全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月 1131
秋水仙素诱导新疆一枝蒿多倍体
唐晓义 1,2, 王晓军 1,*, 郝秀英 3, 刘敏 1, 康喜亮 1, 波拉提 1, 徐琴 1
1中国科学院新疆理化技术研究所, 乌鲁木齐 830011; 2中国科学院研究生院, 北京 100049; 3新疆农业科学院微生物应用研
究所, 乌鲁木齐 830091
提要: 以茎段浸泡法和培养基培养法诱导新疆一枝蒿多倍体的结果表明, 茎段浸泡法的诱导效果比较好, 其中以0.2%秋水
仙素浸泡茎段1 d的处理效果最好, 多倍体诱导率达27.3%。
关键词: 秋水仙素; 新疆一枝蒿; 多倍体
Polyploid Induction of Artemisia rupestris L. by Colchicine
TANG Xiao-Yi1,2, WANG Xiao-Jun1,*, HAO Xiu-Ying3, LIU Min1, KANG Xi-Liang1, BO La-Ti1, XU Qin1
1Xinjiang Technical Institute of Physics & Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, China; 2Graduate University
of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3Institute of Microbiology, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences,
Urumqi 830091, China
Abstract: Polyploids were induced from Artemisia rupestris L. by two methods, soaking shoot segments in
colchicine solution and adding colchicine in the culture medium, respectively. The results showed that the
soaking-treatment increased the efficiency of polyploids induction than the other methods. As to method of
soaking-treatment, the optimal condition of treatment was 0.2% colchicine for 1 d and the induction rate of
polyploid reached 27.3%.
Key words: colchicine; Artemisia rupestris L.; polyploid
收稿 2008-10-13 修定 2008-10-28
资助 中国科学院西部行动项目。
* 通讯作者(E-mail: wangxj@ms.xjb.ac.cn; Tel: 0991-
3 8 3 8 2 1 3 )。
药用植物多倍体植株由于染色体的加倍, 通常
具有较高含量的药用成分和器官增大等特点, 同时
多倍体植株的生态适应性及对逆境的抗耐性增强。
虽然多倍体植株普遍具有育性下降的特点, 这对于
以收获籽粒为目的的农作物来说是个致命的缺点,
但对于全草类、根茎类、叶类和花类的中药植物
来说影响不大。因此, 药用植物多倍体育种有广阔
的应用前景(彭卫欣和谢晓良 2002)。新疆一枝蒿
属菊科蒿属, 新疆维吾尔族人民常用药材, 多年生,
高 20~50 cm, 气味芳香, 味微苦。药用全草, 具有
活血、抗过敏、清热解毒、消食健胃、镇静镇
吐等功能, 主要用于治疗各种感冒、急慢性扁桃体
炎、荨麻疹、消化不良、胃疼胃胀、跌打红肿、
慢性肾炎和钩端螺旋体病等, 对感冒和肝炎的疗效
更为显著(尹林克 2006)。为适应生产的需要, 我们
在离体条件下进行新疆一枝蒿的多倍体诱导, 以期
提高新疆一枝蒿的品质。
材料与方法
新疆一枝蒿(Artemisia rupestris L.)由新疆西域
药业有限公司新疆一枝蒿生产基地提供, 为当地大
面积栽培的优质品种之一。
切除新疆一枝蒿无菌苗的叶片和根, 剩下的茎
段切成约 1.5 cm长度, 接种到新疆一枝蒿的芽增
殖培养基(MS+6-BA 1 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1)上
启动侧芽的萌发(唐晓义等 2008)。培养温度为
23~25 ℃, 光照强度为 40 µmo1·m-2·s-1, 光照时间为
16 h·d-1, 3~5 d后接种的茎段外植体侧芽部位可见
绿色的点状突起。
多倍体诱导采用茎段浸泡法和培养基培养法
两种方法(表 1)。前者是将已培养的 3~5 d的茎段
分别浸泡在经高压灭菌的浓度分别是 0、0.05%、
0.1%、0.2%秋水仙素水溶液中, 分别在转速为 50
r·min-1的摇床上震荡 0.5、1、2、3 d; 后者是将
已培养的 3~5 d的茎段分别接种到含 0、0.01%、
0.02%、0.05%的经高压灭菌的秋水仙素的MS+6-
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BA 1 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1培养基中, 处理时间
为 10、20、30 d。以上秋水仙素溶液均含 2%二
甲基亚砜(DMSO)。处理后, 茎段再用无菌水冲洗
3次, 用于茎段浸泡法中的茎段接种在MS+6-BA 1
mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1培养基上, 而用于培养基
培养法中的茎段接种在MS培养基上, 分别培养60
d后将长大的侧芽切下, 转接到MS培养基中诱导
生根。最初以叶片的大小、颜色与厚度作出多倍
体的初步判断, 芽伸长至 2~3 cm时, 切取茎尖检测
染色体倍性, 生根后取根尖复检。
多倍体鉴定分以下 3个方面。(1)植株形态学
观察。主要根据叶色、叶厚、茎粗壮、根粗等
进行比较。(2)染色体数目观察。切取再生植株幼
嫩的根尖 4~6 mm或茎尖; 于 4 ℃条件下用 0.002
mol·L-1的 8-羟基喹啉溶液预处理 4 h; 于 4 ℃条件
下用卡诺固定液(95%乙醇:冰醋酸体积比=3:1)固定
24 h; 弃去固定液, 根尖置于 60 ℃水浴锅中用 1
mol·L-1的盐酸水解9 min; 冲洗干净解离液, 用改良
苯酚品红溶液染色 20 min; 压片, 以Olympus显微
镜观察并拍照。(3)观察叶片气孔。气孔大小和密
表 1 茎段浸泡法和培养基培养法中不同秋水仙素浓度和处理时间对外植体存活率、芽增殖率和多倍体诱导率的影响
Table 1 Effects of different concentrations of colchicine and different treatment duration on the survival rate of explants, multipli-
cation rate of shoots and polyploids induction rate by soaking shoot segments in the methods of colchicine solution and adding
colchicine in the culture medium
诱导方法 秋水仙素浓度 /% 处理时间 /d 外植体数 /个 外植体存活数 /个 增殖的芽数 /个 多倍体数 a/个 多倍体诱导率 b/%
茎段浸泡法 0 0.5 1 1 8 (72.7)c 48 (4.4)d 0 0
1 1 0 9 (90.0) 43 (4.3) 0 0
2 1 0 10 (100.0) 42 (4.2) 0 0
3 1 1 8 (72.7) 46 (4.2) 0 0
0.05 0.5 1 0 8 (80.0) 25 (2.5) 0 0
1 1 2 7 (58.3) 21 (1.8) 1 4.8
2 1 0 4 (40.0) 17 (1.7) 1 5.9
3 1 0 3 (30.0) 1 (0.1) 0 0
0.1 0.5 1 0 6 (60.0) 22 (2.2) 2 9.1
1 1 3 7 (53.8) 18 (1.4) 1 5.6
2 1 0 5 (50.0) 13 (1.3) 1 7.7
3 1 0 3 (30.0) 9 (0.9) 0 0
0.2 0.5 1 1 5 (45.5) 15 (1.4) 3 20.0
1 1 0 4 (40.0) 11 (1.1) 3 27.3
2 1 0 4 (40.0) 6 (0.6) 1 16.7
3 1 1 2 (18.2) 8 (0.7) 0 0
总数 169 93 (55.0) 345 (2.0) 1 3 3.8
培养基培养法 0 1 0 1 0 8 (80.0) 43 (4.3) 0 0
2 0 1 0 8 (80.0) 33 (3.3) 0 0
3 0 1 0 10 (100.0) 28 (2.8) 0 0
0.01 1 0 1 0 8 (80.0) 40 (4.0) 0 0
2 0 1 0 7 (70.0) 20 (2.0) 0 0
3 0 1 3 12 (92.3) 20 (1.5) 0 0
0.02 1 0 1 0 10 (100.0) 30 (3.0) 0 0
2 0 1 0 7 (70.0) 19 (1.9) 1 5.3
3 0 1 2 12 (100.0) 19 (1.2) 0 0
0.05 1 0 1 0 10 (100.0) 25 (2.5) 2 8.0
2 0 1 0 9 (90.0) 14 (1.4) 0 0
3 0 1 5 14 (93.3) 22 (1.5) 1 4.5
总数 130 115 (88.5) 313 (2.4) 4 3.1
　　a参照匡全等(2004)文中的方法, 凡检测的诱导苗根尖或茎尖分裂细胞中 1/2或以上细胞为多倍体就认为该植株是多倍体; b诱导
率 =多倍体数 /增殖的芽数; c括弧中的数据是外植体存活率(外植体存活数 /外植体数); d括弧中的数据是芽增殖率(增殖的芽数 /外植
体数 ) 。
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度的测量采用透明胶带法(陈佰鸿等 2004)。具体
操作是: 取同一位置和大小相近的二倍体和四倍体
试管苗叶片, 将叶片正面粘在胶带上, 再将胶带对
折过来平整地粘贴在叶片的背面。然后用手指对
捏胶带, 使胶带与叶片的两面充分粘着。将对折的
胶带撕开, 叶片的下表皮便粘贴在胶带上, 再将带
叶片下表皮的胶带沿表皮轮廓剪成 3~5 mm×3~5
mm的矩形片, 在载玻片上滴 2滴蒸馏水, 盖上盖
玻片, 压平后置于高倍显微镜下, 用标定好的目镜
测微尺测量气孔的长度和宽度。共测量 100个气
孔并随机统计 20 个视野里的气孔数量, 数据用
SPSS软件分析, 结果以 “平均数 ±标准误(SE)”表
示。
结果与讨论
1 不同浓度秋水仙素和不同处理时间对新疆一枝
蒿的诱导效应
从表1可以看出, 秋水仙素浓度和处理时间对
新疆一枝蒿茎段的存活率、芽增殖数和诱导率的
影响有一定的差异。总的来说, 在茎段浸泡法中,
高浓度秋水仙素和长时间处理的外植体存活率下
降, 尤其是 0.2%的秋水仙素浸 3 d的处理在接种
后 60 d的外植体存活率仅为 18.2%。在培养基培
养法中, 秋水仙素对外植体的毒害作用没有茎段浸
泡法的剧烈, 外植体的存活率在 70%~100%。在
茎段浸泡法和培养基培养法中, 秋水仙素处理的芽
增殖率都低于未用秋水仙素处理的, 而且在相同浓
度水平上, 秋水仙素处理的芽增殖率基本上都随着
处理时间的增加而呈降低趋势。显然外植体存活
率和芽增殖率的下降均是由于秋水仙素的渗透作用
影响到分生组织细胞的正常分裂而引起的。此外,
茎段浸泡法的最高诱导率是在0.2%的秋水仙素处
理茎段 1 d, 诱导率可达 27.3%。在培养基培养法
中, 0.05%的秋水仙素处理茎段10 d可达最高诱导
率, 诱导率为 8.0%。表明茎段浸泡法比培养基培
养法诱导新疆一枝蒿多倍体效果更好, 这可能是高
浓度的秋水仙素溶液在摇床中与茎段接触更充分,
进而更容易渗入到生长点的各层细胞, 从而提高多
倍体诱导率。
我们观察诱导得到的多倍体植株染色体的结
果表明, 一部分为四倍体(2n=4x=36) (图 1-b), 多数
为二倍体(2n=2x=18) (图 1-a) (Kawatani和 Ohno
1964)和四倍体组成的混倍体。与二倍体植株(图
2-a、c、e)相比, 多倍体植株的叶片大而厚, 叶色
深绿, 叶片上偶有皱缩, 茎粗壮、节间距短和根粗
图 2 二倍体与四倍体新疆一枝蒿的形态学比较
Fig.2 The morphology comparison between diploid and
tetraploid Artemisia rupestris L.
a: 二倍体植株; b: 四倍体植株; c: 二倍体植株茎; d: 四倍体植
株茎; e: 二倍体植株根; f: 四倍体植株根。图中的标尺长度均为
1 c m。
图 1 新疆一枝蒿二倍体与四倍体的染色体数目(10×100)
Fig.1 The chromosome numbers in diploid and tetraploid
Artemisia rupestris L. (10×100)
a: 二倍体染色体数目(2 n=2 x=18 ); b : 四倍体染色体数目
(2 n=4 x=36 )。图中的标尺长度均为 5 µm。
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图 3 新疆一枝蒿二倍体与四倍体的气孔比较(10×40)
Fig.3 The comparison of stomata morphology between
diploid and tetraploid Artemisia rupestris L. (10×40)
a: 二倍体气孔; b: 四倍体气孔。图中的标尺长度均为 25 µm。
(图 2- b、d、f)。这与胡秀等(2004)在金鱼草、
郑思乡等(2004)在东方百合和张志胜等(2007)在红
掌上的研究结果一致。
2 二倍体与四倍体新疆一枝蒿叶片气孔特征比较
由茎段再生出的二倍体和四倍体植株的叶片
气孔参数有显著差异性。总的来说, 四倍体的叶片
上气孔的长轴和短轴均显著大于二倍体的(表 2、
图3), 四倍体的叶片气孔密度显著低于二倍体 的(表
2)。此外, 分析气孔大小、气孔密度和倍性间的
相关性的结果表明, 气孔大小的增大可能直接和倍
性水平的增加相关, 二者间呈极显著的正相关, 长
轴和倍性间以及短轴和倍性间的相关系数分别为
0.938和 0.909。而气孔密度和倍性水平呈极显著
的负相关, 相关系数为-0.607, 这显示气孔密度的
下降可能是倍性水平的增加引起的。这与张志胜
等(2007)在红掌、Yang等(2006)在葡萄(Vitis vin-
ifera L.)、Carvalho等(2005)在胭脂树(Bixa orellana
L.)、Thao等(2003)在海芋(Alocasia)、Kadota和
Niimi (2002)在日本梨栽培品种(Pyrus pyrifolia N.
cv. Hosui)上的研究结果一致。在这些文献中气孔
大小经常作为一个指标用于鉴定植物的倍性水平。
Masterson (1994)曾指出如果倍性和气孔参数间的
极显著相关性得到证实, 这些气孔参数信息可作为
倍性水平改变的一个强而有力的指标, 说明通过检
测气孔的大小和密度鉴定新疆一枝蒿多倍体是可行
的。
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表 2 由离体培养茎段再生的二倍体和
四倍体植株的气孔特征
Table 2 Stomata characteristics of diploid and tetraploid
plantlets regenerated from shoot segments in vitro culture
倍性 气孔长度 /µm 气孔宽度 /µm 气孔密度 /个 ·mm-2
二倍体 22.8±0.2a 19.4±0.2a 120.5±5.7a
四倍体 34.7±0.2b 29.6±0.2b 84.3±4.8b
　　a、b表示用 Fisher检测的结果呈显著性差异; 气孔密度(个 ·
mm-2)= 各视野中气孔个数(个)/视野的真实面积(mm2)。