全 文 ：植 物 研 究
B U I
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E T IN O F BO T A N IC A L R E SE A R CH
第 19 卷 第 4 期
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.
19 N o
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4
19 99 年
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10 月
1999
杜仲胚乳衰退过程中程序性细胞死亡的研究 `
汪 矛 `
( 1
. 中国农业大学生物学院 , 北京
崔跃华2 孙克莲`
1 00 09 4 ) ( 2
. 中国科学院植物研究所 ,北京 1 0 0 09 3 )
摘 要 杜仲胚乳在衰退过程中显示 出 了程序性细胞死亡的特征 : 细胞质 出现原位
自溶 , 细胞器呈现不 同程度 的解体 ;环状 片层吞噬 并分隔细胞组分 ; 细胞核形 态异
常 , 并出现环状核仁和致密型核仁 ; D N A 解体 , 电泳 显示 出施尾状 的条带 。 胚根端
和 昨胚根端胚乳 细胞在进入程序性死亡 的时 间上有先后 。
关键词 杜仲 ;胚乳 ; 程序性细胞死亡
S T U D I E S O N T H E P R O G R A M M E D C E L L
D E A T H I N T H E P R O C E S S O F E N D O S P E R M
D E G E N E R A T I O N I N I N E U C O 几J M I A U L M O 刃O E S O L I V
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( 1
. 肠 lle罗 o f B io l眼 ie a l cS ie n e es , C h in a A g r i e u l t u ar l U n iv e r s it y , eB ij i n g 1 00 0 9 4 )
(2
.
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d e g r e e ; A n n u la t e l a m
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.
K ey w o川 5 E u co m m i a u l m o i d e s O l iv ; E n do s Pe mr ; P r o g ar m
e d eC l l eD
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细胞死亡在广义上分为坏死性死亡 ( N ec or is s )和 程序性死亡 ( P or g ar m m ed eC U eD at h,
· 国家自然科学基金资助项目 ( N o . 3 9 5 7 0 4 6 3)本文承蒙郑相如教授提出宝贵意见 , 谨此致谢 。收稿 日期 : 29 9 8 一 9 一 9
植 物 研 究 1 9卷
P c D)阁 。 在生物组织中 , 单个细胞受其内在基 因编程的调控 , 通过主动的生化过程而 自杀
死亡的现象 , 称程序性细胞死亡 。 90 年代初细胞程序性死亡这一概念被引入植物界 , 并把
管状分子发育成熟过程称为细胞程序性死亡 〔` 7〕 。 此后国外的许多学者 〔`2 , `4] 在研究细胞寿
命和死亡时都一致认为 , 植物细胞的衰老 , 果实的成熟 , 韧皮部 , 木质部和心皮的形成过程以
及性别决定等等都是细胞的程序化死亡 。 但由于植物生长发育和细胞结构的特殊性及方法
学上的困难 , P CD 在植物方面的研究还远远落后于动物方面 。 本试验通过对杜仲 ( E u co m -
m 故 ul m沉己` ` Ol iv . ) 。 胚乳衰退过程中细胞超微结构及生化方面的研究 , 探讨杜仲胚乳细胞
程序性死亡的发生及其变化 , 为植物细胞程序性死亡的研究积累一些资料 。
1
. 材料与方法
供试材料采 自中国农业大学 (西区 )校园 , 选用不同发育时期的杜仲胚乳 , 分胚根端胚乳
(靠胚根一端长度大约 l m m 左右的胚乳 )和非胚根端胚乳 (除去胚根端胚乳以外的所有胚
乳 )两部分取材 , 从授粉后 65 天开始 , 每隔 10 天取材 一次 , 至授粉后 170 天种子成熟时为
止 。
电镜观察用 2 . 5 % 戊二醛和 1 % 饿酸双重固定 , 磷酸缓冲液漂洗 , 梯度丙酮脱水 , SuP r ’
s 树脂包埋 , L K B 一 V 型超薄切 片机切 片 , 醋酸双 氧铀 一 柠檬酸铅双重染色 , J EM一10 0 C X
型电子显微镜观察并照相 。
采用 cT BA 法 〔` 〕提取授粉 后 1 05 天和 170 天杜仲胚 根端和 非胚根端胚乳 细胞中的
D N A
, 在 u v 一 17 o A 岛津紫外可见分光光度计上 2 6 0 n m 处测光密度值 , 利用公式 D N A (滩 /
m l) = ( O D / 0
.
0 2 ) X 稀释倍数 , 计算结果再除以鲜重 , 得出单位质量 D N A 的含量 ;提取出的
D N A 电泳 (琼脂糖凝胶的浓度为 0 . 9 % (W / V ) , 电泳 时间为 40 分钟 , 电压为 s v/ c m ) , 观察
D N A 分子的大小及结构变化 。
2
. 观察结果
2
.
1 杜仲胚乳细胞衰退过程 中的超微结构变化
2
.
1
.
1 细胞质原位自溶
杜仲胚乳细胞从授粉后 65 天开始出现衰退的迹象 。 衰退首先从非胚根端胚乳开始 , 胚
根端胚乳的衰退滞后 。 衰退过程中 , 线粒体双层膜模糊 , 岭减少或消失 , 最后解体 ;高尔基体
槽库狭窄并互相贴靠 , 槽库末端尚可见有分泌的小泡 , 显示出一边解体一边仍在执行分泌功
能 ;内质 网片层结构分散分布在细胞质中 , 自一端溢裂形成小囊泡 (图版 I , 1 ) 。 上述各种现
象说明细胞质的自溶作用在强烈进行 。 细胞质中还出现 由单层界膜包围的比较透明的区域
(图版 I , 1 中箭头所示 ) , 可能为细胞质溶解后新形成的小液泡 , 也可能为 内质网或高尔基
体分泌小泡的膨大 , 新产生的小液泡 内含水解酶 , 显示 出对细胞组分的分解作用 。
2
.
1
.
2 环状片层对细胞组分的吞噬与分隔
在胚根端胚乳细胞中 , 除细胞质的原位自溶外 , 细胞内还出现许多复合膜状结构 , 这种
结构称为环状片层 (图版 I , 2 ) , 其中包裹有内容物 , 表现出对细胞组分的吞噬与分隔作用 。
2
.
1
.
3 细胞核及核仁的变化
胚乳衰退过程中细胞核出现异常 , 有的形状呈葫芦状 (图版 I , 3 ) , 有的核中染色质凝聚
且靠向核膜一侧 (图版 I , 4 ) 。 核仁出现 了两种异常形态 : 环状核仁 (图版 I , 5) 和致密型核
4 期 汪矛等 :杜仲胚乳衰退过程中程序性细胞死亡的研究
仁 (图版 I , 6 ) 。
2
.
1
.
4 不同区段胚乳细胞衰退的异质性
杜仲胚根端和非胚根端胚乳细胞衰退的程度不同 。 胚根端胚乳细胞的衰退比较缓慢 ,
时间上晚于非胚根端 , 衰退初期以细胞质自溶为主 , 授粉后 105 天左右细胞内开始出现环状
片层对细胞的吞噬与分隔 。 成熟的细胞内仍存在细胞核及少量细胞器 , 营养物质的排列也
不及非胚根端有序 (图版 I , 8) 。
非胚根端胚乳细胞的衰退较胚根端剧烈 , 且时 间上早于胚根端 。 衰退以细胞质 自溶为
主 , 很少看到环状片层的活动 。 衰退的剧烈期集中在授粉后 70 到 80 天之间 , 短期内造成细
胞核及大量的细胞器解体 , 至授粉后 105 天 , 细胞仅以储藏营养物质为主 , 营养物质的排列
呈现有序性并一直持续至胚乳成熟 (图版 I , 9 ) 。
2
.
2 胚乳细胞衰退过程中 D N A 的变化
提取授粉后 10 5 天和 170 天杜仲胚根端和非胚根端胚乳细胞中的 D N A , 在 U V 一 1 70 A
岛津紫外可见分光光度计上测量结果如图 1 所示 :
芝 2
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0 ` se 一一一一“ 拍幽幽` ` 目目 . .
1 0 5天 1 7 0天
授粉后的天数
Da y s a f t e r P o l l i n a t i o n
图 1 杜仲不同发育时期不同区段胚乳细胞中 D N A 含量的比较
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日胚根端
. 非胚根端
~ 12诊如 司20JO的脚u。plo口曲.1日\助二à啊如
从上图可见 , 处于同一发育时期的杜仲胚乳 , 胚根端胚乳细胞中 D N A 含量明显高于非
胚根端 。 同为胚根端胚乳 , 授粉后 10 5 天胚乳细胞中 D N A 的含量要高于授粉后 17 0 天 。 琼
脂糖凝胶电泳显示授粉后 10 5 天的胚乳 只有胚根端细胞中可见 明显 的 D N A 主带 (图版 I ,
7 )
, 但呈弥散状拖尾现象 , 而 同时期非胚根端胚乳和授粉后 17 0 天两 区段的胚乳细胞中都没
有看到 D N A 条带 。
3
. 讨论
3
.
1 杜仲胚乳发育在特定阶段进入了程序性细胞死亡
程序性细胞死亡是生物机体内普遍存在的一种特殊的细胞死亡形式 , 是一种受基 因调
控的主动的 、连续的程序化反应 , 它在机体发育中起重要作用 。 近年来有关研究已成为生命
科学最活跃的领域之一 。
前人的工作证明 , 植物体内诸如韧皮部和木质部 的成熟过程 、绒毡层细胞 的死亡 、 果实
植 物 研 究 19卷
的成熟 、 心皮的形成和叶片的衰老等都是 D C P的经历 , 而且这些过程是一种必要的 、 对整个
植物生存有积极意义的事件 。 但尚未见关于胚乳的发育也是一种 P C D 过程的详细报道 。
我们认为杜仲胚乳的发育属于 P C D 的根据是 :
3
.
1
.
1 杜仲胚乳在发育过程中显示出了 P CD 的特征 :
1) 细胞质 : 胚乳细胞衰退过程中线粒体 、 高尔基体 、 内质网以及质体都显示 出程度不同
的解体 , 细胞质原位自溶是杜仲胚乳细胞程序性死亡的一个主要特征 。 在小麦珠心细胞的
衰退过程中 , 以这种方式衰退的细胞占全部衰退细胞的 13/ 一 1 / 4 (2] 。 小麦雄性不育系的败
育花粉 、 小麦解体的绒毡层细胞 、 玉米四核阶段胚囊中的溶解复合体和黄瓜衰老子叶细胞的
衰退 ,均属于细胞质原位自溶方式 3[, “ · ’ 5· ’ 0] 。
2) 环状片层对胚乳的衰退作用可作为胚乳细胞 P C D 的一个特征 。 棉花 、 莽菜和 小麦
等植物授粉后 , 接受花粉管的那个助细胞的衰退方式以及棉花和莽菜的珠心细胞的衰退方
式均属于此种 〔` 3 , ’ 6 · `8 〕。
3) 细胞核 : 胚乳细胞中的细胞核在衰退过程中出现几种异常形态 。 根据细胞程序性死
亡的早期形态学特征为染色质 固缩且常聚集于核膜可知 , 胚乳细胞 已进入程序性死亡阶段 。
胚乳细胞衰退过程中出现的环状和致密型核仁也可能与程序性死亡有关 , B us hc (9] 曾认为环
状核仁是一种无活性的核仁 , 而致密型核仁常常在恶性细胞中发现闭 。
3
.
1
.
2 杜仲在发育进程 中显示出与 P C D 有关的 D N A 的变化
D N A 是生物有机体遗传信息的载体 , 完整的 D N A 结构对生命体的发育非常重要 。 杜
仲胚乳细胞的发育受基因编码控制 , 最终走向程序性死亡 , 在死亡之前进行营养物质的储
备 , 提供胚的发育及以后种子萌发所需 。 表现在核酸方面的变化是核酸水解酶活性的迅速
上升 , D N A 和 R N A 各组分的有序降解和核酸含量的下降 (5] 。 非胚根端胚乳细胞 中 D N A
含量 比胚根端胚乳细胞中低 , 说明细胞中 D N A 已发生降解 , 且解体的程度较大 , 电泳结果
显示不出任何条带 。 本试验中并未观察到 D N A 的梯状条带 , 对于细胞程序性死亡是否一
定 出现典型 的梯状条带 , 尚待定论 。
3
.
2 胚乳细胞在特定的发育阶段开始衰退 , 是种子发育中的正常事件
胚乳属于一种贮藏组织 , 但与构成块根 、块茎的同类组织又有所不同 。 后者因担负营养
繁殖的功能而较长久地维持其脱分化再造新器官的能力 , 而胚乳为暂时储藏营养物质的一
类 。 在无胚乳种子 中 , 胚乳因向发育中的胚提供营养而早在种子成熟时完全消亡的过程 , 极
可能就是经历了 P C D ;再如杜仲这样的有胚乳种子中 , 虽然整个 胚乳的寿命要延迟到幼苗
形成的一定 阶段 , 但随着种子的成熟 , 它的功能逐渐转向单纯的贮藏 , 这时 , 与这种功能无关
的结构和组分不再保留 , 反映在形态学上即为细胞的衰退 , 而这种衰退对机体来说是有积极
意义的。
3
.
3 杜仲胚根端与非胚根端的胚乳在发育过程 中进入 P CD 的时间有先后
细胞分化的启动控制和分化过程存在阶段性 , 这些阶段彼此相继有序通过 , 不可逾越 。
其中有一个阶段是临界期 , 在这之前分化是可逆的 , 即可脱分化 , 一旦过了临界期 , 分化就成
为不可逆的 , 即不能再行脱分化了 。 因而细胞的程序性死亡 ( P C D )就是细胞分化的最后阶
段 〔6 , 7 · ` 9〕 。
试验发现这两个区段的胚乳细胞衰退的程度不 同 , 非胚根端胚乳细胞衰退的程度较胚
根端剧烈 , 而且时间上也早于胚根端 , 这说明了杜仲胚乳细胞 因空间位置及功能的不同 , 进
4期 汪矛等 :杜仲胚乳衰退过程中程序性细胞死亡的研究
入 C P D的时间也有先后 。 这种情况的出现 , 首先可能是由于胚乳本身发育的开端有先后 :
受精极核的自然空间位置是在远胚根端 , 决定了此处的胚乳细胞先于胚根端的形成与发育 ,
也较先进入 P C D 的程序。 而胚根端胚乳进入此阶段的滞后又可能是执行机能的需要 : 由于
种子萌发时 , 正常情况下是胚根先萌动 , 有利于幼苗的固定和及时从外界吸收水 、 肥 。 胚根
端的胚乳在这时仍保留较大活性 , 可能与其担负着将整个胚乳的营养物质向萌动的胚转移
等特殊作用有关 。
参 考 文 献
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. 山 n . J . 氏 t . 1 9 8 5 , 6 3 : 16 3一 17 8
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图 版 说 明
图 1 . 授粉后 65 天非胚根端胚乳细胞 , 示解体的线粒体 、 高尔基体和 内质网及新产生的小液泡 ( 个) 。 x
83 0 ; 图 2 . 示胚根端胚乳细胞中的环状片层 。 只 5 0 0 0 ;图 3 . 示葫芦状的细胞核 。 x 3 3 0 ;0 图 4 . 细胞核中
染色质凝聚且靠向核膜一侧 。 x 33 00 ;图 5 . 示环状核仁 。 x 2 60 ;0 图 6 . 示致密型核仁 。 x 3 30 ;0 图 7 . 示
D N A 电泳结果 , A 为授粉后 170 天胚根端胚乳细胞中 D N A 的电泳情况 ; B 为授粉后 10 5 天非胚根端胚乳
细胞中的 D N A 的电泳情况 ; C 为授粉后 10 5 夭胚根端胚乳细胞中 D N A 的电泳条带 ; D 分子 M ar k ; 图 8 . 示
成熟胚根端胚乳细胞 。 x 5 0 0 ; 图 9 . 示非胚根端胚乳细胞中营养物质的排列状况 。 x 37 0 。
E x P l a n a t i o n o f P l a et
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4 0 6 植 物 研 究 19卷
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3
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S ho w i呢 t he g o ud r一 s ha pd en u el e u s. X 0 0 3 3 ; Fig. 4 . C hom r
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x 0 330 ; Fi g
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