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收稿日期: 2011-08-02
基金项目: 浙江珍稀濒危树种现代保育关键技术研究（2006C22064）资助。
作者简介: 王祖良，男，高级工程师。
* 通讯作者: 楼雄珍，女，实验师。E-mail: xzlou@zafu.edu.cn
安徽农业大学学报, 2012, 39(1): 79-83
Journal of Anhui Agricultural University
[DOI]CNKI：34-1162/S.20111226.1620.020 网络出版时间：2011-12-26 16:20:49
[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20111226.1620.020.html
天目铁木雄花序内源多胺的 HPLC 分析及其动态变化
王祖良 1，陆海根 2，黄珊珊 3，黄华宏 4，楼雄珍 4*
(1. 浙江天目山国家级自然保护区管理局，临安 311311；2. 杭州动物园综合管理科，杭州 310002；
3. 浙江林学院古树名木救护有限公司，临安 311300；4. 浙江农林大学林业与生物技术学院，临安 311300)
摘 要：采用高效液相色谱法（HPLC）对天目铁木不同时期的雄花序 3 种内源多胺—腐胺（Put）、精胺（Spm）、
亚精胺（Spd）进行测定分析。结果发现：（1）适宜的苯甲酰化反应条件为 37℃、30 min。（2）将色谱条件设定为
检测波长 254 nm，流动相配比甲醇︰水为 60:40，流速 0.6 mL·min-1，柱温 30℃，进样量 5 μL。在该条件下内源多
胺出峰和分离效果最佳。（3）在采样期间，雄花序中 Spd 含量最高，Spm 次之，Put 最少，且 3 种内源多胺含量均
呈先升高后降低趋势，变幅明显。采用优化的 HPLC 法可有效快速地测定天目铁木雄花序的内源腐胺、精胺和亚
精胺，并初步揭示了雄花序发育过程中 3 种内源多胺的变化趋势。
关键词：天目铁木；雄花序；高效液相色谱法；内源多胺
中图分类号：S792.159 文献标识码：A 文章编号：1672352X (2012)01007905
Dynamic changes of endogenous polyamines in male anthotaxy
of Ostrya rehderiana by HPLC
WANG Zu-liang1, LU Hai-gen2, HUANG Shan-shan3, HUANG Hua-hong4, LOU Xiong-zhen4
(1. Management Office, National Nature Reserve of Mount Tianmu, Lin’an 311311；
2. Integrated Management Branch，Hangzhou Zoo, Hangzhou 310002;
3. Limited Company of Rescue Ancient and Famous Trees, Zhejiang Forestry College, Linan 311300;
4. School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, Lin’an 311300)
Abstract: The contents of endogenous polyamines (putrescine, spermidine and spermine ) in male inflores-
cence of Ostrya rehderiana were analyzed with HPLC (high performance liquid chromatography) during the dif-
ferentiation. The results showed that 37℃ and 30 minutes were the best conditions for benzoylation. The chro-
matographic conditions were as follows: detection wavelength, 254 nm; mobile phase, a mixture of methanol and
water (methanol : water = 60:40 ) and acetic acid; velocity of flow, 0.6 mL·min-1; temperature of column, 30℃;
injection volume, 5 mL. The detection results showed that the polyamines could be isolated to determine in the
conditions. In addition, it was found that during the differentiation the content of spermidine was the most and the
putrescine was the least，while three polyamines all increased then decreased obviously. It was effective to detect
the content and reveal the trends of three endogenous polyamines of Ostrya rehderiana with optimization HPLC.
Key words: Ostrya rehderiana; male inflorescence; HPLC; endogenous polyamines
天目铁木 Ostrya rehderiana Chun，桦木科
Betulaceae 铁木属 Ostrya，落叶乔木，是中国濒危
树种，目前野生植株仅存 5 株，仅分布于浙江西天
目山[1]。该树种雌雄同株，单性花，雄花为葇荑花
序，单生或簇生于叶腋，下垂，淡黄色，3 月底至 4
月上旬散粉。雌花具膜质苞片，青绿色，着生于枝
梢，聚生或稀疏的总状花序，于 4 月中旬开放。由
于雌雄花花期错落，导致结实率低，仅为 20%~30%，
且果实干瘪粒较多[2]。因此，研究阐明天目铁木花
芽分化机理，并由此研究开发能促进天目铁木雌雄
DOI:10.13610/j.cnki.1672-352x.2012.01.020
80 安 徽 农 业 大 学 学 报 2012 年
花花期一致、提高结实率的新技术具有重要现实意
义。多胺（polyamines, Pas）是植物体代谢过程中产
生的具有调控作用的低分子量脂肪族含氮碱，以往
研究表明多胺尤其是腐胺（putrescine, Put）亚精胺
（spermidine, Spd）与精胺（sperrmine, Spm）广泛
分布于植物体中，对许多高等植物开花结实具有积
极的调控作用[3-4]。HPLC 法具有分析速度快、柱效
高、检测灵敏度高、定量分析准确、重现性好的特
点，是目前多胺含量测定的主要手段[5]。但有关天
目铁木组织、器官发育过程中内源多胺含量变化的
测定研究迄今为止未见报道，因此，作者对天目铁
木雄花序发育过程中 3 种内源多胺（Put、Spd 和
Spm）的 HPLC 测定方法及含量变化进行研究，为
内源多胺在植物（特别是木本植物）器官发育过程
中作用机制等方面研究提供理论基础，为调控天目
铁木花序发育、提高结实率等提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
天目铁木雄花序（图 1）采自浙江西天目山国
家自然保护区。采样时间为 2008 年 3 月 15 日(A)、
3 月 20 日(B)、3 月 25 日(C)、3 月 31 日(D)和 4 月
5 日(E)，样品采回后立即贮于－30℃低温冰箱待测。
图 1 不同时期的天目铁木雄花序
Figure 1 Male anthotaxy of Ostrya rehderiana at different
stages
1.2 主要仪器与试剂
检测仪器有 Waters600 高效液相色谱分析仪、
Waters486 型紫外检测器、HS2000 色谱数据处理软
件，材料前处理仪器主要有减压旋转浓缩器、
真空泵、离心机、超声波清洗机等。
试剂高氯酸、氢氧化钠、苯甲酰氯、无水乙醚
等为分析纯，购于华东医药公司；色谱甲醇为天地
产品；Put、Spd 和 Spm 标准品皆为 Sigma 产品。
1.3 内源多胺的提取
内源多胺提取参照 Flores 和 Galston 的方法[6]，
取 0.5 g 左右的天目铁木雄花序，加入 2 mL 预冷的
5%高氯酸，冰浴研磨，研磨后再加入 5%高氯酸 2
mL，冰浴浸提 1 h。转入 10 mL 离心管中 15 000
r·min-1、4℃条件下离心 20 min，取上清液待用。
1.4 多胺的苯甲酰化
1.4.1 苯甲酰化条件优化 多胺的分子结构中不具
备可直接进行灵敏分析的官能团，因此必须使之生
成具有高检测灵敏度的衍生物。目前衍生反应中常
用的试剂有丹磺酰氯、苯甲酰氯、邻苯二醛等，在
植物样品分析中最常用苯甲酰化，但不同文献报道
的苯甲酰化反应时间和温度不尽相同[6-8]。因此先对
3 种多胺苯甲酰化的温度、时间做了优化试验，结
果见图 2。综合考虑 3 种多胺在不同衍生条件下的
出峰效果，从图 2 可知，应选择苯甲酰化温度 37℃、
反应时间 30 min 为佳。
图 2 3 种多胺在不同衍生条件的峰面积
Figure 2 Peak areas of three polyamines in the condition of
different derivatization
1.4.2 本试验苯甲酰化程序 取 1 mmol·L-1 的 Put、
Spd、Spm 标样各 100 μL（样品取上清液 1 mL）加
到 10 mL 带盖塑料离心管中，加入 7 μL 苯甲酰氯、
2 mol·L-1 NaOH 溶液 1 mL 混匀在 37℃水浴中反应
30 min，加入 2 mL 饱和 NaCl 溶液，混匀后用 2 mL
乙醚萃取，15 000 r·min-1离心 5 min，取 1 mL 醚相
（样品取 1.5 mL）真空干燥（重复 1 次），用 100 μL
甲醇（样品用 150 μL）溶解，过 0.25 μm 的滤膜，
以备色谱进样。
1.5 色谱条件
采用 Waters Symmetry C18 色谱柱（250 mm ×
4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇和水，检测波长为
254 nm，流速 0.6 mL·min -1，柱温 30℃，5 μL 进样
量。
1.6 标准曲线的制作
将 Put、Spd 和 Spm 的标准品配成 1 mmol·L -1
的贮液，按照文中 1.4 将贮液苯甲酰化。取苯甲酰
化后的标准品配成一定浓度的混标。Put 和 Spm 浓
39 卷 1 期 王祖良等: 天目铁木雄花序内源多胺的 HPLC 分析及其动态变化 81
度相同，为 0.010 4、0.020 8、0.041 7、0.055 6、0.083 3
和 0.125 nmol·μL-1；Spd 为 0.031 2、0.062 3、0.125 1、
0.166 8、0.249 9 和 0.375 nmol·μL-1。HPLC 分析后，
以相应峰面积为自变量制作标准曲线。
1.7 数据处理
色谱峰面积用 Breeze 3.0 软件计算；标准曲线、
样品多胺的平均数和标准偏差，以及相关图的计算、
制作等皆在 Excel 2003 上进行。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的选择
2.1.1 检测波长的选择 刘俊等人每隔 10 nm 进行
波长检测发现多胺在 230 nm 处有最大响应[7]。作者
在 200~300 nm 内每隔 1 nm 对 3 种苯甲酰化后的多
胺进行扫描，结果见图 3。
图 3 显示，200~250 nm 内吸收较大，但 Spd 和
Spm 得不到有效分离，250 nm 后 3 种多胺都能得到
较好分离，有文献[7-8]报道，采用 254 nm 作为检测
波长时，杂质响应较小，3 种多胺的峰突出。所以，
在保证有较大吸收峰的前提下，本试验选择 254 nm
作为检测波长。
2.1.2 流动相组成的选择 在检测波长设定为
254 nm 的前提下，设置 4 个流动相比例，分别为甲
醇:水为 80:20(A)，甲醇:水为 70:30(B)，甲醇:水为
60:40(C)，甲醇:水为 50:50(D)，对 3 种多胺标准品
进行 HPLC 分析，结果见图 4。
图 3 3 种多胺紫外光谱图
Figure 3 Ultraviolet spectrograms of three polyamines
图 4 显示，甲醇含量不断降低，3 种多胺的出
峰时间不断延长。甲醇含量 80％，3 个峰有重叠，3
种多胺得不到有效分离；甲醇含量 70％，3 个峰虽
能分开，但过于靠近，易与其它杂质峰重叠；甲醇
含量 60％，3 种多胺得到较好分离；甲醇含量 50％，
出峰时间明显延后。因此，本试验将流动相设为甲
醇:水为 60:40。
图 4 不同比例流动相下 3 种标样的色谱图
Figure 4 Chromatogram of three standard hormones with
different proportions mobile phase
多胺在一般的反相柱上均能获得较好分离[9]。
但在对天目铁木雄花序中内源多胺进行测定时，使
用甲醇含量为 60％的流动相，发现 Spd 仍与杂质峰
部分重叠，因此，为获得更好的分离效果，本试验
进一步使用了梯度洗脱法。线性梯度洗脱程序：流
动相A为 100%色谱甲醇，流动相B为去离子水，0～
16 min，A 与 B 体积比 60:40 至 62:38，16～25 min，
A 与 B 体积比 62:38 至 65:35；流速为 0.6 mL·min-1。
结果如图 5 所示。
图 5 多胺的高效液相色谱图
Figure 5 Chromatogram of polyamines
从图 5 中看出，标准品和样品中的 Put、Spd 和
Spm 都得到较好分离，保留时间分别为 9.58、15.19
和 23.34 min，一次样品测定在 28 min 内完成。
2.1.3 线性范围和重现性 测定过程中用外标峰面
积法定量，配制一系列质量浓度（见本文 1.6）的
Put、Spd 和 Spm 混合溶液，并进行色谱分析，以获
得的浓度（Ｙ，nmol·μL－1）
对峰面积(Ｘ）作线性回归曲线，结果见表 1。
82 安 徽 农 业 大 学 学 报 2012 年
从表 1 看出，检出限较低，线性关系良好。
同样的样品 3 次平行进样，求得相对标准差
（RSD）分别为 0.1%、1.1%和 1.3%，符合定量分
析要求。
表 1 3 种多胺标准品的工作曲线
Table 1 Calibration curves of three standard polyamines
标准品
Standard
回归方程
Regression equation
相关系数
Correlation coefficient
线性范围/nmol·μL－1
Linear range
检出限 nmol·μL－1
Detection limit
Put Y=3.68×10-7X-0.00296 0.999 5 0.005 50~0.550 0.002 75
Spd Y=4.11×10-7X-0.00914 0.999 8 0.016 7~1.67 0.008 35
Spm Y=1.73×10-7X-0.00288 0.999 6 0.008 92~0.892 0.004 46
表 2 雄花序发育期 3 种内源多胺的变化
Table 2 Change of three endogenous polyamines from male inflorescence during growth
取样日期 Sampled date Put/nmol·g-1 Spd/nmol·g-1 Spm/nmol·g-1
03-15 5.99±0.72 75.14±1.74 59.14±1.56
03-20 16.73±1.31 159.58±3.58 149.82±1.18
03-25 28.57±1.86 276.92±4.89 193.81±5.20
03-31 39.61±0.22 197.76±0.60 154.93±3.92
04-05 11.26±0.51 84.24±1.10 50.98±0.82
2.1.4 回收率 将 3 种多胺标准液加入天目铁木样
品提取液中，按方法 1.3 处理样品，按样品的色谱
条件测定。得到回收率分别为 101.3%、101.1%和
101.75%。相对标准差分别为 7.9%、3.96%和 4.66%，
说明结果是可靠的。
2.2 雄花序发育期 3 种内源多胺的变化
采用本试验检测方法，对采自 5 个不同时期的
天目铁木雄花序样品进行内源 Spm、Put 和 Spd 的
测定，结果见表 2。
从表 2 中看出，在各个时期天目铁木雄花序中
Spd 含量最高，Put 最低。从 3 月 15 日到 4 月 5 日，
雄花序中 3 种内源多胺呈“先升高后降低”趋势，且
不同时期差异明显。
3 小结与讨论
鉴于植物体内仅含微量的生理活性游离态内源
多胺，测定前需用有机溶剂从中提取，然而，植物
体内多胺通常以游离态、结合态和束缚态 3 种形态
存在，且结合态和束缚态含量较高[3]，即试验过程
中要尽量防止非游离态多胺的水解，因此，样品采
集后应立即置－30℃以下低温贮藏，有条件时应冷
冻干燥，整个提取过程应在冰浴中进行。
植物内含物质成分十分复杂，利用 HPLC 检测
其中一种成分的含量，关键在于前处理和色谱条件
的选择[10]。本试验前处理方法见 1.3、1.4，该方法
操作简单快速，目标物纯度较高，待测物质损耗较
少，但经检测仍有少量干扰物质存在，因此，本试
验在选择良好分离目标物的色谱条件（波长 254
nm，流动相配比甲醇:水为 60:40、流速 0.6 mL·min-1、
柱温 30℃、进样量 5 μL）前提下，进一步使用梯度
洗脱法以达到准确检测之目的。结果显示，该方法
检测稳定、准确、效果好。
多胺作为植物成花过程中的一种生理信号，与
植物开花关系密切。徐继忠发现，核桃雌花芽的分
化需要较高含量的多胺参与[11]。黄作喜等发现，应
用外源 Spd、 Spm 处理 2-3 叶黄瓜均能明显促进雌
花分化，而 Put 处理的雌花数低于 CK[12]。杨丽等
研究发现，菊花花芽分化过程中, Put 含量的降低有
利于启动花芽分化, 后期 Spm 的增加有利于小花的
分化, Spd 与小花原基分化关系密切[13]。但多胺对雄
花序形态变化影响的相关报道较少。从图 1 可以看
出，在本试验采样期间，检测的雄花序已进入形态
分化阶段，花序主轴继续生长，向上伸长，不断产
生苞片和小花芽。对采集的样品进行 HPLC 分析发
现，从 3 月 15 日到 4 月 5 日的花序发育过程中，
Spd 含量最高，起主导作用，随着花序的生长，3
种内源多胺含量均呈现先升高后降低的趋势，一般
说来，多胺生物合成越活跃的地方，细胞分裂越旺
盛，因此，3 月 20 日到 3 月 31 日可能是天目铁木
雄花序细胞分裂快速生长的旺盛期，3 月 15 日和 4
月 5 日所采样品的多胺含量相对较低，可能是在 3
月 15 日雄花序上的小花芽还未开始分化，在 4 月 5
日雄花序上的小花芽可能已发育成熟，接近散粉期。
天目铁木花芽分化整个生理过程及形态分化过程未
见相关报道，因此，本试验测定结果无法和花芽分
化的具体阶段相对应，只能从形态上做初步的分析
39 卷 1 期 王祖良等: 天目铁木雄花序内源多胺的 HPLC 分析及其动态变化 83
探索，也就是说，要明确天目铁木花芽分化的机理、
调控机制等相关内容仍然还有大量的工作需要开
展。
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