全 文 :植物生理学通讯 第 40卷 第 5期,2004年 10月638
芒果植株再生及其在生物技术中的应用
肖洁凝1,2 吴永杰1 陈云凤1 陈启助1 黄学林1,*
1 中山大学生命科学学院基因工程教育部重点实验室, 广州 510275,2 广州大学生物与化学工程学院生物系,广州
510405
The Plant Regeneration and Its Application in Biotechiques of Mango
XIAO Jie-Ning1,2, WU Yong-Jie1, CHEN Yun-Feng1, CHEN Qi-Zhu1, HUANG Xue-Lin1,*
1The Key Laboratory of Gene Engineering of Ministry of Education, School of Life Sciences, Zhongshan University, Guangzhou
510275; 2Department of Biology, School of Biology and Chemistry Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510405
提要 介绍了近 20 年来芒果植株再生研究的进展及其在生物技术中的应用。芒果植株再生研究主要通过体胚发生途径进
行,用已建立的芒果体胚再生体系进行芒果品种改良已有不少基础研究,将芒果ACC 氧化酶的反义基因导入“Hindi”芒
果的 PEMs 中控制果实成熟以及用芒果胚性培养物与真菌滤出物共培养,已初步筛选出抗炭疽病菌的芒果品种。
关键词 芒果;体胚发生;器官发生;生物技术
收稿 2004-02-17 修定 2004-05-31
资助 IPGRI 基金(LOA021057)。
* 通讯作者(E-mail:ls17@zsu.edu.cn,Tel: 020-84110797)。
芒果(Mangifera indica)是漆树科芒果属的常绿
大乔木,产于热带和南亚热带地区,果树速生,
适应性强,可作行道树。其果实外观美丽,果
肉风味可口,享有“热带水果之王”的美誉。
虽然芒果生产发展迅速,但问题还较多。病虫害
是芒果生产中的大敌, 其中炭疽病、白粉病、蒂
腐病是严重危害芒果生产的三大病害;而虫害约
有 300 余种,严重影响芒果的产量以及采后贮运
销售,果农常常遭受巨大损失,影响芒果生产的
经济效益[1,2]。另外,人们对芒果品质的要求也越
来越高,市场的供应期也不断延长。但由于芒果
果实不耐低温,不耐贮存,3 周后即出现腐烂变
软[3],其种子是典型的顽拗性种子,不耐低温,
对脱水敏感,不耐贮存,寿命极短[4]。因此,为
适应生产和市场的需要,培育品质优良、抗病性
强、耐贮性好、矮化集于一身的芒果品种是芒果
研究中面临的重要课题。
植物生物技术为改良品种提供了一条新途
径,本文介绍国内外芒果的植株再生及其在生物
技术中应用的研究进展。
1 芒果的离体植株再生
要通过生物技术进行品种改良和实现超低温
种质保存,其首要的条件是建立芒果组织培养再
生体系。经过多年的研究,已取得了较大的进展
(表 1),特别是芒果体细胞胚胎发生的研究。
1.1 芒果体细胞胚胎发生和原生质体培养
Litz等[5]首次报道通过芒果珠心组织进行离体
培养,并获得体细胞胚,但体胚不能成苗。
DeWald 等[6,7]采用两个多胚芒果品种(Parris 和
James Saigon)的珠心组织,通过体胚发生途径,
成功地获得再生植株。依据目前的资料,芒果的
体细胞胚胎发生主要经过3个阶段:(1)胚性培养
物的诱导;(2)体胚的诱导、分化、发育和成熟;
(3)体胚的萌发和成苗。芒果的体细胞胚胎发生主
要是通过间接发生途径[5~13], 即通过愈伤组织或暂
短的愈伤组织阶段, 但也有直接发生的[14,15]。芒
果珠心组织的胚性反应能力主要取决于外植体供体
的基因型和培养基所含的成分[5~13],以及被珠的
发育状态[8]。
诱导胚性培养物的外植体多采用授粉后 20~
60 d的幼果或长度约为1~5 cm的幼果[5~13],Patena
等[13]认为较小的幼果比较大的幼果胚性反应能力
强,DeWald 等[6,7]则采用胚占据胚囊腔一半的幼
果。将分离的珠心组织或去除胚后的半边胚珠组
织(使珠心组织与培养基接触)置于固体培养基上培
植物生理学与农业及生产应用 Plant Physiology and Agriculture and Applications
植物生理学通讯 第 40卷 第 5期,2004年 10月 639
表1 芒果离体培养的形态发生
发生途径 外植体 主要研究内容及结果 参考文献
体胚发生 珠心组织 获得体胚但不能发育成植株;体胚发生与品种有关 5
可获得的体胚发生,但只获得较少的萌发苗;体胚发生与品种有关 8
获得体胚和植株再生;增殖需要细胞分裂素;体胚发生与品种有关 29
固体培养基适于体胚诱导;体胚诱导依赖蔗糖,5 % ~ 6 % 蔗糖好;谷氨酰胺可促进体胚发生 6
经愈伤诱导和悬浮培养增殖, 获得高频率体胚发生;试图解决体胚发生中过早萌发、下胚轴体 7
胚二次胚发生以及体胚缺乏两极的问题
芒果单胚品种的快速体胚发生 14
对高含水性体胚成熟度的调控进行研究:提高培养基中固化剂(Gel-Gro)浓度;ABA 可以促进 30
次生胚的正常发育
A B A、渗透压和温度对芒果体胚发生的作用 31
乙烯促进剂以及抑制剂对体胚发生的影响, 乙烯抑制体胚发生, 单胚品种产生更多的乙烯 32
基因型、2,4-D 和胚性培养物看护培养对胚性愈伤组织的诱导 9
单胚品种的高频率体胚发生,不同的品种胚性反应能力不同 12
优化培养基,有效控制褐化 13
未成熟子叶 芒果单胚品种的快速体胚发生 20
原生质体培 珠心组织形 通过原生质体培养进行体胚发生和再生植株 11
养(体胚发生) 成的 PE M s
器官发生 茎尖 生长素和细胞分裂素对离体茎尖生长的作用,仅获得了有限的茎尖增殖 18
叶片 从幼叶诱导愈伤,获得再生植株 17
茎尖 叶和茎尖离体培养具有产生大量酚类物质、培养基褐化、植株褐化和污染、生长缓慢问题 33
体胚苗根 体胚苗再生 10
茎尖、茎节 生长素和细胞分裂素对离体茎尖、茎节生长的影响,仅获得了有限的茎尖增殖和腋芽 19
去顶幼苗 获得较大量的子叶节腋芽 20
子叶 形成不定根 20
成熟胚轴 成熟胚轴成苗 4
养,后者被诱导成胚性培养物的能力较前者高[12]。
培养基主要用 MS 或 1/2MS 培养基,也有用 RO[12]
和 BP 培养基[13]。Thomas[12]发现,对于单胚品种
“Arka Anmol”,RO 培养基比MS 培养基更容易诱
导胚性培养物。 培养基的附加物主要有6%蔗糖、
20% CW、2,4-D、GA、Gln、抗坏血酸及固化
剂。值得注意的是,不同研究者在培养基中都添
加了60 g·L-1 蔗糖、20% CW、2,4-D 和 Gln,这
些物质似乎对诱导胚性培养物较有效。Litz等[9]认
为2,4-D附加胚性培养物的看护培养有利于某些基
因型体胚的诱导。 由于培养过程中产生大量的酚
类物质会导致外植体褐化,影响愈伤组织的诱
导,必须在培养基中加活性碳(AC)以及通过5~7 d
的继代[6,7],以除去酚类物质, 但也有些品种胚性
培养物的诱导不需更换培养基[14]。Patena等[13]
则通过使用低浓度的 2,4-D (0.5 mg·L-1)、高压
灭菌的椰子水、固体培养基和BP培养基有效控制
外植体褐化。我们发现在以未成熟子叶为外植体
时,褐化问题并不严重,对诱导几乎无影响,也
不需更换培养基[15 ]。胚性培养物诱导可在光
下[5~9]或暗中培养[13~15],培养 2~10 周不等。
经诱导的培养物需分别转至体胚诱导、分化
和生长及成熟培养基上进行培养。不同研究者所
用的培养基种类各不相同,有液体、固体或半固
体培养基,培养基的基本成分有改良的 B5 培养
基[6,7]、MS 或 1/2MS[14]、RO 或改良的1/2B5 培养
基(含 RO 有机物)[12]以及 BP[13]。在培养的前期,
培养基普遍加入2,4-D[6,7,12~14],有些还加入GA[12,14]
或KT[6,7]; 培养的后期,去除培养基2,4-D(但也有例
外的)后,加入 BA 或 KT、ABA 或 GA。所有植
物生长调节剂使用的浓度大多数为1~5 mg ·L-1,但也
有加入更低浓度或更高浓度的[12,13]。培养基中还
添加 40~60 g ·L -1 蔗糖、20% CW、CH、Gln、
固化剂及其它成分。
DeWald 等[6,7] 根据比较体胚的诱导、生长和
成熟的培养基效果的结果,认为液体培养能加速
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原胚物质(PEMs)的生长,但若要形成正常的体胚
则需转到固体培养基中进行继代培养,否则液体
培养基中会引发多种畸形生长;改良的B5 培养基
比 W P M、M S 或改良的 M S 基本培养基好;在培
养基中添加 5%~6% 的蔗糖有利于体胚的产生;使
用Gelrite较Difco Bacto的效果好,并认为Gelrite
含有某些有利于体胚生长的物质,如 Ca 和 Mg。
外植体大多数应在暗中培养数周以上,这可防止
体胚过早萌发,但过长的黑暗培养会影响体胚的
萌发率[16]。
成熟的体胚被转置萌发和成苗培养基上进行
光照培养,所采用的基本培养基有改良的B5 培养
基[6,7]、1/2改良B5 培养基[10,11]、1/2MS[14]、1/2B5
培养基(含 RO有机物)[12]或 BP培养基[13]。培养基
中不加入植物生长调节剂或加入细胞分裂素类似
物,如6-BA[14]或 TDZ[12],蔗糖浓度为15~30 g·L-1,
大多数实验体系加20% CW,常可通过高温灭菌[13,15]
或过滤灭菌[5~7]加入培养基中。
虽然有较多的品种已建立的了体胚再生体
系, 但仍有一些品种几经试验而不能成功,如
“Red Itamaraca”[16]。另外,体胚的成苗率还普
遍较低,一般为 10%~30%,最高为 63%[7]; 常出
现体胚苗生长缓慢和根发育不良等现象[7,12]。
目前,对芒果原生质体培养进行研究的只有
印度的 A r a 等人[1 1 ]。他们用珠心组织(品种为
Amrapali)所建立的悬浮培养体系,已获得原胚物
质,然后将其置于原生质体分离培养基(PIM,培
养基内含 B5 大量元素、MS 微量元素及其它附加
物,并含 1.2% 纤维素酶、1.0% 半纤维素酶和
0.6% 果胶酶)中以去除细胞壁,经分离的原生质
体再次诱导形成微愈伤组织(microcalli),在含有
植物生长调节剂的培养基上增殖,而在不含植物
生长调节剂的培养基上即形成体胚,体胚的萌发
率约为 40%~60%, 成苗率约为 30%。
1.2 芒果器官发生
虽然人们已对芒果器官发生进行了一些研
究,但成功得到再生植株的例子还较少,成功的
报道是Raghuvanshi和Srivastava[17] 用“Amrapali”
芒果充分展开的幼叶,通过诱导愈伤组织,得到
了再生植株。他们将消毒后的外植体接种到含
0.05% 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的 MS 液体培养基
中,75 r·min-1振荡培养12 h,每2 h更换一次新
鲜的培养液,以去除酚类物质。将处理过的外植
体置于加有不同浓度的生长素和细胞分裂素组合的
培养基上培养, 结果是,在含有 0.24 mg·L-1
NAA 和 2 mg·L-1 6-BA 的培养基上的外植体生长
最快,培养 4 周便可看到芽的形成,萌动的芽经
培养 3 周,平均长度可达 5.8 cm,用吲哚丁酸
(IBA)处理后可有 20% 的苗出根。
采用茎尖或茎节培养只能得到有限的茎尖增
殖和腋芽,且难以生根[18~20]。王晓峰和傅家瑞[4]
用成熟芒果的离体胚轴进行培养获得了再生植株,
他们发现 0.5% AC 可有效抑制胚轴的褐变。WPM
液体培养基外加 0.5% AC、3% 蔗糖、6 mg·L-1
IBA、4 mg·L-1 KT 适宜芒果离体胚轴的萌发和生
长。
我们曾研究过十多种外植体不定芽的诱导效
果, 所用的外植体包括成年树的顶芽、叶柄、花
枝和幼果,一年生幼苗的顶芽、茎节段、叶柄
和叶片,离体幼苗的茎尖、茎节段、子叶节、
根尖和叶片,成熟胚的子叶以及去顶幼苗子叶节
等,发现只有萌发 7 d 的去顶幼苗子叶节能诱导
出3~7 个腋芽,它们在含5 mg·L-1 IBA 的生根诱
导培养基上预培养5 d,再在生根培养基上培养1
周后能诱导出根,但炼苗移栽难以成活[20]。
成熟的芒果子叶形成不定根较为容易,培养
21 d后,平均生根率达64%(在不含营养成分和植
物生长调节物质的琼脂培养基上)。芒果子叶生根
的位点主要在近轴面切口上表皮的主维管束处。
2,4-D抑制子叶不定根的形成,但诱导子叶形成根
状物或瘤状物。5 和 50 mg·L-1 的 NAA 对子叶切
段生根作用不明显,当浓度达到100 mg·L-1时,则
推迟芒果子叶不定根的形成,减少根的数目。5、
50和 100 mg·L-1的 IAA和 IBA都可促进子叶生根,
可使子叶生根百分率比对照增加 35% 以上,平均
生根数增加 60% 以上。200 mg·L-1 的三碘苯甲酸
(TIBA)可完全抑制子叶不定根的形成,加入 IBA
可部分逆转抑制效应。子叶不同切面不定根形成
的能力差异可能与生长素的极性运输有关[20]。
我们采用这一实验体系,通过抑制扣除杂交
方法(SSH),获得 6 个可能与不定根形成相关的
cDNA 片段,这些片段的 cDNA 所推导的蛋白质分
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别与膜运载蛋白、甲酸脱氢酶(FDH)、ABC 转运
蛋白、乙酰辅酶 A 羧化酶和转录因子同源;用
RACE 法对与拟南芥生长素反应因子同源的 cDNA
片段进行扩增,获得包含完整读码框架(ORF)的 2
个基因的序列,分别命名为 MiARF1(芒果生长素
反应因子类蛋白基因1)和 MiARF2(芒果生长素反
应因子类蛋白基因2)[21,22], 现正对其功能作进一步
分 析 。
2 芒果离体培养在生物技术中的应用
人们采用已建立的芒果体胚再生体系,对芒
果进行品种改良等生物技术的研究(表2)。自1990
年开始,Litz等[23]以及Mathews和Litz[24]用建立的
体胚体系初步研究基因转化, 将NPTII基因整合
到体胚中,发现不同发育时期的体胚对卡那霉素
的敏感性不同,发育前期的体胚比发育后期的体
胚更为敏感。Mathews 和Litz[16]将含有葡糖醛酸
酶和新霉素磷酸转移酶基因的 p T i T 3 7 - S E : :
pMON9749 与胚性培养物(直径少于1 000 mm)共培
养后,获得了转基因植株,但转基因植株中不含
目的基因。直到1997年, Cruz-Hernandez 等[25]
用 pBI121双元载体通过土壤农杆菌LBA4404介导
转化,成功地将芒果ACC 氧化酶的反义基因导入
“Hindi”芒果的PEMs 中,试图获得控制果实成
熟的转基因植株,但未见转基因植株的后续报道。
表2 芒果离体培养在生物技术中的应用
材料来源 生物技术的研究 参考文献
胚性培养物(珠心组织) 筛选抗炭疽病菌的胚性培养物 26
胚性培养物(珠心组织) 筛选抗炭疽病菌及毒植物素的胚性培养物,并分析其机制 27
体胚(珠心组织) 将 NPTII 基因整合到体胚中;不同发育时期的体胚对卡那霉素的敏感性不同; 发育前期 23,24
的体胚比发育后期的体胚更为敏感
体胚(珠心组织) b-葡糖醛酸酶(GUS)基因和新霉素磷酸转移酶基因(NPTII基因)转化 16
体胚(珠心组织) ACCase 反义基因的转化 25
胚性培养物(未成熟子叶) 用 PEMs 成功地进行超低温保存 28
为了培育抗炭疽病(由真菌Colletotrichum
gloeosporioides引起) 的芒果品种,Litz等[26]通过
芒果胚性培养物与上述真菌滤出物共培养时,初
步筛选出抗炭疽病菌的体胚。Jayasankar和Litz[27]
对抗菌及抗毒植物素的胚性培养物作了进一步研
究,发现抗菌及抗毒植物素的胚性培养物可抑制
菌丝的生长,抗菌的胚性培养物分泌的几丁质酶
和葡聚糖酶增多,这在筛选抗炭疽病菌的芒果中
迈出了可喜的一步。
在芒果种质超低温保存方面中,我们采用玻
璃化方法于液氮中低温保存了芒果胚性培养物, 存
活率90 %以上,这些经过超低温保存过的胚性培
养物可通过体细胞胚胎发生的途径再生植株。试
验结果证实芒果的胚性组织培养物可作为芒果种质
长期保存的良好试材,只需用简单的玻璃化液预
处理就可直接在液氮低温下长期保存[28]。
3 结语
虽然芒果离体培养的研究已有20多年,取得
了不少结果,但许多研究仍处于实验阶段,远未
能解决生产中的问题。因此,今后应加强研究的
问题有:(1)国内对芒果植株再生研究的品种较
少,应扩大植株再生研究中的品种数目;(2)在现
有的基础上,加强离体培养调控因素的研究,特
别是体胚成熟的同步化及成苗率,建立完善的芒
果植株再生体系;(3)用经超低温保存的植物,进
一步研究其抗冻的机制,克隆出与抗冻有关的基
因,用以进行芒果品种改良;(4)用现有的植株再
生体系,进一步加强芒果离体培养在生物技术中
应用的研究,利用基因工程等技术,培育抗病、
抗虫害的新品种,改善芒果果实的品质,控制果
实的成熟;(5)不同发育时期的芒果子叶具有不同
的离体形态发生能力。以幼胚的子叶为外植体可
进行有效的体胚发生,而成熟胚的子叶却能在无
激素的培养基中易形成不定根,并具有很强向胚
轴极性,因此芒果子叶不但是建立体胚再生植株
的有效外植体,而且对离体形态发生的调控机制
的研究来说也是一种理想的材料,可对其调控机
制开展研究。
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