全 文 ：第 24卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　10月
Vol.24　No.4　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2004
基金项目:山西省自然科学基金资助
第一作者简介:仪慧兰(1963—),女 ,博士 ,教授 ,主要从事环境生物学和遗传毒理学研究。
收稿日期:2004-04-21
环磷酰胺诱发蚕豆体细胞遗传损伤的研究
仪慧兰　秦海峰　李红孩
(山西大学环境医学与毒理学研究所 , 生命科学与技术学院 ,太原　030006)
摘　要　利用蚕豆根尖研究环磷酰胺的遗传毒性效应 ,结果表明:环磷酰胺(0.1 ～ 5.0 mg/mL)能
够降低蚕豆根尖细胞有丝分裂指数 ,使根尖细胞中具有微核 、核出芽及核固缩的细胞明显增多 ,并
诱发染色体结构和行为异常 ,产生染色体断片 、滞后和桥。环磷酰胺处理组根尖中具有核固缩和
微核的细胞数呈剂量依赖性增加 ,且与作用时间呈正相关 ,而分裂指数的降低也具有剂量和时间
效应关系 。研究结果表明 ,低浓度长时间接触或高浓度短时间接触环磷酰胺均可产生遗传毒害 ,
因此 ,有关的作业人员应注意防护 。
关键词　环磷酰胺;蚕豆;遗传损伤;微核;染色体异常
Genotoxicity of cyclophsphamide on root tip cells of broad bean(Vicia faba)
YI Hui-Lan　QIN Hai-Feng　LI Hong-Hai
(Institute of Environmental Medicine and Toxicology , School of Life Science and Technology , Shanxi University , Taiyuan　030006)
Abstract　The genotoxic effects of cyclophsphamide(CP)in broad bean(Vicia faba)root tips were investi-
gated.The results indicated that CP caused the mitotic index decrease ,while the frequencies of abnormal
cells , such as chromosomal aberrations(CA)including chromosomal segments , bridges and laggards , mi-
cronucleus(MN), nuclear buds and pycnosis , increased significantly in CP exposed roots.The number of
cells with MN and pycnosis increased with the concentration of the treatments and the length of exposure peri-
ods.But the mitotic index had a negative response to the treated concentration and duration time.Our results
indicated that the exposure to CP at lower concentrations for long duration can cause the same cytogenetic
damage as at high concentrations for short exposure , so we should pay more attention to the occupational ex-
posures.
Key words　cyclophsphamide;Vicia faba;genotoxicity;micronucleus;chromosomal aberration
环磷酰胺是 40 年代人工合成的氮芥类烷化
剂 ,是一种细胞周期非特异性的广谱抗肿瘤药 ,也
是临床上广泛使用疗效确切的肿瘤治疗药物和免
疫抑制剂 。但是 ,由于环磷酰胺具有染色体断裂作
用 ,因而具有致正常细胞突变和癌变的危险。据文
献报道 ,体外环磷酰胺无致突性 ,进入体内后在肝
细胞色素 P450代谢活化后才能发挥烷化作用[ 1] 。
但有关环磷酰胺治疗肿瘤以及期间可能引起的毒
副作用的机理缺乏系统研究。
蚕豆是一种很好的细胞遗传学研究材料 。蚕
豆的染色体组型为六对相当大的染色体 ,根尖含有
较多的分裂相细胞适合显微观察。早在 1959年 ,
已经用蚕豆的根尖细胞来进行 X射线的遗传损伤
研究 。到 70年代 ,蚕豆根尖染色体畸变技术已发
展得相当成熟 ,作为一种检测化学品遗传毒性的方
法被广泛采用 ,不仅具有简便 、经济 、快速和重复性
好 ,灵敏度高的优势 ,而且其检测结果与动物实验
结果具有很高的一致性 。80 年代初 ,世界卫生组
织(WHO)、联合国环境署(UNEP)和美国国家环保
局(US—EPA)相继确定了其在环境化学物致突变
性检测中的作用 , 并建议在全世界范围内推
广[ 2 ,3] ,1986年我国环保局将蚕豆根尖微核实验列
入了水环境生物测试的技术规范[ 4] 。
目前 ,蚕豆根尖细胞遗传毒性实验应用于对水
源 、土壤 、大气等环境中化学有毒物质和环境污染
物的致突变性检测 ,是一个简便 、灵敏 、高效的生物
监测系统[ 5～ 7] 。本文选用由华中师范大学生产的
无污染蚕豆“松滋青皮豆”为实验材料 ,观察环磷酰
胺对蚕豆根尖细胞的遗传损伤效应 ,为研究环磷酰
胺的毒害作用及机理提供实验依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
蚕豆(Vicia faba L.),以华中师范大学提供的
“松滋青皮豆”为材料 。环磷酰胺为上海华联制药
有限公司产品。
1.2　方法
1.2.1　幼苗培养
参照 Kanaya 等的方法[ 8] ,蚕豆种子于23℃蒸
馏水中浸泡24 h ,湿纱布包裹催芽24 h。选萌发的
蚕豆放入垫有湿脱脂棉的培养皿中暗培养 。其间
每12 h经水冲洗后换水培养。根长 1 ～ 1.5 cm时可
用于毒性试验。
1.2.2　药物处理
选根长整齐一致的蚕豆幼苗随机分组 。蒸馏
水作阴性对照 ,环磷酰胺(CP)用灭菌生理盐水配
成 5 mg/mL溶液后 ,以生理盐水配成一组浓度为
5 ,15和 40μg/mL的处理液 ,另用双蒸水稀释成一
组浓度为 0.1 , 0.4 , 1和 5 mg/mL的处理液 。环磷
酰胺处理 24 h和 48 h后 , 于蒸馏水中恢复培养
24 h ,恢复培养前后分别剪取幼根 ,加卡诺氏液固
定 24 h后转入 70%的乙醇中 4℃保存。
1.2.3　根尖细胞制片
取根尖 ,水冲洗后 ,用 Feulgen 法染色 ,常规压
片。每个处理观察 5 ～ 8条根尖 ,每个根尖约1 000
个细胞。
1.3　实验数据的统计分析
显微镜下观察统计每个根尖分生区中的细胞
总数 、分裂细胞数以及具有异常核和异常染色体的
细胞数 ,计算各处理组的平均值和方差 。方差分析
后 ,采用 t 检验 ,检测不同处理组与阴性对照组之
间的差异显著性。
2　结果与讨论
2.1　对分裂指数的影响
统计结果表明(表 1),环磷酰胺处理后蚕豆根
尖细胞分裂指数降低 ,且药物对分裂的抑制强度表
现为对处理浓度和作用时间的双重依赖 ,低浓度组
抑制较弱 ,浓度增高或作用时间延长时对分裂的抑
制作用增强 ,抑制强度最高达到42.76%。
表 1　环磷酰胺对蚕豆根尖细胞分裂指数的影响
Table 1　Effect of cyclophsphamide on mitotic index in broad bean root tip cells
浓度 Concentration
(mg/mL)
24 h
分裂指数 Mitotic index(%) 抑制率 Inhibition rate(%)
48 h
分裂指数 Mitotic index(%) 抑制率 Inhibition rate(%)
0 21.86 - 19.48 -
0.1 22.59 -3.34 17.23 11.55
0.4 21.45 1.886 13.62＊＊ 30.08
1.0 16.86＊＊ 22.87 11.15＊＊ 42.76
5.0 16.14＊＊ 26.17 11.91＊＊ 38.86
　 ＊ P <0.05, ＊＊ P <0.01;下同 The same below
经环磷酰胺处理后 ,蚕豆根尖中(1)间期细胞
增加 ,占根尖细胞的86.38%～ 88.85%,而对照组占
80.52%;(2)前期细胞减少 ,随着处理浓度的增高
前期细胞由对照组的10.11%降为5.61%;(3)中期 、
后期和末期细胞比例相应减少 ,分别由对照组的
4.55%、 2.71%、 2.13%降为 2.30%、 1.63%和
1.64%。实验结果说明 ,环磷酰胺组蚕豆根尖细胞
周期发生了明显变化 ,分裂间期延长;环磷酰胺能
抑制细胞进入分裂态 ,使前期细胞和整个分裂期细
胞数减少 ,导致根尖细胞有丝分裂指数下降。蚕豆
幼根分裂指数与环磷酰胺浓度间具有负相关 ,与环
磷酰胺对小鼠骨髓细胞分裂的抑制结果(另文发
表)相似。
2.2　对细胞核结构的影响
环磷酰胺处理后部分根尖细胞发生核的固缩 ,
同时胞浆变得稀疏 ,以至呈透明状。部分细胞中具
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有微核 ,多数微核细胞为间期细胞 ,占微核细胞的
85%～ 95%,也有处于分裂期的微核细胞。微核细
胞中一般有 1个微核 ,少数有 2个微核 ,个别细胞
具有 3 ～ 5个微核 。有些细胞核具有向胞质凸出同
颜色的不规则芽状结构 ,呈园形 、长球形或枝桠状 ,
作为核芽。对根尖细胞核的镜检结果见表2 ,3 。
表 2　环磷酰胺处理 24 h 诱导的蚕豆根尖细胞核异常
Table 2　Aberrant nuclei in broad bean root cells after exposure to cyclophsphamide for 24 h
浓度 Concentration
(mg/mL)
观察细胞数
Number of scored cells
微核率(‰)
Frequency of micronuclei
固缩率(‰)
Frequency of pycnosis
总异常率(‰)
Frequency of abnormal cells
0 3 344 3.89 10.71 14.60
0.1 4 743 10.20＊＊ 14.55 24.78＊＊
0.4 3 909 15.81＊＊ 18.53＊＊ 34.34＊＊
1.0 3 459 12.72＊＊ 15.56＊ 29.28＊＊
5.0 4 460 15.70＊＊ 44.84＊＊ 60.56＊＊
表 3　环磷酰胺处理 48 h 诱发的蚕豆根尖细胞核异常
Table 3　Aberrant nuclei in broad bean root cells after exposure to cyclophsphamide for 48 h
浓度 Concentration
(mg/mL)
观察细胞数
Number of
scored cells
微核率(‰)
Frequency of
micronuclei
固缩率(‰)
Frequency of
pycnosis
核出芽率(‰)
Frequency of
nuclear buds
总异常率(‰)
Frequency of
abnormal cells
0 4 766 2.78 6.29 1.47 10.54
0.1 3 296 14.24＊＊ 7.10 2.43＊ 23.77＊＊
0.4 4 807 20.85＊＊ 10.64＊ 3.19＊＊ 34.68＊＊
1.0 4 613 25.40＊＊ 31.78＊＊ 9.73＊＊ 66.91＊＊
5.0 4 362 35.49＊＊ 64.84＊＊ 5.81＊＊ 105.94＊＊
表 4　水恢复培养 24 h 对环磷酰胺诱发的蚕豆根尖细胞核异常的影响
Table 4　Effect of 24 h recovery on the abnormal nuclei frequency induction by cyclophsphamide
浓度 Concentration
(μg/mL)
微核率 Frequency of MN(‰)
恢复前 Before recovery 恢复后 After recovery
固缩率 Frequency of pycnosis(‰)
恢复前 Before recovery 恢复后 After recovery
5 7.03 8.02 68.18 31.51＊＊
15 8.84 10.12 73.80 54.46＊　
40 9.41 10.43 142.50 56.31＊＊
从表 2可知 ,环磷酰胺处理组根尖中的微核细胞率
明显增大 ,是对照组的2.6 ～ 4倍;核固缩细胞比率
高于对照 ,是对照组的1.4 ～ 4.2倍。
环磷酰胺作用 48 h时蚕豆根尖中的异常细胞
数同样随着处理浓度的增高而增多(表 3),且核异
常细胞比率高于24 h ,其中根尖微核增幅最大 ,是对
照组的 5 ～ 13 倍 ,核出芽细胞所占比例最低 。与
24 h相比 ,高浓度组的微核增幅明显大于低浓度组 ,
1.0和5.0 mg/mL组固缩细胞显著增加 ,是对照组的
5 ～ 10倍。研究结果表明 ,环磷酰胺的遗传毒害具
有浓度和时间效应 ,高浓度短时间接触或低浓度长
时间接触均会产生较强的遗传毒害作用 ,因此有关
的作业人员要注意操作安全 ,加强防护。
经过 24 h的水恢复培养后 ,根尖细胞的核固缩
表 5　环磷酰胺处理 24 h 诱发的蚕豆根尖细胞染色体异常
Table 5　Chromosomal aberrations in broad bean root tips after exposure to cyclophsphamide for 24 h
浓度 Concent ration
(mg/mL)
染色体畸变率 Frequency of Chromosomal aberrat ions(‰)
桥 Bridges 滞后 laggards 断片 Fragments 总异常 Total aberrations
0 0.63 0 0.55 1.18
0.1 1.01 0.30 3.34＊＊ 4.65＊＊
0.4 1.06 0.66 2.13＊＊ 3.85＊＊
1.0 1.59 1.30 3.54＊＊ 6.43＊＊
5.0 0.62 2.74 2.87＊＊ 6.23＊＊
4414期　　　　　　　　　　仪慧兰等:环磷酰胺诱发蚕豆体细胞遗传损伤的研究
率明显下降 ,而微核细胞的数目略有增加(表 4)。
表明药物处理引起的细胞固缩是一种代谢相对静
止的暂时状态 ,解除药物后部分细胞可以恢复正
常 ,那些不能恢复的细胞可能会向死亡方向发展。
微核细胞的增加可能与恢复期间分裂指数的提高
有关 。
2.3　对染色体结构和行为的影响
环磷酰胺处理组蚕豆根尖细胞中出现了多种
染色体异常(表 5)。在分裂各期均可检测到染色体
粘连细胞 ,中期有染色体和染色单体断片 、游离于
中期赤道板染色体组之外的染色体 ,后期和末期可
见滞后染色体 、断片 、染色体桥和染色单体桥(见图
1)。后期还能看到游离的环状染色体 。
从表 5可以看出 ,环磷酰胺不仅诱发根尖细胞
染色体断裂 ,还使具有滞后染色体的细胞数目明显
增加 ,因此环磷酰胺不仅是染色体断裂剂 ,还是非
整倍体诱变剂 ,能够破坏细胞的纺锤体结构和功
能 ,诱导产生非整倍体细胞。环磷酰胺处理组根尖
微核细胞多于染色体畸变细胞 ,表明根尖微核除了
来源于染色体断裂 、滞后外 ,还有其它来源 ,如核出
芽可能产生微核细胞 。
由滞后染色体产生的微核具有整条染色体 ,是
细胞中的大型微核 ,由染色体片段组成的微核为小
型微核。由表 4可知 ,0.1 ～ 1.0 mg/mL处理组染色
体断片占总异常的65%～ 90%,明显多于滞后染色
体 ,因此 ,根尖中具有小型微核的细胞数应多于大
型微核细胞数 ,该结果与微核观察结果相符 ,并与
杨明杰等人用免疫标记动物染色体的实验结果吻
合[ 9] ,说明植物系统与动物系统对环磷酰胺的毒性
反应具有一致性 。
根尖细胞中的微核和核固缩是环磷酰胺诱发
的主要异常。微核的产生是遗传结构的一种不可
逆改变 。细胞核是基因转录和翻译的重要场所 ,核
的固缩标志着基因转录活性的降低 ,并可能由此影
响细胞的生理和代谢 。脱离环磷酰胺后 ,部分细胞
能够解除固缩 ,恢复正常 , 表明固缩具有可逆性 。
医学上采用高剂量(400 ,800 mg/kg.wt)注射治疗免
疫过敏症[ 10 ,11] ,可能与高剂量环磷酰胺抑制细胞分
裂 、诱导细胞核固缩有关 ,还可能与遗传结构变异
引起的基因活性改变有关 ,染色体断裂与重新愈合
可能导致一些基因的失活或激活 ,核基因的缺失和
部分基因的表达改变 ,都会影响细胞的代谢和生
存 。
参　考　文　献
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