全 文 ：植 物 研 究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 19 卷 第 2 期 1999 年 4 月
Vol.19 No.2 April , 1999
红松 RAPD实验中各组成成份含量对实验结果的影响
张恒庆1 安利佳2 祖元刚1
(1.东北林业大学森林植物生态学开放研究实验室 , 哈尔滨 150040)
(2.大连理工大学化工学院 , 大连 116001)
摘 要 本文采用 Promega的 PCR反应系统 ,以从红松幼叶中提取的总 DNA为模
板 ,进行随机扩增多态 DNA(RAPD)实验 ,分别测试了镁离子 、dN TP 、模板 DNA ,引
物和 DNA聚合酶含量对反应结果的影响 ,通过各因子的组合实验 ,确定了红松最
佳的 RAPD反应体系 。
关键词 红松;RAPD;成分
EFFECTON THE EXPERIMENTAL RESULTSOF
THE CONTENTOF COMPOSITIONS IN RAPD
EXPERIMENTOF PINUS KORAIENSIS
Zhang Heng -qing1 An Li-jia2 Zu Yuan-gang1
(1.Open Research Laboratory of Fo rest Plant Ecology , Northeast Forestry Univ., Harbin 150040)
(2.Chemical Institute , Dalian Science and Technology Univ., Dalian 116001)
Abstract The PCR reaction system by Promega w as employed.The DNA templates
of Pinus koraiensis ext racted from young needles were amplified in RAPD.The ef fect
of content of Mg2+ , dNTP , DNA templates , primers and DNA polymorase on experi-
mental results were tested and the optimal reaction sy stem of RAPD for korean pine
was determined.
Key words Pinus koraiensis;RAPD;Composition
随机扩增多态 DNA (Random Amplified Polymo rphic DNA 简称 RAPD)分析是建立在
PCR反应基础上的一种新的分子生物学技术 ,它是利用人工合成的较短的随机序列寡核苷
黑龙江省杰出青年科学基金资助项目。 收稿日期:1997-3-10
酸片段作为引物 ,对基因组 DNA进行的 PCR反应。模板 DNA经 92℃～ 94℃变性解链后 ,
在较低的温度下(35℃～ 37℃),根据碱基互补法则 ,单个随机引物退火到模板 DNA两条反
向链的不同位置上 ,与模板上引物互补的位点形成的双链结构 。在有 DNA聚合酶的条件
下 ,dN TP从引物的 3′端渗入 ,接上与模板 DNA互补的各种单核苷酸 ,延伸得到一段新的互
补的 DNA片段 。在基因组中 ,某一引物可能会与模板 DNA 之间有多个互补的位点 ,但是 ,
只有某两个结合位点之间的距离在可扩增的长度范围内(200 ～ 4000bp);而且分别位于互补
的两条单链上;引物的 3′端相对 ,在这种情况下 ,通过 PCR反应才能得到一个扩增产物〔1〕 。
RAPD分析在技术上操作简单 ,只需迹量的 DNA模板就可进行分析。在目前 DNA 直
接测序尚未能大规模开展的条件下 , RAPD分析可以为研究者快速高效地提供基因组位点
的多态性资料。其另一个重要的优点就是 RAPD分析的引物通用性强 ,可以用一套随机引
物来检测任何分类单元的个体 。它不像 PCR反应那样需要预先知道基因组 DNA 的部分序
列 ,也不像 RFLP 那样 ,需要有物种的特异探针。因此 , RAPD分析非常适合于涉及大规模
样品 ,以种群为单位的遗传学研究〔2 , 3〕。
虽然 , RAPD分析具有快速 、简便 、灵敏度高 、价格低廉等优点 ,但其最佳扩增条件在不
同的研究中有较大的出入 ,RAPD分析所得出的结论在某些类群中与经典的研究方法所得
的结果很吻合〔4〕 ,而在另一些类群中则相差甚远〔5 ,6〕 ,由此引发了对其重复性问题及科学价
值的争论〔7〕。对红松种群进行 RAPD分析 ,首先要建立稳定的反应体系 ,这样才能将 RAPD
的谱带用于种群内 ,种群间的遗传差异比较。因此研究影响红松 RAPD实验的各种因素 ,
建立可重复的 RAPD 反应体系对确保实验结果的准确性至关重要。为此 ,我们就红松
RAPD反应中的 dNTP 浓度 ,Taq酶单位 ,镁离子含量和模板浓度等因素对实验结果的影响
进行了实验 ,建立了重复性强 ,稳定的红松 RAPD反应参数 ,为进一步大量的种群实验提供
了一个标准化程序。
1 材料与方法
1.1 DNA 模板制备
将采自凉水国家自然保护区的 5个个体的红松幼叶混合 ,材料磨碎后 ,按 CTAB法提取
总 DNA 。粗提的 DNA 用 RNase A 和蛋白酶 K 纯化处理后 ,经紫外分光光度计(DU -T
型)和琼脂糖凝胶电泳-EB染色的荧光强度 ,双重测定 DNA浓度 ,以已知浓度的λDNA 为
对照 ,确定 DNA的含量和分子量 。用于 PCR反应的模板用 0.1×TE稀释后备用 。
1.2 RAPD反应程序
参照Willms的 RAPD反应程序。摸索出适合红松 RAPD 反应的程序:先在 94℃加热
5min ,使模板 DNA充分变性 ,然后进入下列温度循环:94℃变性 40S;36℃复性 1min ,72℃
延伸 2min ,共进行 45个循环 ,最后一个循环在 72℃保持 7min使 DNA 片段得到完全延伸。
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1.3 红松 RAPD实验中各反应因子含量的梯度组合
1.3.1 Mg2+含量
选择合适的Mg 2+浓度 ,对PCR反应至关重要 。镁离子浓度可能影响到引物退火温度 ,
扩增产物特异性的强弱 ,引物二聚体的形成以及 DNA 聚合酶活性和精确度等诸多方面。
一般 PCR反应所使用的镁离子浓度在 0.2 ～ 2.5mmol/L 之间〔8〕 ,本研究参照标准的 PCR
184 植 物 研 究 19 卷
反应中各成份的含量 ,设计了 Mg2+浓度梯度 ,反应中 Mg2+浓度及试验结果见表 1。
表 1 Mg2+浓度对 PCR结果的影响
Table 1 Effect of Mg2+ concentration on PCR reaction
Mg2+
(mmol/ L)
Template 100ng Primer 5p mol Taq 2.5u dNT P 200μmol/ L
0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
结 果
Results
OPI-14
OPP-04
-
-
+/ -
+/ -
+
+
++
++
++
++
++
++
+/ -
+/ -
+/ -
+/ -
注:+表示有扩增产物;++表示扩增效率高;+/ -表示扩增产物不稳定。
1.3.2 底物 dNTP 含量
dNTP是作为 PCR反应的原料参予新链 DNA 的合成过程 ,一般使用浓度在 50 ～
200μmol/L 之间 ,过高的 dN TP 浓度会导致聚合酶错误的掺入。使用较低的 dNTP 浓度比
使用高浓度 dNTP 会减少聚合酶在非靶位置的启动和延伸时核苷酸的错误掺入 ,可提高特
异性与精确性。但过低的 dNTP 浓度又会影响合成效率 ,甚至会因 dNTP 过早消耗尽而使
产物单链化 ,而影响扩增效果。本研究在 20 ～ 250μmol/L 之间 ,设置了 dN TP 浓度梯度 ,反
应中 dN TP 浓度及试验结果见表 2。
表 2 dNTP含量对 PCR的影响
Table 2 Effect of dNTP concentration on PCR reaction
dNTP 含量
(mmol/ L)
dNTP content
Template 100ng Primer 5p mol Taq 2.5u dNT P 200μmol/ L
20 50 75 100 125 150 200 250
结果
Results
OPI-09
OPP-18
-
-
+/ -
+/ -
+
+
++
++
++
++
++
++
++
++
+/ -
+/ -
注:+表示有扩增产物;++表示扩增效率高;+/ -表示扩增产物不稳定。
1.3.3 模板 DNA 含量
模板 DNA的含量是制约扩增产物得率及特异性的另一个重要因子 ,模板含量过低 ,分
子碰撞的机率低 ,偶然性大 ,扩增产物无或不稳定;模板含量过高 ,又会相应增加非特异产物
的扩增 ,造成弥散型电泳结果 。本实验在 0.2 ～ 360mg 之间设置了模板 DNA 含量梯度 ,各
反应中 DNA含量及实验结果见表 3 。
表 3 模板浓度对 PCR结果的影响
Table 3 Effect of template concentration on PCR reaction
模板浓度
(ng/ 20ul)
Template
concent ration
Primer 5p mol Taq 2.5u dNTP 200μmol/ L Mg2+2.0m mol/ L
0.2 2 20 40 80 120 240 300
结果
Results
OPI-16
OPP-04
-
-
+
+
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
+/ -
+/ -
注:+表示有扩增产物;++表示扩增效率高;+/ -表示扩增产物不稳定。
1852 期 张恒庆等:红松 RAPD实验中各组成成份含量对实验结果的影响
1.3.4 DNA聚合酶含量
在 PCR反应中 ,使用高浓度 DNA聚合酶(Taq)不仅会造成经济上的浪费 ,而且容易产
生非特异扩增产物积累 ,影响实验结果;Taq含量过低使新链的合成效率下降 ,导致扩增产
物减少 。Taq的用量还与模板的质量有关 ,不同厂商提供的 Taq的活性也不尽相同 ,一般随
机扩增反应中 , Taq酶的用量在 0.5 ～ 5u之间。本实验所设置的 Taq含量梯度及实验结果
见表 4。
表 4 Taq酶含量对 PCR结果的影响
Table 4 Effect of Taq concentration on PCR reaction
Taq浓度
(U)
T aq concentrat ion
Template 100ng Primer 5p mol dNTP 200μmol/ L Mg2+2.0mmol/ L
0.5 0.8 1 1.5 2 2.5 3 3.5
结果
Results
OPI-16
OPN-07
+/ -
+/ -
+
+
++
++
++
++
++
++
++
++
+/ -
+/ -
注:+表示有扩增产物;++表示扩增效率高;+/ -表示扩增产物不稳定。
1.3.5 各因子组合实验
根据上述 4个单位因子对 RAPD实验结果的影响程度 ,确定了各成份的基本含量范
围 ,设计这 4个因子交互组合对红松 RAPD的实验效果 ,结果见表 5。
表 5 影响红松随机扩增 PCR反应中各因子组合实验
Table 5 Effect of every factor composition on PCR reaction
Primer 5Pmol
Mg2+ 1.5m mol/ L
dNTP 100μmol/ L 150μmol/ L
Taq(U) 1 1.5 2 1 1.5 2
template 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20
ng/ 20μl 40 100 40 100 40 100 40 100 40 100 40 100
结 OPG-18 +/- ++ + ++ ++ ++ ++ +/- + ++ + ++
++ +/ - +/ - +/ - +/ - +/ - +/ - +/- ++ +/ - +/ - +/ -
果 OPI-09 - ++ ++ ++ ++ ++ + ++ + ++ + ++
++ +/ - ++ +/ - ++ +/ - ++ +/- ++ +/ - ++ -
Mg2+ 2.0m mol/ L
dNTP 100μmol/ L 150μmol/ L
Taq(U) 1 1.5 2 1 1.5 2
template 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20
ng/ 20μl 40 100 40 100 40 100 40 100 40 100 40 100
结 OPG-18 + + + ++ ++ ++ ++ ++ + + ++ +/ -
++ +/ - ++ +/ - +/ - +/ - +/ - +/- ++ +/ - +/ - -
果 OPI-09 ++ ++ + ++ ++ + + ++ - + ++ ++
++ +/ - ++ +/ - ++ +/ - ++ +/- ++ +/ - +/ - -
注:+表示有扩增产物;++表示扩增效率高;+/ -表示扩增产物不稳定。
186 植 物 研 究 19 卷
2 结 果
本实验各因子浓度梯度的 RAPD反应结果见表 1 、2 、3 、4 。反应系统中 Mg2+的浓度不
仅影响 PCR扩增的强度 ,也会影响到扩增谱带的带型 ,通过浓度梯度实验 ,我们发现在 1.5
～ 2.5mmol/L 浓度下都扩增出了清晰的带 。但 2.5mmol/ L 条件下带子的重复性不如 1.5
和2.0mmol/L 。浓度在 0.2mmol/L 条件下无扩增产物;在 0.5mmol/ L 时扩增带少 ,在 3.
5mmol/L 扩增带呈弥散状态 。
对不同含量的 dNTP 实验结果表明 ,在 75 ～ 200mmol/L 的 dN TP 含量有扩增产物出
现 ,扩增带型在 100 ～ 150mmol/ L之间基本没有变化 ,在 250mmol/L 时扩增带型不稳定。
本研究中发现红松随机引物 PCR反应对模板含量的许可范围很大 。在本系统中 ,从
20 ～ 240ng 的模板含量均扩增出了基本相同的带型 ,但超过 240ng 以后 ,扩增出现弥散现
象。Taq酶的使用量是影响随机扩增实验的一个重要因素 ,而且 Taq酶的用量与反应系统
中其它成份的纯度 、含量也有关系 ,本实验在 20ul反应体积中使用 1 ～ 3单位时 ,均有扩增
产物出现 ,但在 2.5和 3u扩增非特异性增强 。
影响随机引物 PCR反应的因素很复杂 ,有些作用机制尚未完全搞清。实验结果的质量
是由反应中各因子共同作用决定的 ,本研究经过对影响实验结果的各因子交互组合实验 ,最
终确立了红松的 RAPD反应体系为:
10×reaction buffer 2ul
dN TP 1ul(100mmol)
Mg
2+ 1ul(1.5mmol)
Primer 1ul(5pmol)
Taq 0.2ul(1U)
ddH2O 13.8ul
Template 1ul(20-40ng)
Total 20ul
3 讨 论
影响 RAPD分析中的 PCR扩增因素是复杂的 ,通常情况下 ,影响特异引物 PCR扩增的
条件对随机引物 PCR的扩增都有影响 ,随机引物 PCR的主要特点是引物较短 ,为了保证退
火后引物与模板结合的稳定性 ,在扩增程序中采用了较低的退火温度 。较低的退火温度在
保证引物与模板结合的稳定性的同时 ,也会使引物与模板之间未完全配对的一些位点间得
到扩增 ,即产生一定的错误扩增。由于错配的引物位点产生的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳
上是很难分辨的 ,有时也会将它作为可靠的 RAPD标记进行分析 。退火温度不同 ,产生错
配的程度也不相同。因此 ,在某种条件下能产生的扩增带 ,在另一种条件下可能就不会出
现〔9〕 。
由引物自身特点导致的错误配对而出现的误差在 RAPD分析中是允许的 ,但由于错配
的位点是随机的 ,错配所产生的扩增片段的稳定性是较差的 ,因此 ,我们可以通过重复实验
和在分析时只分析那些扩增效率高 ,稳定性强的片段来减少这种误差 。
1872 期 张恒庆等:红松 RAPD实验中各组成成份含量对实验结果的影响
除了引物原因外 ,反应系统中其它成分的含量和质量也都会直接影响到 PCR扩增的结
果。因此 ,Ausubel曾称:对于给定的引物和模板 , PCR扩增的条带数在一定程度上可以通
过控制反应条件而得到调控。但是 ,只要我们在进行随机引物 PCR反应时严格控制反应条
件 ,保证所有反应都在同一个系统下完成 ,并使用同一批号的 Taq酶 ,相同的扩增程序 ,就
能排除这些系统误差 。另外 ,进行 RAPD扩增时 ,重复实验也是保证其准确性的一个必要
条件 。
参 考 文 献
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3.Avise J.C.Molecular makers natural history and evolut ion.New Phytol., 1994 , 126:403～ 418
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188 植 物 研 究 19 卷