全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月710
甜菜胞质型谷氨酰胺合成酶基因组DNA的克隆
康传红 1, 王淑春 1, 陈胜勇 2, 李彩凤 2,*
1黑龙江大学生命科学学院, 哈尔滨 150080; 2东北农业大学农学院, 哈尔滨 150030
提要: 以甜菜叶片为材料, 用CTAB法提取基因组DNA。以分段PCR法扩增得到了完整的甜菜胞质型谷氨酰胺合成酶(GS1)
基因组DNA。采用RT-PCR法扩增此GS1基因(GS1)的 cDNA序列应用于对照。获得了长度为9 606 bp的完整的GS1 DNA
序列和长度为 1 068 bp的GS1 cDNA序列。分析GS1基因组DNA序列表明, 它包含 13个外显子, 被 12个内含子分隔开。
其外显子区与已公布的GS1 mRNA序列的相似性达 99.5%。RT-PCR法获得的 cDNA序列与已知的GS1 mRNA序列相似
性达99.6%。而2次实验中GS1基因组DNA外显子区与GS1 cDNA序列的相似性达99.9%。GenBank登录号为EU370974。
关键词: 甜菜; 谷氨酰胺合成酶; 基因克隆
Genomic DNA Cloning of Cytosolic Glutamine Synthetase from Sugar Beet
(Beta vulgaris L.)
KANG Chuan-Hong1, WANG Shu-Chun1, CHEN Sheng-Yong2, LI Cai-Feng2,*
1College of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China; 2College of Agriculture, Northeast Agricultural University,
Harbin 150030, China
Abstract: Genomic DNA was extracted from sugar beet leaves by CTAB method in this paper. Cytosolic
glutamine synthetase (GS1) genomic DNA was cloned by subsection PCR method, and the full-length GS1 gene
sequence was successfully obtained. The partial GS1 cDNA sequence was obtained by RT-PCR method and
compared to GS1 gene. The full length of GS1 genomic DNA was 9 606 bp, including 13 exons which were
separated by 12 introns. The sequence similarity between exon parts of GS1 genomic DNA and the known GS1
mRNA was 99.5%. GS1 cDNA sequence was 1 068 bp, and the sequence similarity between this GS1 cDNA and
the known GS1 mRNA was 99.6%. Meanwhile, the sequence similarity between exon parts of GS1 genomic
DNA and GS1 cDNA cloned in the experiment was 99.9%. The gene accession number in GenBank was EU370974.
Key words: sugar beet (Beta vulgaris); glutamine synthetase; gene cloning
收稿 2008-04-30 修定 2008-05-28
资助 国家自然科学基金(30471017, 30771276)和黑龙江省博
士后科研启动基金(BSH-Q06103)。
* 通讯作者(E-mail: l icaifeng1965@yahoo.com.cn; Tel:
0 45 1-55 1 90 85 4)。
在植物生长发育过程中, 氮素同化之重要已不
言而喻。其中, 无机氮必须同化为谷氨酰胺和谷氨
酸等有机氮化合物才能为植物体利用。谷氨酰胺
合成酶(glutamine synthetase, EC6.3.1.2, GS)是参与
这一氨同化过程的关键酶之一(Gebhardt等 1986;
李常健等2000, 2001; 韩娜等2004), 在ATP供能的
情况下, 它催化NH4+同化成谷氨酰胺。后者又在
谷氨酸合酶(GOGAT)的催化下, 将其酰胺转移到α-
酮戊二酸上, 生成 2个分子的谷氨酸。生物化学和
遗传学研究表明, GS和GOGAT构成的循环反应是
正常条件下高等植物氨同化的主要途径。
在甜菜中存在2种类型的GS, 即胞质型的GS1
和叶绿体型的GS2。前者主要同化内源性蛋白质
降解和氨基酸分解代谢产生的氨, 并可能在氮素的
转运中起作用(Lam等 1996; 袁永泽等 2002)。后
者则同化NO3-经硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶
催化产生的氨以及光呼吸作用产生的氨的再同化
(Wallsgrove等 1987)。甜菜GS基因的表达既有组
织器官专一性, 又受环境和发育因子的影响, 因此
弄清楚甜菜这一特定作物中GS基因的编码区, 就
可以为进一步分离此基因的调控区建立基础。本
文用分段 PCR法研究了甜菜GS1的DNA序列, 以
期能为此基因的表达和调控以及为实现甜菜高同化
氨基因操作提供分子生物学的解释和参考。
材料与方法
植物材料为甜菜(Beta vulgaris L.)中标准偏高
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糖型二倍体的品种 ‘甜研 7号 ’。大肠杆菌DH5α
感受态细胞购自北京天根公司, pMD19-T载体为
TaKaRa公司产品。酶和试剂盒以及 TaKaRa Ex
Taq、PrimeSTARTM HS DNA聚合酶、TaKaRa 琼
脂凝胶DNA Purification Kit Ver. 2.0、TaKaRa DNA
A-Tailing Kit、TaKaRa RNA LA PCRTM Kit (AMV)
Ver. 1.1均购自 TaKaRa公司。
根据GenBank上已知的甜菜GS1 mRNA序列
(登录号: AF343667), 用 Primer Premier 5.0 引物设
计软件设计引物, 引物设计如图 1。
引物由上海生工公司合成，如下。
(1) GS1 DNA分段克隆引物为PF1: 5 ATG GCT
CTT CTT AAC GAT CT 3 20 bp; PR239: 5 TCC
TTG AAA ATA GCC TGA 3 18 bp; PF3254: 5 CAA
CAG CCC TCA GGC TAT 3 18 bp; PR3496: 5 TAA
TGC CAA GTG CCA ACG 3 18 bp; PF334: 5 AAA
ATC TTC AGC CAC CCA 3 18 bp; PR855: 5 CCC
GTA GGC AGC AAT GTG 3 18 bp; PF818: 5 TGA
GTC TCC GTC ACA AGG 3 18 bp; PR1071: 5 TCA
AGG CTT TCC GAG GAT 3 18 bp; PF88: 5 GGG
TTG GAT ATG AGA AGC 3 18 bp; PR1062: 5 TCC
GAG GAT AGT TGT TTC AG 3 20 bp。
(2) GS1 mRNA的RT-PCR引物为PF1: 5 ATG
GCT CTT CTT AAC GAT CT 3 20 bp; PR1068: 5
AGG CTT TCC GAG GAT AGT TGT TTC A 3 25
bp。
用CTAB法从甜菜叶片中提取基因组DNA (康
传红等 2002)。
目的片段 1用 TaKaRa Ex Taq酶进行 PCR扩
增, 实验过程中对PCR反应体系的4个组分(Mg2+、
dNTPs、引物浓度和酶的用量)进行四因素三水平
的正交优化, 最终确定的反应体系见表 1。反应条
件为: 预变性94 ℃ 5 min; 变性94 ℃ 30 s, 退火57 ℃
1 min, 延伸 72℃ 5 min, 循环数为 30个, 72 ℃ 10
mi n。
目的片段 2、3和 4的 PCR扩增用高保真酶
PrimeSTARTM HS DNA 聚合酶进行PCR扩增, 反应
体系按酶的说明书进行, 各对引物的反应条件为: 引
物对为 PF1和PR239时, 变性98 ℃ 10 s, 退火56 ℃
15 s, 延伸 72 ℃ 3 min, 循环数 30个, 72 ℃ 10 min;
引物对为 PF818和 PR1071时, 变性 98 ℃ 10 s, 退
火 56 ℃ 15 s, 延伸 72 ℃ 1 min, 循环数 30个, 72℃
10 min; 引物对为 PF3254和 PR3496时, 变性 98 ℃
10 s, 退火55 ℃ 15 s, 延伸72℃ 3 min, 循环数30个,
72 ℃ 10 min。
目的片段的胶回收按TaKaRa胶回收试剂盒进
行。
平末端DNA片段的加A反应由于PCR过程中
表 1 PCR反应体系
Table 1 PCR reaction system
PCR组分 体积 /µL
10×Ex Taq缓冲液 5
Mg2+ (25 mmol·L-1) 5
dNTP混合液(各 2.5 mmol·L-1) 6
模板DNA (123.9 ng·µL-1) 0.7
PF334 (20 µmol·L-1) 0.5
PR855 (20 µmol·L-1) 0.5
TaKaRa Ex Taq (5 U·µL-1) 0.4
双蒸水 31.9
总体积 5 0
图 1引物设计示意图
Fig.1 Primer design
横线代表甜菜 GS1 mRNA全长序列, 引物的编号是引物 5 端在 GS1 mRNA序列中的位置, 箭头表示扩增方向。
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使用了高保真酶PrimeSTARTM HS DNA 聚合酶, 以
致目的片段 2、3、4几乎都为平滑末端, 在将这
些目的片段克隆到T载体之前, 要对其进行3末端
加A反应。具体操作按TaKaRa DNA A-Tailing Kit
说明书进行。
A 末端DNA片段的连接和转化时, 将目的片
段 1及 A末端的目的片段 2、3、4与 pMD19-T
载体连接, 转化大肠杆菌感受态细胞DH5α, 通过
蓝白筛选选择阳性菌落。具体操作按说明书进
行。
阳性克隆子的PCR验证时, 在蓝白平板上随机
选择几个白斑, 转接到 1 mL LB+Amp液体培养基
中, 37 ℃ 180 r·min-1过夜摇菌, 进行菌液 PCR。反
应体系按 PrimeSTARTM HS DNA 聚合酶说明书进
行, 使用了载体上的通用引物, 退火温度为 68 ℃。
选择阳性克隆子去测序。
甜菜总RNA的提取采用Trizol试剂, 操作按说
明书进行。
RT-PCR反应按TaKaRa RNA LA PCRTM Kit说
明书进行。引物对为 PF1和 PR1068, 退火温度为
51 ℃。按照上述方法将目的片段进行克隆和验
证。
结果与讨论
1 GS1 DNA基因的PCR扩增
根据GenBank上已知的甜菜GS1 mRNA序列
(登录号: AF343667)设计引物, 经引物对 PF334和
PR855 PCR扩增得到大于 5 kb的DNA片段(图 2),
图 2 引物对 PF334和 PR855的 PCR扩增
Fig.2 PCR of PF334 and PR855
M: 1.5 kb DNA分子量; 1: PCR扩增产物。
图 3 引物对 PF1和 PR239的 PCR扩增
Fig.3 PCR of PF1 and PR239
M1: 1.5 kb DNA分子量; M2: DL2000分子量; 1: PCR扩增
产 物 。
测序结果显示此目的片段长度为 5 201 bp。经引
物对PF1和PR239 PCR扩增得到大于3 kb的DNA
片段(图 3), 测序结果显示此目的片段长度为 3 280
bp。经引物对 PF818和 PR1071 PCR扩增得到大
于800 bp的DNA片段(图4), 测序结果显示此目的
片段长度为 817 bp。经引物对 PF3254和 PR3496
PCR扩增得到大于500 bp的DNA片段(图5), 测序
结果显示此目的片段长度为 589 bp。
图 4 引物对 PF818和 PR1071的 PCR扩增
Fig.4 PCR of PF818 and PR1071
M: DL2000 分子量; 1、2: PCR 扩增产物。
2 GS1 DNA扩增片段的阳性克隆子的PCR验证
经引物对 PF334和 PR855、PF1和 PR239、
PF818和 PR1071、PF3254和 PR3496的 PCR法验
证阳性克隆子的结果分别如图 6~9所示。
3 GS1 DNA的序列拼接
采用分段克隆的方法获得的4段DNA序列均
为目的片段(序列拼接资料未列出)。经过拼接得
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图 9 PF3254和 PR3496的转化
Fig.9 Transformation of PF3254 and PR3496
M: DL2000分子量; 1~5: 目的 PCR扩增产物。
图 10 RT-PCR的电泳图谱
Fig.10 Electrophoretogram of RT-PCR
M1: 1.5 kb DNA分子量; M2: DL2000分子量; 1、2: PCR
扩增产物。
图 5 引物对 PF3254和 PR3496的 PCR扩增
Fig.5 PCR of PF3254 and PR3496
M: DL2000分子量; 1 : PCR扩增产物。
图 6 PF334和 PR855的转化
Fig.6 Transformation of PF334 and PR855
M: 1 .5 kb DNA分子量; 1、2: 目的 PCR扩增产物。
图 7 PF1和 PR239的转化
Fig.7 Transformation of PF1 and PR239
M: 1.5 kb DNA分子量; 1~5: 目的 PCR扩增产物。
到全长GS1基因组DNA, 长度为 9 606 bp, 与已知
GS1 mRNA序列比对分析的结果表明, 其包含13个
外显子和 12个内含子, 外显子与内含子的边界为
GT和 AG。最大的内含子为第 5个内含子, 长度
为3 760 bp; 次大的内含子是第3个内含子, 长度为
图 8 PF818和 PR1071的转化
Fig.8 Transformation of PF818 and PR1071
M: DL2000分子量; 1~4: 目的 PCR扩增产物。
2 739 bp; 最小的内含子为第 11个内含子, 长度为
83 bp; 其余的内含子长度在 103~482 bp之间。外
显子区与已公布的GS1 mRNA序列相似性达 99.5%,
2个序列只有 5个碱基差异。
4 GS1 cDNA的RT-PCR和PCR验证
经引物对PF1和PR1068反转录PCR扩增得到
大于 1 000 bp的DNA片段(图 10), 测序结果显示
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图 11 PF1和 PR1068的转化
Fig.11 Transformation of PF1 and PR1068
M: DL2000分子量; 1~5: 目的 PCR扩增产物。
此目的片段长度为 1 068 bp。阳性克隆子的 PCR
验证结果如图 11 (测序资料未列出)。GS1 cDNA
片段与已公布的GS1 mRNA序列相似性达 99.6%,
两者只有 4个碱基的差异。
RT-PCR法得到的GS1 cDNA序列测序结果与
已克隆到的GS1 DNA序列的外显子区的相似性为
99.9%, 二者只有 1个碱基的差异。
综上所述, 可以得到以下几点认识。
(1)本文以甜菜为试材, 从叶片中提取基因组
DNA, 并以此为模板, 根据GenBank上的已登录的
甜菜GS1 mRNA序列设计引物, 进行 PCR扩增。
由于GS基因DNA序列未知, 无法估计它的限制性
内切酶位点, 故将 PCR产物克隆到 T载体中。为
了使获得的基因序列更具可信度, 在 PCR时, 采用
了高保真酶(TaKaRa Ex Taq), 这是一种热启动酶,
PCR的结果更可靠。
(2)在预备试验时, 我们感到PF88和PR1062引
物对偶尔能扩增出大于 9 kb的条带。因此设想欲
克隆的GS1 DNA片段可能很大, 很难一步扩增出
全长, 于是采取了分段克隆的方法。经过多次的
PCR反应体系的摸索, 结果克隆到了约5 kb的片段,
然后在此基础上设计引物, 克隆基因的其它部分。
最后将所得的4个片段拼接成全长基因序列, 最终
获得长度为 9 606 bp的完整GS1 DNA序列。
(3)迄今, 许多植物的GS1基因已得到克隆, 序
列信息在GenBank数据库中可以查到, 但大多数序
列信息都是 cDNA, 基因组序列的信息很少。经过
拼接得到的全长 G S1 基因组 D NA 与已知 GS 1
mRNA的序列比对分析得知, 它包含13个外显子和
12个内含子。这与 Thykjaer等(1997)认为的植物
GS基因的保守模式是12个外显子被11个内含子分
开有差异, 可见甜菜有自身的 GS基因保守模式。
GS1基因组DNA外显子和内含子的边界为GT和
AG, 这与通常认为的植物基因中内含子的边界(韩
娜等 2004)一致。
(4)本文中采用RT-PCR方法获得长度为1 068
bp的GS1 cDNA片段, 与已公布的GS1 mRNA序
列虽然有4个碱基的差异(两者相似性达99.6%), 但
由此GS1 cDNA推导出的氨基酸序列与已知GS1
mRNA翻译得到的氨基酸序列完全一致, 可见GS1
的氨基酸序列是非常保守和稳定的。用 RT-PCR
法得到的GS1 cDNA序列测序结果与已克隆的GS1
DNA序列外显子区的相似性为 99.9%, 二者只有 1
个碱基的差异, 说明 2次实验的结果一致而可靠。
参考文献
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