全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 769
不同形态氮素对水稻叶中抗坏血酸氧化还原势和气孔运动的影响
刘拥海 1，蒋林蓉 2，俞乐 1，彭新湘 2,*
1肇庆学院生物系，广东肇庆 526061；2华南农业大学生命科学学院，广州 510642
Influences of Different Forms of Nitrogen Nutrients on the Ascorbic Acid Re-
dox Potential and Stomatal Movement of Rice (Oryza sativa L.) Leaves
LIU Yong-Hai1, JIANG Lin-Rong2, YU Le1, PENG Xin-Xiang2,*
1Department of Biology, Zhaoqing College, Zhaoqing, Guangdong 526061, China; 2College of Life Sciences, South China Agricul-
tural University, Guangzhou 510642, China
提要：硝态氮下培养的水稻叶中还原型抗坏血酸(AsA)含量明显高于氨态氮下的，并随着培养时间进程而明显升高，氨
态氮下的随着时间进程呈稍有下降趋势；硝态氮下氧化型AsA和总AsA含量虽高于氨态氮下的，但在前2 d二者差异不
明显，至 3 d时差异才显著。硝态氮下的AsA氧化还原势和气孔导度均显著高于氨态氮下的，二者的变化趋势相似，并
呈现明显的平行关系。
关键词：水稻；抗坏血酸(AsA)氧化还原势；气孔导度
收稿 2007-04-19 修定 2007-06-15
资助 国家自然科学基金(30 2 70 7 9 9)。
* 通讯作者(E-mai l：xpeng@scau .edu.cn；Tel：02 0-
8 5 2 8 2 0 2 3 )。
硝态氮和氨态氮是高等植物的主要无机氮
源，植物一般通过根系从土壤中吸收氮素，硝态
氮吸收后需经还原成氨态氮时才能被植物利用。
现在只有水稻等少数高等植物对以氨态氮为唯一氮
源时的敏感性不大，而大多数高等植物表现出铵
毒害症状，导致生长受抑(Magalhäes和 Huber
1989；刘永华等 2004)。有研究表明，内源硝态
氮除了作为主要氮源外，还可作为一种潜在的信
号物质(Foyer等 2003；王玉琪等 2006)。另外，
有报道指出，硝酸通过硝酸还原酶催化形成的亚
硝酸有可能通过亚硝酸还原酶催化或非酶促反应产
生一氧化氮(nitric oxide，NO)而可能影响植物叶
的气孔运动(Bethke等 2004；Guo等 2003)。还有
研究显示，植物叶中抗坏血酸(a scorbic acid，
AsA)氧化还原势可能直接影响活性氧H2O2分子的
积累与转化而调控其气孔运动( S c h r o e d e r 等
2001；Chen等 2003)。气孔是植物与外界环境气
体交换的门户，其开放是植物的重要生命活动之
一。迄今为止，尚未见有研究硝态氮或氨态氮为
唯一氮源时植物叶中气孔开放和AsA氧化还原势
变化的报道。本文以水稻为材料，在含不同氮素
形态的木村 B营养液培养 3 d后，分别测定叶中
不同类型 AsA 含量以及叶片气孔导度的动态变
化，探讨不同形态氮素对水稻叶中AsA氧化还原
势和气孔运动的影响。
材料与方法
材料为水稻(Oryza sativa L.)品种‘湘中汕 2
号’，由湖南省农业科学院水稻研究所提供。挑
选饱满的水稻种子，以 0.1%的HgCl2表面消毒 10
min后，用蒸馏水反复冲洗，于 28 ℃下以水浸种
24 h后，转入铺有 2层湿润滤纸的培养皿中，放
在 28 ℃恒温箱中催芽 2~3 d，期间注意保持湿
润。根长约 1 cm时，点播于尼龙网上，用木村
B营养液在玻璃温室中培养(昼间 28~32 ℃/夜间
23~26 ℃，自然光照，湿度 60%~80%)。水稻长
至三叶期，挑选长势一致的幼苗，移栽到体积为
4 L的培养盆中，继续用木村 B营养液(N为 1.65
mmol·L-1)培养 5 d左右，后转入 100% 氨态氮(将
营养液中的氮素全部换成NH4Cl或(NH4)2SO4，N
浓度为 3 mmol·L-1)营养液培养 2 d后，接着分别
转入100%氨态氮或100%硝态氮(将营养液中的氮
素全部换成KNO3、Ca(NO3)2或NaNO3，N浓度为3
mmol·L-1) 营养液中培养。每 3 d换一次营养液，
信息与资料 Imformation and Data
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营养液的 pH 为 5.0)，分别于 0、1、2、3 d随
机取相同叶位的样品测定各种生理生化指标。
AsA含量测定参考Kampfenkel等(1995)的Fe3+
还原法，略作改进。取 0.1 g水稻幼苗叶片，加
1 mL 6% (W/V)三氯乙酸(trichloroacetic acid，
TCA)于 4 ℃冰浴下研磨成匀浆，转移至 1.5 mL指
形管中，冷冻离心(15 000×g，5 min)后，取上
清液用于测定。1 mL反应体系中含 50 µL上清
液、150 µL 0.2 mol·L-1磷酸钠缓冲液(PBS，pH
7.4)、50 µL H2O、250 µL 10% TCA、200 µL
42% H3PO4、200 µL 4%联吡啶、100 µL 3%
FeCl3，混匀后放入 42 ℃水浴中保温 40 min，测
定波长 525 nm处的吸光值。总AsA与还原型AsA
的测定不同之处是在加 10% TCA之前，先加 50
µL 10 mmol·L-1二硫苏糖醇(1,4-dithio-DL-threitol，
DTT)，混匀后放入 42 ℃水浴中保温 15 min，再
加入 50 µL 0.5%的 N-乙基顺丁烯二酰亚胺(N-
ethylmaleimide，NEM)，混匀后于室温中放置 1
min。空白对照均用相同体积的 6% TCA替代上清
液。用同样方法制作标准曲线后，计算总AsA和
还原型AsA含量，脱氢AsA(即氧化型AsA)含量
即为二者之差。
水稻叶片的气孔导度用便携式光合测定仪(Li-
6400，Li-Cor Inc，Incoln NE，USA)测定。测
定于上午 9:00~11:00进行，测定时用人工光源，
光量子通亮密度为 800 µmol·m-2·s -1，叶室温度
(25±3) ℃，叶室气体流速为 500 mL·min-1。叶室
中充不含 CO2的氮气，重复测定 6次。
用 Excel 2003处理数据并作图，用统计分析
软件 SAS 6.12进行方差分析。除非特别说明者
外，文中图表数据均为 3 次取样的平均值。
结果与讨论
1 不同形态氮素下水稻叶中不同类型AsA含量的
变化
图 1~3的结果显示，不同形态氮素营养液培
养的水稻叶中各类型 AsA 含量的变化有明显差
异。硝态氮和氨态氮培养下的还原型AsA含量差
异显著，硝态氮下还原型AsA含量随着培养时间
进程而明显升高，氨态氮下的随着时间进程的变
化不大，总的来说，呈稍有下降趋势，至 3 d时
前者含量是后者的 2.7倍(图 1)。氧化型AsA含量
图 1 不同形态氮素下水稻叶中还原型AsA含量的变化
图 2 不同形态氮素下水稻叶中氧化型AsA含量的变化
图 3 不同形态氮素下水稻叶中总AsA含量的变化
在硝态氮和氨态氮培养下的差异较小，均随着培
养时间进程有较小变化，前者略有上升，后者稍
有下降，前 2 d二者差异较小，至 3 d时前者比
后者高出近 40%，差异显著(图 2)。硝态氮和氨
态氮培养的总AsA含量变化趋势与氧化型AsA基
本一致，前者略有上升，后者稍有下降，前 2 d
二者差异较小，至 3 d 时前者比后者高出约为
51%，差异显著(图 3)。一般认为还原型 AsA极
易氧化生成单脱氢 AsA 自由基，后者在单脱氢
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AsA还原酶作用下还原为还原型AsA，或者通过
发生非酶歧化反应生成还原型AsA和脱氢AsA即
氧化型AsA，而氧化型AsA通过AsA-谷胱甘肽代
谢途径(Halliwell-Asada循环)中脱氢AsA还原酶和
谷胱甘肽还原酶等作用还原为还原型AsA (Asada
1992)。根据这些说法，可以认为硝态氮和氨态
氮下培养的水稻叶中不同类型AsA的含量差异可
以反映不同形态氮素培养下的水稻叶中AsA代谢
的不同。
2 不同形态氮素下水稻叶中还原型 AsA/氧化型
AsA比值的变化
图 4表明，硝态氮和氨态氮下培养的水稻叶
中还原型AsA/氧化型AsA比值变化差异显著：硝
态氮下的还原型AsA/氧化型AsA的比值随着培养
时间进程一直持续上升；而氨态氮下培养的还原
型AsA/氧化型AsA的比值则基本上不变，2 d后
甚至略有下降。一般来说，还原型 AsA/氧化型
AsA比值的大小代表叶片细胞中氧化还原势的高
低，二者比值变化的差异可以反映不同形态氮素
下水稻叶中AsA氧化还原势的差异，而维持较高
AsA氧化还原势有助于提高植物的抗氧化能力。
Chen和Gallie (2004)的研究表明，H2O2积累水平
与AsA氧化还原势的高低呈明显负相关，因此他
们认为AsA可直接或间接通过AsA过氧化物酶的
作用清除积累的 H2O2。
3 不同形态氮素下水稻叶气孔导度的变化
图 5表明，硝态氮和氨态氮培养下的叶气孔
导度变化差异显著：硝态氮下的叶气孔导度随着
培养时间的进程有较明显的增加，而氨态氮下的
气孔导度则随着时间进程大幅度下降。硝态氮下
图 4 不同形态氮素下水稻叶中还原型
AsA/氧化型AsA比值的变化
的AsA氧化还原势和气孔导度均显著高于氨态氮
下的，二者有相似的变化趋势，并呈明显的平行
关系。硝态氮下叶中 AsA氧化还原势(即还原型
AsA/氧化型AsA的比值)在培养进程中持续上升，
与此对应的气孔导度也有较明显增加，这表明硝
态氮下叶气孔是持续开放的；而氨态氮下叶中
AsA氧化还原势在培养进程中基本上保持不变，
至 2 d后还略有下降，此时气孔导度大幅度下降，
这表明氨态氮下叶气孔是大量关闭的。
参考文献
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图 5 不同形态氮素下水稻叶气孔导度的变化