全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 3期，2004 年 6 月358
多胺氧化酶检测方法的改进及其在低氧水培黄瓜根系中的应用
汪天1,* 郭世荣1,** 刘俊2 高洪波1
南京农业大学1 园艺学院，2 生命科学学院，南京 210095
An Improved Method for Measuring Polyamine Oxidase and It’s Application to the
Study of Cucumber Root Under Hypoxic Stress
WANG Tian1,*, GUO Shi-Rong1,**, LIU Jun2, GAO Hong-Bo1
1College of Horticulture, 2College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095
提要 对多胺氧化酶活性检测方法进行了改进，多胺氧化产物 H2O2 浓度的最低检测量可从 1.25 mmol·L-1 降低到 0.65 mmol·L-1，
其显色产物具有良好的稳定性与重现性。用改进的方法检测的低氧水培下黄瓜根系多胺氧化酶活性比通气对照提高 2.45
倍，酶氧化底物以精胺(Spm)为最佳，最适 pH 值为 6.5。
关键词 多胺；多胺氧化酶；低氧胁迫；检测；黄瓜
收稿 2003-08-01 修定 　 2003-11-28
资助　 国家自然科学基金(30170645)和江苏省自然科学基金
(BK2002110)。
　 * 现在安徽农业大学森林利用学院工作(合肥 230036)。
　** 通讯作者(E-mail:shirongguo@hotmail.com)。
多胺(polyamines，PAs)是生物体氮代谢过程
中产生的一类次生代谢物质，是具有2个或2个以
上氨基的脂肪族碳氢含氮化合物的总称。植物体
在受到生物的和非生物的胁迫时，体内的多胺浓
度急剧地变化[1]。多胺氧化酶(polyamine oxidase，
PAO)是催化生物体内PAs 氧化的关键酶，通过调
节细胞的 PAs 水平和生成物的浓度，参与各种植
物体对逆境胁迫的反应和生长发育过程[2]。因而
PAO 是 PAs 代谢研究的一个重要环节。从1972 年
Smith[3]提出并应用PAO活性的检测方法以来，此
法一直沿用至今。但由于其灵敏性较低和检测产
物稳定性较差等，在很多植物中检测不到 PAO 的
活性 [4]。鉴于此，本文对PAO 活性的检测方法进
行了改进，并利用改进的方法对水培低氧胁迫下
黄瓜根系中 PAO 的特性进行了初步研究，为进一
步研究 PAs 在逆境胁迫下的生理作用提供参考。
材料与方法
试验于 2003 年 3~6 月在本校玻璃温室中进
行。黄瓜(Cucumis sativus)品种津研4号的种子于
30℃恒温箱中催芽30 h后，播入装有石英砂的穴
盘中栽培育苗，昼夜温度(25±5)℃/(20±5)℃，光
照为自然光。幼苗第 3 片真叶展开时进行处理。
以水培通气为对照，间歇地给栽培槽营养液中通
入空气(通气30 min·h-1，溶氧浓度为6~8 mg·L-1);
低氧水培用溶氧浓度调节器调节营养液中的溶解氧
浓度，设定值为1.5 mg·L-1(误差小于±0.20 mg·L-1)。
营养液采用Hoagland 配方。
多胺氧化酶的测定参照Smith方法[3]，并进行
改进。称取0.5 g试材加入1.6 mL磷酸缓冲液(0.1
mol·L-1，pH 6.5)于冰浴中研磨后以10 000×g离心
20 min(4℃)，上清液即为多胺氧化酶(PAO)提取
液。反应混合液含2.5 mL磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1，
pH 6.5)、 0.2 mL 显色液(用0.1 mol、pH 6.5的磷酸
缓冲液配，100 mL中含25 mL N, N-二甲基苯胺、
10 mg 4-氨基氨替吡啉)、 0.1 mL过氧化物酶溶液
(250 U·mL-1)及 0.2 mL PAO提取液，加入0.1 mL
PAs(20 mmol·L-1)启动反应后，混合反应液置于25℃
中反应30 min后用岛津UV-1601分光光度计测定
波长550 nm 处光密度值，以0.001 DOD550·min-1
为 1个酶活单位(U)。 用加入5%高氯酸的提取液
为对照。改进之处在于：Smith 方法所用的显色
剂为愈创木酚，混合反应液在充分反应2 min后，
于波长470 nm处测定光密度值。我们用不同浓度
的H2O2 作底物，对两种方法的灵敏性和稳定性进
行检测。
实验数据用 SAS 软件进行分析。
实验结果
1 多胺氧化酶测定方法的改进
1.1 方法改进后产物吸收峰的光谱 PAs在多胺氧
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化酶的催化下，H2O2 是产物之一，在辣根过氧化
酶(POD)催化下，H2O2 氧化愈创木酚生成茶褐色
产物，此产物在波长470 nm处有最大光吸收。传
统方法就是利用此原理来检测多胺氧化酶的活性。
在POD 催化下，H2O2 同 N, N-二甲基苯胺和4-氨
基氨替吡啉反应也起显色反应，呈现出紫罗兰色
产物。对产物吸收峰进行波长扫描，此产物在
550 nm处呈最大光吸收(图 1)。
1.2 两种检测方法的灵敏性比较 改进的方法最小
检测值为 0.65 mmol ·L-1，传统方法的为 1.25
mmol·L-1。改进方法的标准曲线为 Y=0.0065X-
0.0007(R2 =0.9993)，传统方法的为Y= 0.0034X-
0.0006(R2 = 0.9973)。用同样浓度的H2O2作底物，
改进的方法测得的 OD 值比传统方法显著高，其
斜率是传统方法的1.912倍(图2)。
1.3 两种检测方法的稳定性比较 生成物的稳定性
是决定能否迅速和准确检测、减少由于操作时间
和过程所造成的误差的基础。从图 3 可以看出，
改进方法的生成产物分解速率为0.00023 DA·min-1，
传统方法为0.00593 DA·min-1。两种生成产物分解
速率的比例为25.43。说明改进方法的生成产物具
有较高的稳定性，在反应后放置一定时间内测定
对结果无显著影响，这样更具有实验的操作性。
2 黄瓜根系的多胺氧化酶活性
2.1 低氧水培的黄瓜根系中多胺氧化酶活性变化和
酶反应速度 低氧胁迫下第8天时用Spm作黄瓜根
系PAO 的底物，在 pH 值为 6.5 下检测 PAO 活性。
结果表明，黄瓜根系 P A O 活性显著上升，比通
气水培的高2.45 倍，差异显著(图 4)。
由于提取的黄瓜根系粗酶液中含有不同途经产
生的一定浓度的H2O2，开始时的OD值即为0.104；
随着底物多胺的加入，多胺氧化酶氧化多胺后
H2O2的增加，OD 值缓慢上升，40 min时为0.156，
为初始值的1.5倍；200 min时才趋于平缓，为初
始值的2.43倍。初速度在40 min内保持恒定，速
率为0.013 DA·min-1，直线方程：Y=0.013 X+0.0922
(R2=0.9972)。因而，黄瓜根系中多胺氧化酶的活
性比较迟钝(图5)。在40 min以内放置一段时间后
检测，不仅不影响结果的准确性，还可提高其检
测效果。用愈创木酚法检测活性的结果显示，开
始时的OD 值为 0.062，4 min 后产物生成速率小
于分解速率，30 min为0.017(图未列出)。由此可
以看出，用愈创木酚法应该即时检测。
2.2 低氧水培的黄瓜根系多胺氧化酶活性对pH 值
的依赖性和对底物的特异性 从图6可以看出，以
腐胺(Put)为底物时的最适 pH 值为 7.5；精胺
图1 H2O2与N,N- 二甲基苯胺和4-氨替吡啉
反应产物的吸收光谱
图3 两种检测多胺氧化酶方法的稳定性比较
图2 两种检测多胺氧化酶方法的灵敏性比较
图4 低氧下黄瓜根系多胺氧化酶活性的变化
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(Spm)、亚精胺(Spd)为底物的最适 pH 值为 6.5。
在 pH值 7.5 下，底物为Put 或 Spm 时的 PAO 活性
没有显著差异；而在 pH 值为 6.5 时，以 Spm 为
底物的 PAO 的活性显著高于 Put 或 Spd。因而可
以认为，黄瓜根系 PAO 的体外底物以 Spm 为最
佳，最适 pH 是 6. 5。
讨　　论
目前，人们对 PAO 的生理作用虽然还不完全
清楚，但已有实验表明，它们不仅能调节植物体
内源多胺水平，还与它们的分解产物一起起积极
的生理作用。据报道，PAO 催化多胺的氧化分解
过程中生成的 H2O2 和氨基醛对病原微生物有抵御
作用[5]，H2O2 还参与细胞壁木质素的形成以及修
复损伤。但也有人认为，植物细胞壁上的 PAO 催
化多胺氧化降解所产生的H2O2 和氨基醛等的积累
超过临界浓度时即会损伤质膜，致使细胞内物质
外渗，最终导致组织衰老、坏死[6]。本文测得的
低氧胁迫下黄瓜根系的多胺氧化酶活性比通气水培
高2.45倍，表明PAO参与黄瓜植株对低氧胁迫的
反应。
植物体内多胺降解代谢途径有种属特异性，
不同植物来源或同一PAO催化不同种类PAs的最适
pH 有差异。水稻幼苗的PAO最适pH 为 7.5(底物
为Put)[7]，大麦PAO以 Spd和 Spm作底物时的最适
pH分别是8.0和 4.8[3]。我们的实验表明，黄瓜根
系中PAO 的底物以 Spm 为最佳，最适 pH 是 6.5。
多胺在植物逆境生理和生殖生育研究中已较
为深入和广泛，但大多是根据多胺的合成过程来
确定多胺的各种代谢作用，鲜有从多胺的分解产
物来确定多胺生理作用的。这与 PAO 的检测灵敏
性和稳定性有一定的关系。在本文实验中，我们
是通过加入过量的底物多胺与粗酶液中 PAO 反应
生成H2O2 ，H2O2 在辣根过氧化酶(过量)催化下同
过量的N, N-二甲基苯胺和4-氨基氨替吡啉反应生
成紫罗兰色产物，通过检测产物浓度来间接地测
出 P A O 的活性速率。由于产物具有一定的稳定
性，在40 min内保持相对恒定的初速度，而PAO
的活性较弱，所以可以通过延长反应时间来增加
产物浓度，提高在不同植物、不同逆境下 PAO 的
检测效果。本文结果表明，传统的检测方法主要
是稳定性较差，容易造成操作过程的误差，必须
即时检测，另外，检测灵敏度也较低，所以在
很多植物上都检测不到 PAO 活性。而本文中改进
后的方法，由于稳定性较好，放置一定时间后，
生成物不断增加，可大大提高检测的灵敏性。通
过实验，我们认为，反应时间以30 min为好，检
测较为困难时可以适当延长反应时间。为了消除初
始粗酶液中的H2O2 和其它色素的干扰，可用5%的
高氯酸代替磷酸缓冲液加入反应液作对照调零。
参考文献
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图5 黄瓜根系的多胺氧化酶反应速度
图6 黄瓜根系多胺氧化酶对pH值的依赖性
和对底物的特异性