，
并不能激活转录反应，但是当二者在空间上较为
接近时，则呈现完整的转录因子的转录激活活
性。将 DNA-BD 序列与一已知的蛋白质 X(常称为
诱饵，bait)的基因结合，构建出BD-X 融合表达
载体；将AD 序列与拟研究的另一蛋白Y——靶蛋
专题介绍Special Topics
图1 酵母双杂交体系的原理
上游顺式激活序列(UAS)和报道基因整合在工程酵母菌的染
色体上。(a)编码蛋白质 X 的基因与编码 DNA 结合结构域的序列
(DNA-BD)融合形成一杂交体(BD-X)，该杂交体表达形成的融合
蛋白能够与报道基因的 UAS 结合；编码蛋白质 Y 的基因与转录
激活结构域(AD)的序列融合形成的另一杂交体(AD-Y)，该融合
蛋白不能与报道基因的 UAS 结合。(b)如果蛋白质 X 与 Y 能够相
互作用，BD 与 AD 就被结合在一起,形成一完整的转录激活因
子，从而激活报道基因的表达。
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白(target 或 prey)的基因结合，构建出AD-Y表达
载体(图1-a)。将这两个表达载体共转化至酵母细
胞内表达，此种酵母菌株即含有特定报道基因(如
LacZ、His3 等)，并且已是去掉相应转录因子的
编码基因，因此本身无报道基因的转录活性。如
果蛋白质 X 和 Y 可以相互作用，则即导致 BD 与
AD 在空间上的接近，从而激活 UAS 下游启动子
调节的报道基因的表达(图 1-b); 反之，BD与 AD
就不能结合，报道基因也不能被启动表达。因此,
可以通过检测报道基因表达与否来研究蛋白质之间
的相互作用。如果将 Y 换成 cDNA 文库，就可以
从cDNA文库中筛选与已知蛋白质X相互作用的未
知蛋白质的编码序列。
2 组成
酵母双杂交系统由3个部分组成：(1)与BD融
合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白
(bait)。最常用的 DNA-BD 是 GAL4 和 LEX 蛋白
的 DNA-BD。(2)与 AD 融合的蛋白表达载体，被
表达的蛋白称靶蛋白(p r e y )。最常用的 AD 是
GAL4 和 HSV VP16 的 AD。(3)带有一个或多个报
道基因的宿主菌株。常用的报道基因有LacZ和营
养缺陷型标记如His3等，前者可以方便地通过X-
gal存在时的颜色反应筛选阳性克隆，后者则根据
筛选培养基上的生长与否判断。目前常用的是选
择两种或两种以上的报道基因，因而使检测更准
确和有效。而双杂交质粒上分别带有不同的抗性
基因和营养标记基因，这很有利于实验后期杂交
质粒的鉴定与分离。
3 操作程序
现在已有几种改进的酵母双杂交系统的操作
程序大同小异，这里只介绍比较通用的一种。
3.1 受体菌的背景 如酵母菌Y190，其染色体上整
合有 GAL4 上游顺式激活序列(GAL4 UAS)和报道
基因 His3。Y190 同时还含有一质粒，此种质粒
含有 GAL4 操纵基因和下游的 LacZ 基因。这样
Y190中就具备了同时受GAL4操纵基因调节的2个
报道基因。
3.2 表达诱饵蛋白质粒的构建 将已知的诱饵蛋白
编码基因按正确的取向和读码结构克隆进 DNA-
BD 质粒如 pGBT9 中(GAL4 + Polylinker+Trp1+
Ampr)，构建成可表达GAL4-bait融合蛋白的质粒
pGAL4-bait，此融合蛋白即为双杂交系统中的第
一个杂交蛋白。
3.3 诱饵蛋白的鉴定 将pGAL4-bait转化Y190，
由于质粒 pGBT9 含有 Trp1 基因，所以在缺 Trp1
的培养基上可以筛选到pGAL4-bait质粒的酵母转
化子。通过检测 His3 和 LacZ 基因的表达活性，
可鉴定诱饵蛋白的特性。若此蛋白本身具有转录
激活活性，那它就不适宜做诱饵蛋白，需重新设
计或修饰；反之，就可以继续进行下续步骤。
3.4 表达靶蛋白质粒的构建 将有可能与诱饵蛋白
相互作用的另一蛋白质的编码基因克隆到 AD- 质
粒如 pGAD424 或 pACT Ⅱ中，如果是筛选未知蛋
白，则把 cDNA 片段克隆在 pGAD424 或其他质粒
载体上， 构成 cDNA表达文库。此种质粒含Lue2
基因，可在缺 Lue2 的培养基上得到阳性转化子。
此质粒可表达第二个杂交蛋白。
3.5 蛋白质之间相互作用的鉴定或相互作用蛋白的
猎取 从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒
DNA，并共转化给感受态的酿酒酵母寄主菌株(如
Y190)，再将此种共转化的酵母菌株涂布在 Gal/
His-Trp-Leu-+ 3-AT培养基上，呈现蓝色的则为阳
性；如果是筛选文库，筛选呈蓝色的阳性菌落，
并培养在仅缺Lue2的培养基中即可获得只含靶蛋
白或文库基因的质粒，提取其中的质粒转化大肠
杆菌的 DH5a, 可获得只含靶蛋白或文库质粒的
DH5a，然后进一步分离相应的质粒，并对其编
码未知蛋白的 cDNA 进行序列分析，以期发现新
基 因 。
4 在植物研究中的应用
用酵母双杂交体系研究植物主要集中于模式
植物拟南芥，也偶有用于研究烟草、矮牵牛和菠
菜的报道。
4.1 筛选 cDNA文库中编码与诱饵蛋白特异作用
的未知蛋白并用于研究这些蛋白质的功能，这在
植物研究中应用最多，并涉及诸多方面。
4.1.1 植物发育生理 作为开花生理研究中的重要
里程碑之一的是1960年证实光敏色素的存在。光
敏色素是植物一种重要的光受体，参与植物发育
的光形态建成已被确认，但其在感受环境信息之
后的进一步功能，一直是以假说解释的，研究也
长期处于停滞状态。后来，随着双杂交系统的完
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善，人们开始用此技术筛选克隆与光敏色素相互
作用的蛋白质。美国Quail实验室的Ni等[4]首先以
光敏色素 C 末端序列为诱饵，从拟南芥的 cDNA
文库中筛选到一个与光敏色素发生相互作用的蛋白
PIF3，是一个转录因子。马力耕和孙大业[5]也克
隆到一种体内与光敏色素相互作用的转录因子，
并证实被光活化的光敏色素可直接进入细胞核与转
录因子结合启动基因表达。Fankhauser等[6]和Choi
等[7]用同样的方法，分别检测到另外2种与光敏色
素相互作用的蛋白：PSK1 和 NDPK2。Quail[8]用
酵母双杂交系统筛选到与光敏色素家族成员相互作
用的成分。根据对此种成分的分析，他们提出了
新的细胞内信号可能的传递途径。
近年来，随着分子遗传学和分子生物学技术
的迅速发展以及这些技术在植物发育过程中的广泛
应用，越来越多控制发育的基因，尤其是控制花
器官形成的基因相继得到克隆。其中很大一部分
是含 MADS-box 的转录调控因子。研究这些基因
的生物学功能，如何对它们进行调控，势必需对
与其相互作用的因子进行鉴定，而酵母双杂交系
统则可以方便地解决这一问题。Fearon 等[9]用此
种技术证实拟南芥花发育期间的器官特异性因子
AGAM O U S 与一特异蛋白质相互作用，后者富含
重复亮氨酸序列。这是首次证实植物中 M A D S -
box的转录调控因子与非MADS-box蛋白之间发生
作用。
花粉形成、花粉管萌发及其伸长生长机制也
是近年来的研究热点。PRK1是矮牵牛花粉中特异
表达的一种受体类似物(receptor-like)激酶。此种
蛋白是有丝分裂后配子体发育和胚囊形成所必需
的，但是有关 PRK1 在此途径中的分子作用机制
还知之甚少。Seong[10]用 PRK1的激酶区域作诱饵
筛选与 PRK1 相互作用的蛋白时，得到一 cDNA 克
隆，其编码的蛋白与人和酵母的翻译起始因子
eIF2B 中的 b亚基有很高的同源性。这暗示，在
花粉发育过程中，由 PRK1 介导产生的信号，其
所调节的基因表达在很大程度上是在翻译水平上进
行的。
P颗粒(granule)的形成是植物育性所必需的，
而GLH 蛋白是组成P颗粒的重要成分, Smith等[11]
用酵母双杂交系统证实其与受粉必需蛋白 CSN-5
及 KGB-1 相关，还与细胞骨架蛋白 ZYX-1 有关。
4.1.2 细胞周期调控 植物生长发育是以细胞的分
裂、生长和分化为基础的，因此在细胞水平上研
究植物的发育必然要涉及到细胞周期的调控。近
年研究得知，控制细胞周期的关键酶是一种依赖
于细胞周期蛋白的蛋白激酶(cyclin-dependent protein
kinase，CDK)，因此研究植物发育过程中CDK 活
性的调节遂非常活跃。Doonan和Forbert[12]用双杂
交技术分离了 CDK 的相互作用蛋白，如 cdk 抑制
子和suc1 的同源物。Zhou 等[13]研究植物 CDK 抑
制因子 ICK 与细胞周期调节因子间相互作用的结
果，证实可能存在 A 组和 B 组两组 C D K 抑制因
子，与这两组抑制因子相互作用的细胞周期调节
因子并不一样。人们已经知道，E2F 是调节哺乳
动物细胞周期的转录因子，一些植物中的 E2F 同
源基因也已相继得到克隆。Ramirez-Parra 和
Gutierrez等[14]以 E2F作“诱饵”，采用酵母双杂
交技术在小麦中分离到一种编码小麦 DP 蛋白的
cDNA 克隆。Sekine 等[15]在烟草中也证明 NtE2F
与烟草Rb(retinoblastoma)相关蛋白是相互作用的。
4.1.3 信号转导 蛋白质磷酸化是细胞间以及细胞
内外信号转导的重要机制之一，在原核细胞和动
物细胞中已广泛进行了研究。但在植物细胞中研
究的起步相对较晚。上个世纪90年代以来人们在
研究植物激素作用的分子机制中，逐步发现许多
与动物细胞及原核细胞中磷酸化途径同源的基因，
如乙烯受体ETR1和细胞分裂素信号转导途径中的
CKI1 都是组氨酸激酶。但是这些基因的功能如
何、在其作用过程中还有哪些因素参与都是有待
解决的问题。双杂交系统的完善是对这方面研究
的极大推进。Yamada等[16]在研究组氨酸到天冬氨
酸的磷酸化信号转导途径时，发现一拟南芥的
AtDBP (Arabidopsis thaliana DNA-binding protein)
蛋白可以与细胞分裂素诱导的ARR4反应调节因子
相互作用。Urao等[17]从拟南芥中克隆到这一途径
中的1个组氨酸激酶(ATHK1)、3个磷酸化中间产
物(ATHP1~3)和 4个反应调节因子(ATRR1~4)的编
码基因，并用酵母双杂交技术检测了它们之间的
相互作用， 初步查清了拟南芥中从组氨酸转到天
冬氨酸的磷酸化信号转导的可能路径。同样，
Ichimura 等[18]对拟南芥的MAPK 信号级联系统也
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作了研究。他们以 ATMEKK1 为诱饵，筛选得到
M A P K K 同源物 A T M K K 2 和 M A P K 的同源物
ATMP K 4 以及一未知蛋白。ATMKK 2 和拟南芥
中的 MEK1 (一种 MAPKK)同源性很高。这些结果
表明 ATME KK、ATM KK2/ME K1 和 ATM PK4 有
可能组成拟南芥中的 M A P K 级联。
此外，戴良英等[19]用酵母双杂交系统研究了
从拟南芥的茉莉素信号转导链中分离得到的第一个
基因——CoI1基因的互作基因。Yamazaki等[20]研
究藻类植物Perilla frutescens的花青素生物合成途
径调节机制，并证实特异 bHLH 因子 MYC-F3G1
可与另一 bHLH 因子 MYC-RP 以及含 WD40 重复
序列的蛋白 PFWD 相互作用，而与光诱导 MYB 因
子 M Y B - P 1 则不发生作用。他们认为 M Y C -
F 3 G 1、M Y C - R P 和 P F W D 的蛋白复合体对 P .
frutescens中花青素生物合成基因有调节作用。
4.1.4 与植物蛋白相互作用的病毒蛋白 自从上个
世纪40年代提出从遗传上说明病原和寄主相互关
系的基因对基因学说之后，人们对致病和抗病机
制的认识即一步步深入，70年代开始运用分子生
物学观念和技术分析病原的无毒基因和致病基因以
及寄主的防卫基因和抗病基因，现在又开始研究
病原诱导下寄主多种防卫反应发生的早期信号传导
机制以及病原致病基因与植物反应基因间的互作。
万曦等[21]用Duplex-A酵母双杂交系统克隆植物早
期结瘤素基因 ENOD40 的受体基因，得到 5 个克
隆，为进一步分析根瘤形成过程中信号转导打下
了基础。Wittmann等[22] 通过拟南芥cDNA文库筛
选证实芜菁镶嵌病毒与拟南芥真核转录起始因子
4E之间可以相互作用。Wang等[23] 的实验表明夏
南瓜黄色镶嵌病毒(ZYMV)的 RNA 依赖型 RNA 聚
合酶和宿主多聚腺苷酸(Poly-A)结合蛋白[Poly-(A)
binding protein, PABP]可以相互作用，这一结果可
以帮助人们了解病毒感染过程中宿主PABP的重要
作用。用此技术研究植物抗病性，在小麦、烟
草、番茄和玉米中也均有报道[24~26]。
4.2 检测两种或多种蛋白之间的相互作用 随着分
子遗传学和分子生物学技术的迅速发展和在研究植
物生命过程中的广泛应用，越来越多的不同功能
基因在不同领域和不同的实验室中分离，如控制
发育的多种基因、调节植物抗性的基因、参与植
物感受外界因子的信号传导相关基因等。这些基
因在相关的生物学功能中的关系是直接的或是间接
的，如何调控，在解决这些问题之前往往要确定
它们之间是否相互作用，酵母双杂交系统可以快
速而方便地解决这一问题，并已在以下领域的研
究中得到广泛运用。
4.2.1 信号转导级联反应 在植物中，一些MAP
激酶(M A P K )、M A P K 激酶(M A P K K )和 M A P K K
激酶(MAPKKK)的同源物已有所报道，但在高等
植物中这些激酶之间的相互作用和 MAPK 级联的
分子分析的报道还未见。Mizoguchi等[27]用双杂交
技术证明 A T M P K 4 (一种 M A P K )、M E K 1 (一种
MA PK K )和 AT M E K K 1 (一种 MA PK K K )可以相互
作用，在拟南芥中形成一特殊的 MAPK 级联。这
是首次报道植物中可能有MAPK(mitogen-activated
protein kinase)级联。 Ichimura等[18]以ATMEKK1
为诱饵，用双杂交系统筛选得到 MAPKK 同源物
ATMKK2 和 MAPK 的同源物 ATMPK4, 以及一未
知蛋白。进一步分析这些蛋白质之间的相互作
用，发现 ATMPK4 与 ATMEKK1 的 N 末端的调
节域相互作用，而 ATMKK 2/ MEK 1 和 ATME KK 1
的C末端的激酶活性域相互作用，由此认为这3种
蛋白有可能在体内形成复合物。
4.2.2 植物发育调控基因的相关性 植物发育调控
基因的研究一直是植物科学中的研究热点，运用
不同的分子生物学手段和遗传方法，越来越多的
基因得到分离，双杂交技术可以用于研究这些基
因在生物功能上的相关性。目前这方面的应用还
不是太多。Spillane等[28]在研究拟南芥生殖发育时
期调控细胞增殖的polycomb group蛋白FIE基因家
族中，发现其与 MEA(编码动物 Pc-G 蛋白基因的
同源基因)产物可以相互作用。
4.2.3 多蛋白复合体亚基间的联系 植物的很多生
物学功能是由一系列蛋白质复合体执行的，最典
型的例子就是执行能量转换的光合作用的运行，
如光能的吸收、传递和转换是由在类囊体膜上具
有一定分子排列方式及空间构象的膜脂蛋白复合体
完成的。其中催化 ATP 合成的 ATP 合酶(又称光
合磷酸化反应耦联因子)具有CF0和CF1两个部分共
9 种亚基，每种亚基均行使其特有功能。研究高
等植物 ATP 合酶各亚基间的相互作用对完善结构
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和调节酶的功能有重要意义。石晓冰等[29,30]用双
杂交系统检测菠菜叶绿体 ATP 合成酶 CF1 各亚基
(abged)间相互作用的结果表明：a与 b、a与 e、
b与 d亚基间有稳定的相互作用；g和 e的相互作
用较强；g与 d、d与 e间有微弱的或短暂的相互
作用；a 与 g、a 与 d、b 与 g 等亚基在酵母系统
中无相互作用。由此,他们认为高等植物叶绿体
CF1d亚基的高级结构，以及 d亚基在 ATP 合酶上
的空间位置可能与细菌 A T P 合酶有所不同。此
外，他们还检测了叶绿体 ATP 合酶 CF1 与 CF0 亚
基间的相互作用。这些结果有助于研究 ATP 合酶
在催化过程中的结构变化和亚基间的相互关系。
4.3 确定蛋白质之间相互作用的特定区域 在分子
水平上有时候需要确定蛋白质相互作用所必需的结
构域，这对基因工程和分析突变原因相当必要。
长期以来，人们多选用分子生物学手段构建多个
嵌套缺失突变体(overlapping deletion mutants)，然
后再将其导入生物体表达，最后用免疫沉淀等方
法检测，或者用体外标记结合免疫沉淀。这些方
法费时、费力，在植物研究中除了模式植物拟南
芥转基因方法比较成熟外，多数还受到基因转化
效率的限制。酵母双杂交系统可以快速、方便地
解决这一问题。但目前这方面的应用还刚刚起
步。Ehrhardt等[31]筛选到2个特异的植物K+in通道
蛋白 SKT2 和 SKT3，用此方法证明它们之间通过
C 末端相互作用，该末端包含一保守区域。
5 结束语
酵母双杂交技术创立至今的十几年中，在基
因和蛋白质研究中已得到广泛应用，并取得了许
多有价值的结果。除了在酵母中应用外，此项技
术已扩展到哺乳动物和植物细胞的研究中[9]。用
酵母双杂交技术鉴定的多种受体、转录因子、蛋
白激酶、磷酸化酶、肿瘤发生蛋白、细胞骨架
蛋白以及参与细胞周期调控的因子不胜枚举[32]。
但从总体来说，此项技术在免疫、细胞、动物、
医学等领域中的应用明显多于植物，国内在这方
面的研究尤为欠缺。迄今,人们对植物生长、发育
和植物的一系列生理过程及机制，还有许多问题
不很清楚，如花形态建成中的基因控制、营养生
长的基因控制、生化代谢合成的基因调控等。尽
管目前已经建立了各种克隆新基因的技术[33]，克
隆了许多与植物生长发育过程相关的基因，但酵
母双杂交技术无疑会推动这些问题的研究。这一
技术的最大优点是只需对细胞内环境蛋白——蛋白
之间的相互作用进行分析，不必像传统生化方法
那样花费大量精力去纯化蛋白。相信今后借助此
种系统，可以圆满而有成效地解决植物生命活动
中的许多难题。
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