全 文 ：第 25卷　第 2期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2005年　4月Vol.25　No.2　　　　　　　　　　　　BULLETINOFBOTANICALRESEARCH April, 　2005
基金项目:黑龙江省教育厅科学项目基金资助(10511028)
第一作者简介:张秀英(1977—),女 ,硕士研究生,主要从事植物系统学研究工作。
＊　通讯作者 Authorforcorrespondence
收稿日期:2004-10-17
黑龙江省蹄盖蕨科三属(蹄盖蕨属 、羽节蕨属及
冷蕨属)的遗传多样性分析
张秀英　范亚文＊
(哈尔滨师范大学生命与环境科学学院 ,哈尔滨　150080)
摘　要　利用 7种随机引物对分布于黑龙江省不同区域蹄盖蕨科中的蹄盖蕨属 ,羽节蕨属及冷蕨
属三属的遗传多样性进行了初步分析 ,对蹄盖蕨科各种基因组的 DNA进行了 PCR扩增 ,并对其
RAPD谱带进行了统计处理 ,得出不同区域种类的多态位点百分率 ,结果表明蹄盖蕨科植物具有
较高水平的遗传变异 ,其种类的分布对周围环境变化有着较强的适应能力。利用 Shannon指数和
Nei指数对其分析 ,确定了三属之间的属内种间的亲缘关系:蹄盖蕨属的大部分变异仍存在于种
源内;冷蕨属中的冷蕨和山冷蕨种类之间具有一定的遗传变异;羽节蕨属中 ,欧洲羽节蕨和羽节蕨
种间有较大的遗传变异。
关键词　RAPD;蹄盖蕨属;羽节蕨属;冷蕨属
RAPDanalysisofthegeneticdiversityinAthyrium, Gymnocarpiumand
CystopterisofAthyriaceaefromHeilongjiangProvince
ZHANGXiu-Ying　FANYa-Wen＊
(DepartmentofBiology, HarbinNormalUniversity, Harbin　150080)
Abstract　7 randomprimershavebeenusedinstudyingthegeneticdiversityofAthyriaceaefromdifer-
entregioninHeilongjiangProvince.ThegenomicDNAofAthyriaceaehavebeenamplifiedbyPCR.
ThentheRAPDbandshavebeenstatisticalyanalyzedandthepercentageofpolymorphismwereob-
tained.ThedatasuggestAthyriaceaeplantshavehighlevelgeneticvariationsandthedistributionofits
specimenshaveweladaptivecapacitytoenvironmentchanges.Thedatahavealsobeenfurtheranalyzed
byShannonandNeiindextoestimatetherelationshipofspecimenswithinandamongthethreegenus:
Athyrium, GymnocarpiumandCystopteris.Theresultsshow:MostvariationsofAthyriumarestilexista-
mongitsspecimens;ThereissomevariationsbetweenCystopterisfragilisandCystopterissudeticainCys-
topteristosomedegree;InGymnocarpium, thegeneticvariationsbetweenGymnocarpiumdryopterisand
Gymnocarpiumjessoensearesomewhatprominent.Theresultsestablishafoundationinthestudyoftaxo-
nomicstatusofAthyrium, GymnocarpiumandCystopterisinAthyriaceae.
Keywords　RAPD;Athyrium;Gymnocarpium;Cystopteris
蹄盖蕨属(AthyriumRoth.)是蹄盖蕨科中较大
的一属 ,约 200余种 ,主产于世界温带和亚热带高
山林下 。我国是蹄盖蕨属的分布中心 , 现有 100
余种 ;羽节蕨属在世界有 5 ～ 6种 ,分布于北半球
温带(欧洲 、北美洲和亚洲)和亚洲亚热带山地 ,生
于阴暗湿润林下 。我国有 5种 ,产于东北 、华北 、西
北及西南;冷蕨属约 10多种 ,分布于世界温带和寒
温带地区。我国约有 10种 ,产于东北 、华北 、西北
及西南的高寒山地 ,台湾高山也有少数分布。
据敖志文 [ 1]在《黑龙江省蕨类植物 》一书中记
载 ,黑龙江省蹄盖蕨属有 3种 ,羽节蕨属有 2种 ,冷
蕨属有 2种 。
表 1　植物材料的名称 、采集地点及染色体数
Table1　Name, collectionsitesandchromosomenumberofplantsamples
种名 Species 染色体基数 Chromosomenumber 　采集人 Colector 采集地 Colection
羽节蕨(Gymnocarpiumjesoense) x=40 曹建国 、刘保东 牡丹江
猴腿蹄盖蕨 (Athyriummultidentatum) x=40 曹建国 、刘保东 牡丹江　帽儿山
中华蹄盖蕨 (Athyriumsinense) x=40 曹建国 、刘保东 牡丹江　帽儿山
山冷蕨 (Cystopterissudetica) x=42 曹建国 、刘保东 牡丹江　帽儿山
冷蕨(Cystopterisfragilis) x=42 曹建国 、刘保东 牡丹江　帽儿山
欧洲羽节蕨 (Gymnocarpiumdryopteris) x=42 曹建国 、刘保东 牡丹江　帽儿山
1　材料和方法
1.1　实验材料
所用实验材料均采自于牡丹江地下森林和尚
志县帽儿山 。详细的材料采集信息(见表 1)。将
每种植物随机取 15个样 ,剪取新鲜幼嫩的叶片 ,分
装并标记好放置 -80℃保存备用 。
1.2　DNA提取方法
实验尝试了洗衣粉法(Laundrydetergent)、十
二烷基肌氨酸纳法 (Sarcosyl)、高盐低缓冲液法
(Highsaltsbufer)、SDS法及 CTAB法 ,结合各属植
物含有酚类和多糖类物质较多 ,易产生褐变等特
点 ,通过多次实验最终确定了适合三属植物 DNA
提取的方法即改良的 CTAB法 ,具体步骤如下:
(1)取 300 ～ 500 mg新鲜叶子于研钵中 ,加入
少量提取液 ,研磨成糊状 。(2)迅速分装到 Eppen-
dorf管中 ,立即加入 650 μL提取缓冲溶液 ,充分混
匀 ,于 63℃温浴 30 min期间不时取出轻轻混匀。
(3)取出至室温后 ,加入等体积(650 μL)酚:氯仿
(1:1)抽提 ,缓慢颠倒混匀 10min, 11 000r/min,离
心 15 min。 (4)将上清液转移至新 Eppendorf管中 ,
加入等体积酚:氯仿(1:1),混匀 , 11 000 r/min,离
心 10 min。 (5)再次吸取上清液到一个新的 Ep-
pendorf管中 ,加 40μL3mol/LNaAc和二倍体积的
预冷的无水乙醇 ,颠倒混匀 , 0℃放置 30 min,离心
5 min。(6)弃上清液 ,加 500μL1 ×TE。 (7)加
3μLRNaseA(10 mg/mL)37℃, 30 min。 (8)加 3μL
proteinaseK(10 mg/mL)37℃, 30 min。 (9)取出 ,加
500μL酚:氯仿 (1:1)抽提 , 11 000r/min, 离心
10min。(10)取上清液至一个新的 Eppendorf管
中 ,加 70%乙醇 ,离心 4 min,重复 2次 。(11)弃上
清液 ,室温干燥沉淀 , 加 50 ～ 100 μL1 ×TE或
50μL纯水 ,分装 , -20℃保存 。
1.3　DNA扩增
参照 Wiliams等 [ 2] 的 方 法 , 复 性 温 度
36 ～ 39℃,扩增引物为 SBSA14, SBSQ02, SBSQ18,
SBSP13 , SBSQ10, SBSA13,所用引物购自北京赛
百盛公司 , dNTP购自 TaKaRa, TaqDNA聚合酶购
自上海 Promega,扩增反应在 HYBAIDPCR扩增仪
中进行。
1.4　RAPD扩增步骤
(1)于冰上调制反应混合液 ,一般加样顺序为
ddH2O、10×bufer、dNTP、MgCl2 、Primer、Taq。 (2)
将反应混合液混匀 ,分装到 PCR反应管中。 (3)加
入 DNA, 并设空白对照 。 (4)进行 PCR反应
(RAPD的扩增程序)。 (5)用 0.5×TAE配 1.2%
琼脂糖凝胶 ,加溴化乙锭 1μg/mL。 (6)PCR结束
后 ,将样品置于 4℃冰箱中保存10min,然后在每个
样品中加入 2 μLloadingbufer。(7)将反应管中的
全部样品加入各泳道 ,加入 DNAMarkerDL2000作
为分子量标准 , 共 6个片段 , 碱基对数依次为
2 000、1 000、750、500、250、100。 (8)电泳 (电压
3V/cm),一般为 3 ～ 4 h。 (9)用凝胶成像系统 ,记
录电泳结果 。
2　实验结果
2.1　DNA多态性分析
试验通过对 7张指纹图谱的统计分析 ,得到了
1872期 张秀英等:黑龙江省蹄盖蕨科三属(蹄盖蕨属 、羽节蕨属及冷蕨属)的遗传多样性分析
表 2　7个随机引物对三个属的供试材料的扩增结果
Table2　Amplificationresultsof7 primeronmaterials
引物 Primers 扩增带数 Totalbans 多态带数 Polymorphicbans 多态带的百分率 Polymorphicbans(%)
SBSA14 12 11 91.67
SBSP13 11 11 100.00
SBSA19 16 16 100.00
SBSQ02 9 9 100.00
SBSQ10 13 13 100.00
SBSQ18 11 11 100.00
SBSA13 9 8 88.89
总计 Total 81 79 97.53
　注:多态带是指在供试品种中 ,对某一扩增带而言 ,某些品种有 ,其它品种无的带。 　Note:Polymorphicbandsmeansthatacertainamplified
bandispresentinsomematerialssurveyed, butnotpresentintheothermaterialssurveyed.
表 3　7个引物对各供试材料的的扩增带数
Table3　AmplificationbandsofRAPDwithprimeroneverymaterials
引物 Primer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
SBSA14 3 3 4 5 3 4 2 3 2 3 2
SBSP13 3 3 3 2 3 3 3 3 5 5 3
SBSA19 3 3 6 4 4 5 3 4 3 4 4
SBSQ02 2 2 5 4 3 3 3 3 4 4 5
SBSQ10 3 3 3 5 4 4 6 3 3 3 2
SBSQ18 3 3 4 3 4 3 4 4 4 3 3
SBSA13 3 2 3 3 3 4 3 2 4 3 2
总计 Total 20 19 28 26 24 26 24 22 25 25 21
多态位点数 18 17 26 24 22 24 22 20 23 23 19
总位点数 81 81 81 81 81 81 81 81 81 81 81
多态位点比率 p 0.222 2 0.209 9 0.321 0 0.296 2 0.271 6 0.296 2 0.271 6 0.246 9 0.284 0 0.284 0 0.234 5
　注:1.欧洲羽节蕨(Gymnocarpiumdryopteris)(帽儿山);2.欧洲羽节蕨(Gymnocarpiumdryopteris)(牡丹江);3.羽节蕨(Gymnocarpiumjes-
soense)(牡丹江);4.冷蕨(Cystopterisfragilis)(帽儿山);5.山冷蕨(Cystopterissudetica)(牡丹江);6.冷蕨(Cystopterisfragilis)(牡丹江);
7.山冷蕨(Cystopterissudetica)(帽儿山);8.中华蹄盖蕨(Athyriumsinense)(牡丹江);9.中华蹄盖蕨(Athyriumsinense)(帽儿山);10.猴腿
蹄盖蕨(Athyriummultidentatum)(帽儿山);11.猴腿蹄盖蕨(Athyriummultidentatum)(牡丹江)
如下的遗传信息:7个 10-mer引物共扩增出 81个
位点 ,其中单态位点数为 2个 ,多态位点数为 79个
(表 2),多态位点比率为 97.53%,高水平的多态位
点百分比显示出 RAPD是检测遗传变异的有效方
法 。绝大多数扩增产物的分子量在 250 ～ 2 000 bp
之间 ,各引物检测到的 RAPD位点在 9 ～ 16之间 ,
平均每个可引物检测出11.57个位点。多态位点是
指在该位点上出现的频率小于 0.99的扩增 DNA片
断 [ 3] ,计算公式为:多态位点比率 P=具有多态的
位点数 /检测到的位点数 。一个物种的遗传多样性
越高或遗传变异越丰富 ,对环境变化的适应能力就
越强 ,越容易扩展其分布范围和开拓新的环境 。
表 3中列出了引物在不同种群中检测出的
RAPD位点数及多态位点的百分率。多态位点比
率在各种群中分布从 20.99% ～ 32.10%不等 ,明显
低于总的多态位点比率97.53%。试验中检测出的
多态位点数最多为 26个 ,多态位点数最少的为 17
个 , 多态位点百分率羽节蕨 (牡丹江 )最高
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(32.10%), 最低的是欧洲羽节蕨 (牡丹江 )
(20.99%)。
2.2　Shannon指数 、Nei指数
从利用 Shannon指数估算金光菊核糖体 DNA
的遗传多样性开始 ,许多学者将此统计方法引入
RAPD分析中 [ 4 ～ 6] 。为了进一步阐明蹄盖蕨科植
物三属内种间的遗传变异 ,本研究利用 Popgene32
软件中的 Shannon指数和 Nei指数分别估算了蹄
盖蕨属 、羽节蕨属及冷蕨属种间的遗传变异 , Shan-
non指数是将一扩增产物的存在频率作为该位点
的表型频率来计算遗传多样性 ,研究结果表明蹄盖
蕨属遗 传变异最 大 0.012 7, 其次 是冷蕨属
0.012 3,羽节蕨属最小为 0.009 8。 Nei指数(h＊)
又称 “基因多态性指数” [ 7]其大小与位点变异的大
小成正比 ,反映了种群中等位基因的丰富程度和均
匀程度[ 8] ,三个属间种内 Nei指数的变化规律与
Shannon指数估测的基本相同 ,只是 Shannon指数
估计值有些偏大(见表 4)。
根据 Nei指数计算的蹄盖蕨科属内各种群间
的遗传分化为0.688 3,即 68.83%的遗传变异存在
于种群间(见表 5)。
表 4　蹄盖蕨科植物各种群的遗传多样性分析
Table4　ThegeneticdiversityofthepopulationofAthyriaceae
序号 No. 样品数 Number Na Ne I H
1 15 1.362 8 1.454 6 0.203 1 0.131 8
2 15 1.350 0 1.462 0 0.201 4 0.130 7
3 15 1.356 2 1.421 0 0.253 0 0.160 3
4 15 1.319 0 1.435 6 0.250 7 0.145 9
5 15 1.365 1 1.400 1 0.221 0 0.142 2
6 15 1.342 3 1.424 1 0.243 2 0.144 3
7 15 1.324 3 1.412 0 0.224 6 0.142 7
8 15 1.333 3 1.442 1 0.207 2 0.140 0
9 15 1.358 0 1.432 4 0.236 5 0.143 9
10 15 1.361 2 1.442 6 0.233 0 0.143 3
11 15 1.318 0 1.453 7 0.205 9 0.136 1
注:各数字代表植物名称同表 3
表 5　由 RAPD的 Nei指数估计的蹄盖蕨属种群内 、种群间遗传多样性及分化
Table5　Geneticdiversityanddifferentiationamongandwithin15 populationof
AthyriumappraisedwithNeiindexbasedonRAPDdata
引物
Primer
各种群内的基因多样性 Hs
Intrapopulationgenediversity
总种群的基因多样性 Ht
Genediversityofpopulation
种群间的遗传分化Gst
Interpopulationgeneticdiferentation
SBSA14 0.213 7 0.311 1 0.343 5
SBSP13 0.099 9 0.342 4 0.626 2
SBSA19 0.106 0 0.319 9 0.699 1
SBSQ02 0.087 9 0.418 7 0.780 3
SBSQ10 0.043 5 0.389 7 0.899 3
SBSQ18 0.074 6 0.362 0 0.793 8
SBSA13 0.116 0 0.361 4 0.675 7
平均 0.234 5 0.357 8 0.688 3
1892期 张秀英等:黑龙江省蹄盖蕨科三属(蹄盖蕨属 、羽节蕨属及冷蕨属)的遗传多样性分析
3　讨论
3.1　多态位点百分比
本文利用 7个引物对黑龙江省蹄盖蕨科三属
的植物进行 RAPD分析 ,各种群的多态位点百分率
排序分别为:羽节蕨(牡丹江)>冷蕨(帽儿山)=
冷蕨(牡丹江)>中华蹄盖蕨(帽儿山)=猴腿蹄
盖蕨(帽儿山)>山冷蕨(牡丹江)=山冷蕨 (帽
儿山)>中华蹄盖蕨(牡丹江)>猴腿蹄盖蕨(牡
丹江)>欧洲羽节蕨(帽儿山)>欧洲羽节蕨(牡
丹江)。从中可以看出共有的谱带越多 ,其亲缘关
系越近;共有的谱带少 、特征带多 ,则说明其亲缘关
系较远 。这充分表现了蹄盖蕨科植物遗传背景的
复杂性和 DNA的多态性。
其中不同区域(帽儿山与牡丹江地下森林)的
冷蕨 、山冷蕨多态位点百分率相等 ,表明同一种类
之间的遗传距离相近 ,而采自帽儿山的中华蹄盖蕨
和猴腿蹄盖蕨其多态百分位点也相等 ,表明两者之
间的亲缘关系近 ,分类地位属于同一个属:蹄盖蕨
属 。由此可见 ,尽管种类的采集有一定的地理距
离 ,地理环境的差异对种类差异影响相对较小 ,对
某些种类来讲 ,地域的差异并不是影响遗传变异的
主要因素 。高水平的多态位点百分比(97.53%)
显示 RAPD是检测遗传变异的有效方法 ,而一个物
种的遗传多样性越高或遗传变异越丰富 ,对环境变
化的适应能力就越强 ,越容易扩展其分布范围和开
拓新的环境 。由此可见 ,蹄盖蕨科植物具有较高水
平的遗传变异 ,其种类的分布对周围环境变化有着
较强的适应能力 。
3.2　蹄盖蕨属 、羽节蕨属及冷蕨属的 DNA水平的
遗传变异
由 Shannon指数得出中华蹄盖蕨(帽儿山)为
0.236 5、中华蹄盖蕨 (牡丹江)为 0.207 2;猴腿蹄
盖蕨(牡丹江)为 0.205 9,猴腿蹄盖蕨(帽儿山)为
0.233 0。由 I值可以看出牡丹江地区两个种的平
均 I值远低于帽儿山 ,从地域来说牡丹江地区的两
个种和帽儿山的两个种存在较大的遗传变异 ,这可
能是由于地理环境影响 ,导致不同区域间的遗传变
异 。Kazan等 [ 9]曾认为 Stylasanthesguianeasis之所
以有较高的种内变异是由于这个种具有较高的远
缘杂交率。蹄盖蕨属适合于生长在阔叶混交林下
的阴湿处 ,这样就限制了其生长地域的广泛性 ,导
致同一地区个体间近交的机会增加 ,而不同地区的
交配机会相对减少。因此 ,虽然不同地区存在较大
的遗传变异 ,但由于蕨类植物在黑龙江省的总体分
布仍属于连续分布 ,所以 ,蹄盖蕨属的大部分变异
仍存在于种源内 。由此可见 ,遗传变异在种群间的
分布与种群所处的地理环境及其交配系统有着密
切的关系。
冷蕨属分别包括山冷蕨(帽儿山)、山冷蕨(牡
丹江)、冷蕨(帽儿山)、冷蕨(牡丹江),得出 I值
分别是 0.224 6、 0.221 0、 0.250 7、 0.243 2。从中
可以看出 ,不同地域每个种之间的遗传变异性比较
近 ,尽管地域有差别 ,但种间的变异较小。但冷蕨
和山冷蕨之间遗传变异相对较大 ,说明在冷蕨属中
二者在亲缘关系上比较远 。蕨类植物的孢子在种
和较高一级水平上可以为系统分类提供一个证据
来源 [ 10] 。刘家熙 ,李雅轩 [ 11]在 《北京产冷蕨属孢
子形态的研究》中 ,利用孢子形态特征来鉴别物种
性状 ,指出冷蕨属的 2种(冷蕨和山冷蕨)孢子在
大小 、形状 、刺状纹饰长短及结构等方面有着显著
的差异 ,由此表明这 2种的亲缘关系较为疏远 。这
与我们的结论相一致 ,即冷蕨和山冷蕨种类之间具
有一定遗传变异 。
羽节蕨属中 ,欧洲羽节蕨平均 I值是 0.202 0,
羽节蕨的 I值是 0.253 0,表明种间有较大的遗传
变异 ,从形态分类的角度来看 ,两者也具有一定的
区别 ,即羽节蕨植株高大 、较强壮 ,叶轴被腺毛 ,侧
脉通常分叉;欧洲羽节蕨植株通常是较小型 ,羽片
与叶轴相连 ,但无腺体 ,侧脉通常单一将二者区分
开来 [ 1] 。
3.3　基因多样性及遗传分化
由 Nei指数估算的蹄盖蕨科三个属植物不同
种群的基因多样性结果(表 4),按基因多样性大小
顺序排列为:中华蹄盖蕨 (牡丹江)、中华蹄盖蕨
(帽儿山)、猴腿蹄盖蕨(牡丹江)、猴腿蹄盖蕨(帽
儿山)、羽节蕨(牡丹江)、冷蕨(帽儿山)、冷蕨(牡
丹江)、欧洲羽节蕨(帽儿山)、山冷蕨(帽儿山)、欧
洲羽节蕨(帽儿山)、山冷蕨(牡丹江)、欧洲羽节蕨
(牡丹江)。
由表 5数据可见 ,各种群存在一定的遗传分化
程度 [ 12] ,即在蹄盖蕨科属内各种群间的遗传分化
为0.688 3 ,表明 68.83%的遗传变异存在于种群
间 , 31.17%的变异存在于种群内 ,蹄盖蕨科的种群
间遗传变异要远远高于种群内的遗传变异 。总的
遗传多样性平均值为 0.357 8,其中各种群内的基
因多样性的平均值为 0.234 5。其结果与形态学 、
细胞学等分类系统基本可以相互印证。
190 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷
长期以来 ,人们一直重视蕨类植物配子体和孢
子形态的研究 ,认为其在分类学和系统发育上有着
重大意义。 Nayar[ 13]总结了长期研究真蕨类配子
体和蕨类植物的比较形态学的工作 ,提出以孢子和
配子体为依据的蕨类分类系统 。林孝辉 、包文
美 [ 14]用光镜详尽的比较了东北产蹄盖蕨科 8属 10
种的配子体发育的全过程 ,同时用扫描电镜观察了
孢子形态 ,对蹄盖蕨科的系统分类提供了配子体发
育和孢子形态方面的证据。有关孢子形态的研究
中国科学院北京植物研究所古植物室孢粉组 [ 15]在
这方面做了卓有成效的工作 。刘家熙 , 李学东
等 [ 16, 17]曾利用扫描电镜对北京蹄盖蕨科 3属 (冷
蕨属 、羽节蕨属 、短肠蕨属)的 4种孢子做了详尽
的观察 ,讨论了各属 、种间的差异 ,为蹄盖蕨科系统
分类及孢粉学研究提供了基础资料 。但由于开放
的环境和人为的影响 ,利用形态学 、孢粉学等作为
分类学证据对蹄盖蕨科各属系统演化位置进行确
定 ,可供选择的标记性状少 ,且无法排除一些客观
因素的影响 。
本研究利用 RAPD技术对蹄盖蕨科中在系统
学上占重要位置的 3个属:即蹄盖蕨属 、冷蕨属 、羽
节蕨属属内种间的亲缘关系进行探讨 ,以期从分子
生物学方面对三属在系统学上的位置给以验证。
RAPD分析将是蹄盖蕨科植物系统学研究的有效
补充手段。由于 RAPD所用的引物是 10 bp的寡核
苷酸 ,尽管扩增反应会受到模板 DNA用量 、dNTP、
MgCl2及 Taq酶浓度等诸多因素影响 [ 18, 19] ,但我们
在实验中注重了扩增所采用的反应条件和体系的
相对固定一致 ,其扩增结果的稳定性较好 。在传统
的分类基础上 ,利用现代 DNA分析技术 ,其结果为
蹄盖蕨科植物遗传多样性 、亲缘关系和分类演化提
供了分子生物学的方法和证据。我们仅讨论了蹄
盖蕨科中的蹄盖蕨属 、羽节蕨属及冷蕨属 DNA扩
增的结果 ,在今后的研究中将会在不同的属内种间
利用更多的不同引物进行扩增 ,以便对蹄盖蕨科植
物不同种类在长期进化过程中的 DNA水平的稳定
性和变异性做出更准确的评价 。
致谢　本实验材料的采集和鉴定得到刘保东副教授 、
曹建国博士的大力协助 ,特此致谢!
参　考　文　献
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