全 文 ：第 24卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　10月
Vol.24　No.4　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2004
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30170076)和黑龙江省教委骨干教师资助项目
第一作者简介:沙伟(1964—),女 ,教授 ,从事苔藓植物染色体和遗传多样性研究工作。
收稿日期:2004-02-09
藓类植物 RAPD反应体系的建立
沙　伟1 　李　晶1　曹　同2 　苏晓明1
(1.齐齐哈尔大学生命科学与工程学院 , 齐齐哈尔　161006)
(2.上海师范大学生物系 , 上海　200234)
摘　要　本实验针对 RAPD反应体系中 Taq聚合酶 、dNTP 、模板和引物等影响较大的因素 ,设计了
一组 4因素 4水平的正交试验。根据试验结果 ,筛选出了藓类植物 RAPD反应体系中这 4个因素
的最佳浓度配比 ,并在此基础上从 100个随机引物中筛选出了 30条显示藓类植物遗传差异的多
态性引物 。
关键词　藓类植物;RAPD;随机引物;遗传差异
Establishment of RAPD reaction system on the moss
SHA Wei
1　LI Jing1　CAO Tong2　SU Xiao-Ming1
(1.Department of Biology , College of Life Science and Engineering , Qiqihar University , Qiqihar　161006)
(2.Department of Biology , Shanghai Normal University , Shanghai　200234)
Abstract　To obtain the optimum random amplified polymorphic DNA(RAPD)reaction system , one test was
designed to screen the suitable concentration of 4 factors(Taq ,dNTP ,primer ,TemplateDNA)at 4 levels in the
reaction system.According to the results we obtain the optimum concentration of the four factors of moss.On
the basis of this we attain 30 polymorphic primers showing genetic differences among moss were screened from
100 random primers.
Key words　moss;random amplified polymorphic DNA;random primers;genetic differences
RAPD (Random amplified polymorphic DNA , 随
机扩增多态性 DNA)是由Williams和Welsh于1990
年首先提出[ 1 , 2] ,它以多聚酶链式反应(PCR)为基
础 ,用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物 ,扩增
基因组中不同位点的 DNA , 进而得出等位位点的
多态性。此技术操作简便 、成本低 ,检测快速 ,目前
在生物学的许多领域都得到广泛的应用 ,如遗传图
谱构建 ,基因定位和克隆 ,外源导入基因的示踪 ,物
种亲缘关系和进化关系的研究等 ,这项技术已经成
为了一种广泛的分子标记技术。但此技术也有不
足之处 ,反应过于灵敏 ,反应体系的微小变化均可
影响扩增结果 。但如果把条件标准化 ,可以获得好
的实验结果。目前文献报道均采用单因素设
计[ 3～ 6] ,即对 RAPD反应体系中的主要因素逐次进
行优化 ,最后确定出最佳组合 。我们在对藓类植物
遗传多样性的研究中 ,根据统计学方法中的正交原
理对 RAPD反应体系中模板浓度 、dNTP 浓度 ,引物
浓度 、Taq酶浓度及扩增反应的退火温度这些影响
较大的因素进行了研究 ,从而建立了适合于藓类植
物 RAPD反应的最佳反应体系 ,为应用 RAPD技术
对藓类植物遗传多样性的研究奠定了基础。此研
究在国内尚未见相关报道。
1　材料和方法
1.1　供试材料
2002年 9月从黑龙江丰林国家级自然保护区
采集到的粗叶泥炭藓(Sphagnum squarosum)、东亚
万年藓(Climacium japonicum)、细叶金发藓(Poly-
trichum longisetum)、3 种苔藓植物 , 一部分室内栽
培 ,另一部分经处理后保存于-80℃的超低温冰箱
中备用。
1.2　DNA提取和检测
参见 Murry 和 Thompson 方法并加以改进[ 7] 。
取新鲜或解冻后的材料100 ～ 200 mg ,经蒸馏水反
复冲洗干净 ,在滤纸上吸干水份后放入1.5 mL Ep-
pendorf管中 ,用自制的圆头玻璃棒快速地将植物组
织研磨成匀浆状 ,加入700μL预热的CTAB缓冲液 ,
再加入7μL RaseA储备液(10 mg/mL)混匀 , 65℃保
温1 ～ 2 h ,期间不时轻轻地颠倒混匀。待冷却到室
温后7 000 g离心6 min ,将上清液移入另一 Eppen-
dorf管中 ,加入等体积的氯仿/异戊醇 ,缓慢颠倒离
心管使内含物充分混匀至呈乳浊状 , 15 000 g室温
离心15 min(温度过低 CTAB 会出现沉淀 ,使 DNA
损失), 吸取水相转移于另一1.5 mL Eppendorf 管
中 ,加入 1/5体积的10 mol/L乙酸铵溶液(使其终
浓度为 2 mol/L)和 2 倍体积的 95%乙醇 , 置于
-20℃至少30 min或过夜 ,在10 000 g离心15 min ,
收集沉淀 ,置室温下自然风干 , 然后加入800 μL
70%乙醇洗涤沉淀(7 000 g离心15 min)去除残留
的无机离子 ,在室温下自然风干直至无乙醇味 。加
入100 μL TE缓冲液溶解 DNA 沉淀 ,沉淀难于溶
解 ,可放入65℃水浴中5 min ,促进 DNA的溶解 ,然
后置于-20℃储藏或放入4℃备用。
DNA浓度的标定:将样品稀释后于 Gene Spec1
型核酸检测仪上测定 OD260 nm/OD280 nm , 并结合
1.0%琼脂糖平板电泳比较确定其含量和完整性 ,
然后以 ddH2O稀释至100 ng/μL。
1.3　DNA扩增
1.3.1　PCR反应各组分浓度搭配的实验正交
本实验设计 RAPD反应体系为25 μL ,扩增为
引物 SBS-A-10 , 针对反应体系中四个组分摸板
DNA 、dNTP 、引物和Taq酶浓度设计了 L16(44)的正
交实验 ,以便找到最佳组合 。PCR扩增在 PE 公司
的PE9600热循环仪上完成 ,循环程序为:94℃预变
性4 min一次;94℃变性1 min , 36℃退火1 min 30 s ,
72℃延伸 2 min , 循环 43 次 , 最后 72℃后延伸
10 min。25μL扩增反应体系中 buffer 为2.5μL(10
×含20 mmol/L Mg2+)。扩增产物点样到1.5%琼
脂糖凝胶板上 ,电泳后在凝胶分析系统上拍照分
析。各组分浓度水平和各组分正交设计方案见表
1 ,表 2:
表 1　各组分浓度水平
Table 1　The concentration level of different combination
水平 4×dNTP(mmol/L)
引物
(μmol/ L)
聚合酶(U)
TaqDNA
Template
DNA(ng)
1 0.05 0.1 0.50 50
2 0.10 0.2 0.75 100
3 0.15 0.3 1.00 150
4 0.20 0.4 1.25 200
表 2　L16(44)正交实验的因素和水平的处理组合
Table 2　The combination of levels from each factor in
L16(44)orthogonal design
处理
(1)
dNTP
(mmol/L)
(2)
引物
(μmol/ L)
(3)
Taq polymerase
(U)
(4)
DNA
(ng)
1 (1)0.5 (1)0.1 (1)0.50 (1)50
2 (1)0.5 (2)0.2 (2)0.75 (2)100
3 (1)0.5 (3)0.3 (3)1.00 (3)150
4 (1)0.5 (4)0.4 (4)1.25 (4)200
5 (2)0.1 (1)0.1 (2)0.25 (3)150
6 (2)0.1 (2)0.2 (1)0.50 (4)200
7 (2)0.1 (3)0.3 (4)1.25 (1)50
8 (2)0.1 (4)0.4 (3)1.00 (2)100
9 (3)0.15 (1)0.1 (3)1.00 (4)200
10 (3)0.15 (2)0.2 (4)1.25 (3)150
11 (3)0.15 (3)0.3 (1)0.50 (2)100
12 (3)0.15 (4)0.4 (2)0.75 (1)50
13 (4)0.2 (1)0.1 (4)1.25 (2)100
14 (4)0.2 (2)0.2 (3)1.00 (1)50
15 (4)0.2 (3)0.3 (2)0.75 (4)200
16 (4)0.2 (4)0.4 (1)0.50 (3)150
　注:(1)、(2)、(3)、(4)表示不同水平
1.3.2　退火温度
本实验在反应体系各组分浓度正交结果的基
础上 ,对 5 个较好的处理组合 8 、9 、10设计了 3 个
退火温度 ,分别35℃、36℃和37℃,其它条件不变。
1.3.3　引物筛选
选取系统进化和地理位置差异较大的粗叶泥
4834期　　　　　　　　　　　　　　沙伟等:藓类植物 RAPD反应体系的建立
炭藓(Sphagnum squarosum)、东亚万年藓(Climacium
japonicum)、细叶金发藓(Polytrichum longisetum),分
别对北京赛百盛公司生产的A 、B 、C 、D 、P 五组引物
共200条进行筛选。选择的依据是:三个品种都扩
增出条带清晰 、重复性和多态性都好的引物。
2　结果与分析
2.1　正交结果分析
RAPD反应条件主要包括反应体系组成和热循
环状态。由于 RAPD对反应体系要求较严格 ,扩增
反应中诸成分的变化都可能影响到扩增结果。因
此 ,对影响 RAPD反应结果的主要因素:模板 DNA 、
TaqDNA聚合酶 、dNTP 浓度 、引物浓度进行正交试
验 ,确定最优的反应体系是十分必要的。本实验针
对各组分设计了 16组RAPD反应体系 ,经过PCR扩
增后得到了如图 1的结果:处理 9得到的条带最多 、
最为清晰 ,所以我们建立的藓类植物 RAPD反应体
系为 25μL , 每个反应体系中 dNTP 终浓度为
0.15 mmol/L ,引物浓度为0.1μmol/L , TaqDNA 聚合
酶为1.25 U ,Template DNA为200 ng。
同时我们对正交实验的结果进行了分析 ,结果
图 1　35℃正交实验电泳图谱
Fig.1　Electrophoresis of orthogonal experiment at 35℃
表 3　正交实验结果的分析
Table 3　The result analy sis of orthogonal experiment
dNTP 引物 TaqE 模板DNA
T1 8.00 12.00 7.00 13.00
T2 11.00 13.00 15.00 10.00
T3 21.00 13.00 19.00 9.00
T4 10.00 12.00 9.00 18.00
X1 2.00 3.00 1.75 3.25
X2 2.75 3.25 3.75 2.50
X3 5.25 3.25 4.75 2.25
X4 2.50 3.00 2.25 4.50
R 3.25 0.25 3.00 2.25
见表 3。在藓类植物 RAPD反应体系正交实验结果
的分析表中 ,T值代表某因素的某水平在该列出现
的次数所对应的指标数值的总和;X为各列各水平
的平均值;R值为各列的级差(即本列各水平中最
大平均值与最小平均值之差∣ X1-X2∣。
R值的大小反应了该因素对实验结果影响的
大小 ,从表中看出 ,在实验范围内 , 4 个因子中以
dNTP浓度影响最大 ,其余依次为 TaqE 浓度 、模板
DNA浓度和引物浓度 ,引物浓度的影响最小。电
泳结果显示:第 1 ～ 7号实验虽能扩增 ,但条带少 ,5
～ 7 号不清晰 ,效果差 。第 8 、9 、10 、12 、14 、15号产
生的条带多 ,且清晰 ,重复性好 。第 13和第 16号
没有扩增出条带。从反应组合上看 ,第 1 ～ 7号中
主要因子 dNTP 的水平都在 1 或 2;而扩增较好的
第 8 、9 、10 、12 、14 、15号中主要因子 dNTP的水平都
在 3或 4。因此可以认为 ,本实验设计的 4因子 、4
水平的试验中 , dNTP 浓度 、TaqE 浓度和模板 DNA
是主要因子 ,而且在其高水平上有利于获得较满意
的 RAPD结果。引物浓度在低水平就满足需要 ,高
浓度并不能提高实验效果 ,反而造成浪费[ 8] 。
2.2　退火温度对反应体系的影响
在 RAPD反应中退火温度对实验结果的影响
较大。温度过低扩增结果特异性差 ,背景深;温度
过高扩增带减少 ,变弱 ,扩增效率低 。本实验分别
采用35℃、36℃、37℃3个退火温度对藓类植物进
行 RAPD扩增 ,反应体系为正交实验中的 8 、9 、10 、
11 、12 组合 ,实验结果见图 2 ～ 4 , 由三幅图可见
SBS-A-10引物在3 个退火温度上扩增的带型基本
一致 ,但以36℃和35℃扩增效果最好 ,条带清晰 ,多
态性丰富 ,重复性好 ,而37℃下的条带出现了模糊
的现象。为了保证扩增效率 ,同时又要达到增强特
异性的目的 ,我们在以后的实验中使用36℃退火温
度 ,这样既可以增加短核苷酸引物与模板的稳定配
对 ,同时也允许了适当的配错 ,以扩大引物在基因
组 DNA中配对的几率 。
2.3　引物筛选结果
引物的筛选原则应是:取系统进化和地理差异
484 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷
图 2　35℃电泳图谱
Fig.2　Electrophoresis at 35℃
图 3　36℃电泳图谱
Fig.3　Electrophoresis at 36℃
图 4　37℃电泳图谱
Fig.4　Electrophoresis at 37℃
较大的植物进行引物筛选 ,选取扩增条带清晰 、重
复性较好的引物 ,同时用不含 DNA 模板的做阴性
对照 ,要求不产生任何条带。扩增谱带数目应在三
条以上 ,如与空白对照产物具有相同迁移率的带应
视为污染带以与排除 。
选取系统进化和地理差异较大的粗叶泥炭藓
(Sphagnum squarosum)、东亚万年藓(Climacium
japonicum)、细叶金发藓(Polytrichum longisetum),分
别对北京赛百盛公司生产的五组引物共 100条进
行筛选 。共筛选出 30 种条带清晰 、重复性和多态
性都好的引物。这些引物将用于藓类植物的
RAPD实验。
3　结论
在试验中发现不同类型或型号的 PCR仪器 ,
不同的热循环程序 ,不同厂家生产的 Taq酶活性及
不同批次的 Tap酶 、dNTP 和引物质量差异都将影
响反应体系中各因素浓度的配比 。在试验中改变
研究的材料或更换药品都会影响其稳定性 ,任何条
件的变化都会对扩增带型产生影响。为确保试验
的准确性和稳定性 ,当条件变化时应对其重新进行
优化 。不同实验室建立 RAPD反应体系时 ,有必要
进行反应体系中影响因素间的配比筛选试验 ,以便
获得最优的 RAPD反应体系。
本试验筛选出适合藓类植物 RAPD 反应条件
为:在25μL的反应体系中 ,含有200 ng模板 , 2.5μL
的 10×反应缓冲液(含20 mmol Mg2+), 10碱基引
物的浓度为 0.1μmol/L , TaqDNA 聚合酶1.25U ,
dNTP 的浓度为0.15 mmol/L ,PCR反应循环为:94℃
4 min , 1 个 循 环;94℃1 min , 36℃1 min 30 s ,
72℃2 min ,43个循环;72℃延伸10 min ,这一反应
体系和程序是较为合理的。在确定了最佳反应体
系的基础上 ,我们在 100个引物中筛选出 30 条引
物用于研究 20种藓类植物的多态性 。这一适合藓
类植物 RAPD分析的 PCR程序 ,为 RAPD技术应用
于藓类植物遗传多样性研究奠定了基础。
参　考　文　献
1.Williams J G K , Kubelik A R , Livak A F , et al.DNA polymor-
phism amplified by arbit rary primers are useful as genetic mark-
ers.Nucleic Acids Res , 1990 , 18:6531～ 6535
2.Welsh J ,Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with
arbitrary primers.Nucleic Acids Res , 1990 , 18:7213～ 7218
3.李钧敏 ,金则新 , 柯世省.濒危植物七子花 RAPD条件的优
化.植物学通报 , 2002 , 19(4):452～ 456
4.袁庆华, 桂枝 ,张文淑.苜蓿基因组 DNA 提取和 RAPD反
应条件优选.草地学报 , 2001 , 9(2):99～ 105
5.张凤琴 , 徐立新 , 周鹏 ,等.苦丁茶冬青的 RAPD 影响因素
及实验条件的优化.云南植物研究 , 2003 ,26(3):347～ 353
6.王得元 , 张长远 , 殷秋妙.辣椒 RAPD反应体系研究.广东
农业科学 , 2001 , 1:21～ 22
7.Murray M G , Thompson W F.Rapid isolation of high molecular
weight plant DNA.Nucl Acids Res , 1980 , 8:4321～ 4325
8.普晓兰 ,李鹏 ,杜凡.巨龙竹基因组DNA 的提取以及 RAPD
反应条件的优化.昆明理工大学学报 , 2003 , 28(1):127～
131
4854期　　　　　　　　　　　　　　沙伟等:藓类植物 RAPD反应体系的建立