全 文 ：第 21 卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001年　7 月
Vol.21　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2001
中国东北落叶松属植物 rbcL基因的序列分析及系统演化
石福臣　陆兆华　李立芹
(东北林业大学 ,哈尔滨 150040)
摘　要　长白落叶松的分类位置及与兴安落叶松的种间关系 ,长期以来未有定论。本研究从大兴
安岭 、小兴安岭及张广才岭等 6个地点采集实验材料 ,对其叶绿体 DNA 的 rbcL 基因进行 PCR-
RFLP分析并测序 。结果显示它们的 rbcL 基因序列均没有差异 ,表明东北地区落叶松属植物有
共同起源 。在系统演化上 ,长白落叶松来自兴安落叶松(Larix gmelinii Rupr.),应作为兴安落叶
松的变种即 L .gmelinii Rupr.var.olgensis Ostenfeld et S.Larsen
关键词　兴安落叶松;长白落叶松;系统演化;rbcL 基因
GENE SEQUENCE ANALYSISOF rbcL AND
SYSTEMIC EVOLUTION IN LARIX NORTHEAST CHINA
SHI Fu-chen　LU Zhao-hua　LI Li-qin
(Nor theast Forestry University ,Harbin 150040)
Abstract　There is no specific conclusion about systematic status of Larix olgensis and species rela-
tionship w ith Larix gmelinii.Experiment materials were taken from six si tes including Daxingan
Mountain , Xiaoxingan M ountain and Zhangguangcai Mountain.CpDNA rbcL gene of materials is
analysized by PCR-RFLP and DNA sequence methods.The results suggest their rbcL gene se-
quences are the same and plants of Larix in No rtheast China have same origin.Larix olgensis e-
volved f rom Larix gmelini i in systematic evolut ion , so it is suitable to regard Larix olgensis as a va-
riety of Larix gmelinii and the name should be Larix gmelinii(Rupr.)Rupr.var.olgensis(Hen-
ry)Ostenfeld et S.Larsen.
Key words　Larix ;Larix gem linii var.olgensis;rbcL gene;RFLP;systemic evolution
　　中国东北地区天然分布着兴安落叶松和长白落
叶松 ,前者广泛分布于大兴安岭地区和小兴安岭的
中北部 ,后者则以长白山为其分布中心[ 1] 。在两落
叶松分布的中间地带尚有二者的天然杂交个体群存
在[ 2 ,3] 。然而关于长白落叶松的分类学位置 ,长期
以来没有形成一致的观点 ,有人将其作为独立的种
有人将其作为变种[ 4] 。
自从 1977 年 F.Sanger 等开发出碱基测序方
法以来 ,已有很多生物的 DNA 序列得到分析 ,如裸
子植物松科黑松的叶绿体 DNA 的全部碱基序列均
已测出[ 4] 。然而确定生物的种间分类及系统演化
关系 ,不需测定基因组的全部 DNA序列 ,因为象核
DNA的碱基序列常常容易发生变异 。
叶绿体 DNA (cpDNA)的碱基序列分析被广泛
用于确定生物属或种间差异其原因在于其碱基序列
比较稳定 ,尤其是 rbcL 基因(编码 1 ,5-二磷酸合
同糖羧化酶/加氧酶大亚基)的保守性极强 ,碱基的
置换速度非常缓慢 ,有报道称每百万年只有 0.5-
第一作者简介:石福臣(1966-),男 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事植物生态学 、分子生物学研究。
高等学校骨干教师研究项目 , No.1073及博士后研究项目 No.LRZ98001
收稿日期:2001-4-18
0.6个碱基发生突变[ 5] 。因此 ,本研究应用 PCR-
RFLP法 ,对东北地区的落叶树属植物 cpDNA 的
rbcL 基因序列进行了分析 ,以进一步从分子水平探
讨长白落叶树的分类位置及其与兴安落叶松间的系
统演化关系。
1.材料与方法
1.1　供试材料
兴安落叶松材料取自大兴安岭地区的塔河林业
局 、松岭林业局和小兴安岭地区的鹤北林业局 、东北
林业大学凉水实验林场。长白落叶松材料取自位于
长白山脉的黑龙江省东京城林业局的小北湖林场 、
苇芦河林场。
1.2　总 DNA 的提取
图 1　第一次 PCR扩增结果
Fig.1 The result of the first mulplication
1:塔河　2:苇芦河　3:小北湖　4:凉水　5:鹤北　 6:松岭
1.Tahe;2.Luw eihe;3.Xiaobeihu;4.Liangshui;5.Hebei;6.S ongling
图 2　第二次 PCR扩增结果
Fig.2 The result of the second multiplication
1:塔河 2:苇芦河 3:小北湖 4:凉水 5:鹤北 6:松岭
1.Tahe;2.Luw eihe;3.Xiaobeihu;4.Liangshui;5.Hebei;6.S ongling
对上述 6地点的材料 ,每地点取 3 个体的鲜针
叶 , -40℃冰箱中保存。总 DNA 的提取采用改良
的CTAB法[ 2] 。
1.3　rbcL 基因的碱基序列分析及 RFLP 检测
分别以上述 6 产地材料提取的总 DNA 为模
板 ,进行第一次 PCR扩增 。引物采用引物 1:5-
GTCGGATTCAAAGCTGGTGT -3和引物 2:5-
TCACAAGCAGCAGCTAG TTC-3,这是用于扩增
落叶松属植物 rbcL 基因(1309bps)的特定引物[ 6] 。
PCR反应体系参照了白石[ 7] 。
以第一次 PCR扩增的产物为模板应用另一对
引物 , 即 引 物 3:5- ATGGTATCCAAGTA-
GAAAGAGA-3和引物 4:5-CGGTGGATGT-
GAAGAAGTAG-3进行 nested PCR扩增。对产物
结果(1309bps)进行精制后 ,送上海生工进行测序。
白石[ 6]在对日本落叶松和长白落叶松的 rbcL
基因碱基序列分析时 ,发现两者在第 541 和第 713
处发生置换。我们也应用限制性内切酶 TthHB8I
对第二次 PCR产物进行消化 ,以检测第 541处碱基
变异的有无。
东北地区落叶松属植物 rbcL 基因的 RFLP分析
Fig.4 RFLP analysis of rbcL gene of Larix in Northeast China
1.Tahe;2.Luw eihe;3.Xiaobeihu;4.Liangshui;5.Hebei;6.Songling
2.结果与分析
2.1　rbcL 基因的碱基序列分析
利用引物 1和引物 2对采自大 、小兴安岭及长
白山 6个地点的落叶松材料的全 DNA进行第一次
PCR扩增时 ,成功地获得了相同大小的 DNA 谱带
(1309bps , 图 1)。以第一次 PCR产物为模板 ,利用
引物 3和引物 4进行第二次 PCR扩增时 ,也成功地
获得了相同大小的 DNA 谱带(384bps , 图 2),说明
这两组引物用于扩增落叶松属植物的 rbcL 基因是
有效的。
将第二次 PCR扩增产物精制后 ,送上海生工进
行测序 ,其结果见图 3 。
图 3 是 rbcL 基因的一个片段 , 其长度为
384bps ,取自 6个地点的落叶松材料所测得的该片
段的碱基序列均相同 ,并与日本学者白石所测得的
取自长白山的材料的该片段的碱基序列相吻合。说
明在大 、小兴安岭及长白山分布的落叶松中 rbcL 基
因的碱基序列未发生置换 ,保持着高度的一致性。
2.2　rbcL 基因的 RFLP 检验
限制性内切酶 T thHB8I 的识别位点是 TCGA ,
372 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
应用此限制性内切酶 ,在检验日本落叶松和长白落
叶松的 rbcL 基因时是有效的 ,因为在 540 ～ 543处 ,
长白落叶松有它的识别位点 TCGA ,而日本落叶松
是 TTGA即 541处的 C 被置换成了 T 。本实验用
TthHB8I消化第二次 PCR产物后 ,6个地点的材料
均得到了 2 条 DNA 谱带(约 110bps 和 270bps ,图
4),说明分布于大 、小兴安岭及长白山山脉的落叶松
属植物 rbcL 基因在541碱基处均未发生碱基置换 ,
测序结果正确 。
430 489
TAAATTGAAC AAATATGGCC GTCCTTTATT GGGATGTACT ATCAAACCAA AATTGGGTCT.......... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... ..........
490 549
ATCGGCTAAG AACTATGGTA GAGCAGTTTA CGAATGTCTC CGTGGTGGAC TCGATTTTACC.......... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... ..........
550 609
CAAGGATGAT GAGAACGTAA ATTCCCAACC ATTCATGCGC TGGAGAGATC GTTTTGTCTT.......... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... ..........
610 669
TTGTGCGGAA GCACTTTATA AGGCTCAGGC TGAGACGGGT GAAATTAAGG GACATTACTT.......... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... ..........
670 729
GAATGCTACT GCAGGTACAT GTGAAGAAAT GATGAAAAGG GCAGTATTTG CAAGAGAATT.......... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... ..........
730 789
GGGAGTTCCT ATCGTTATGC ATGACTATCT GACGGGAGGT TTTACTGCAA ATACTTCTTT.......... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... .................... .......... .......... .......... .......... ..........
790 814
GGCTCATTAT TGCCGAGACA ACGGC 1.......... .......... .....2.......... .......... .....3.......... .......... .....4.......... .......... .....5.......... .......... .....6
图 3　东北地区落叶松植物 rbcL基因部分片段的碱基序列
Fig.3 The base sequence of partial rbcL gene segment of Larix in Northeast China
1:塔河 2:苇芦河 3:小北湖 4:凉水 5:鹤北 6:松岭
1.Tahe;2.Luweihe;3.Xiaobeihu;4.Liangshui;5.Hebei;6.Songling
3.讨论
3.1　东北地区落叶松属植物的起源与演化
研究植物的起源与演化最有力的证据无疑是化石
资料。落叶松属最古老的化石仅产于第三纪欧亚大陆
西北部 ,其他各地的化石均出自第四纪以后[ 8] ,因此支
持落叶松属为单起源的较多[8 ,9] 。认为最早的落叶松
起源于北欧 ,似今天的欧洲落叶松(Larix decidua
Mill),欧洲落叶松朝两个方向演化 ,一支向东南最后到
达我国的西南地区 ,发展成生长在高山的长果类群;另
一支向东演化发展成西伯利亚落叶松(L .sibirica
Ledeb.),到达东西伯利亚后发展成为兴安落叶松(L .
gmelinii Rupr.),这两种落叶松在分布区临接处有天然
杂交带的形成[ 9] 。兴安落叶松继续向东及东南演化 ,
到达日本列岛发展成日本落叶松(L .kaempferi
Carr.),越过白令海峡到达北美后则发展成北美落叶松
3733 期　　　　　　　　　　　石福臣等:中国东北落叶松属植物 rbcL 基因的序列分析及系统演化＊
(L .laricina K.Koch)进而发展成生长在北美西部高
山的长果落叶松类群。
分布在东西伯利亚和中国东北的落叶松是一群分
化最活跃 、种间关系最复杂的类群。由于大范围内的
近乎连续性分布 ,使得某些分类学特征发生变异 ,造成
种间关系和分类位置的确定非常困难[ 5 ,6 ,9 , 10 ,11] 。
通过保守性极强的 cpDNA的 rbcL 基因序列分
析 ,证明中国东北部分布的落叶松属植物有共同的起
源。对兴安落叶松和长白落叶松应用 RAPD分析也只
能得到有限的差异[ 2] 。因此可以推测长白落叶松是起
源于早期的兴安落叶松 ,可能是早期的兴安落叶松沿
东西伯利亚向东演化的同时 ,沿现俄罗斯的沿海地区
向南延伸到达奥尔加和长白山地区 ,形成现今的长白
落叶松。虽然兴安落叶松和长白落叶松分布区较近 ,
但由于早期的兴安落叶松发展延伸到大兴安岭和延伸
到长白山地区的途径和所需的时间不同 ,演化过程中
所经历的气候环境和地质条件也有各自特点 ,因此造
成兴安落叶松和长白落叶松在外部形态特征上的少量
差异 ,如长白落叶松当年生小枝有白粉等是可以理解
的。分布于长白山地区的长白落叶松在向外扩展的过
程中 ,在张广才岭山地接受来自北部兴安落叶松的花
粉 ,因此在该地形成了两者天然杂交的个体群 ,这些个
体群常和长白落叶松混生 ,表现出球果大 、种鳞数目
多、生长速度快等特征。[ 2]这也就是该地区存在的被认
为是长白落叶松的变种海林落叶松。
3.2　对东北地区落叶松属分类的处理意见
根据本实验结果和上述分析 ,作者认为长白落叶
松应列为兴安落叶松的变种 ,合法的种名为 Larix
gmelinii Rupr.var.olgensis Ostenf.et S.Larsen ;海林
落叶松也应列为兴安落叶松的变种 ,种名为 Larix
gemelinii Rupr.var.hei lingensis(Y.L.Chou)F.Shi ,
comb.nov.— Larix olgensis var.heilingensis Y.L.
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