全 文 ：第 24 卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　7 月
Vol.24　No.3　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July 　2004
基金项目:国家重大基础研究发展规划 973项目(G19999016003)
第一作者简介:刘关君(1969—),男 ,博士研究生 ,从事林木遗传育种研究。
收稿日期:2003-12-27
用 SDS —PAGE研究 NaHCO3处理后西伯利亚蓼
不同部位蛋白表达的变化
刘关君　王大海　郭晓瑞　杨传平　冯　昕　张　波
(东北林业大学 ,哈尔滨　150040)
摘　要　利用酚抽提法分别提取对照 、3%NaHCO3 处理 5 d和 10 d的西伯利亚蓼地茎 、茎和叶部
蛋白 ,用十二烷基硫酸钠 —聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS —PAGE)和分析软件(Labw ork 3.0)对提取
蛋白进行分离和定量分析 。结果表明 ,地茎蛋白图谱在 34.1和 25.0×103D位置处出现了两条明
显受正向调控的蛋白条带 ,茎部蛋白图谱在 58.1×103D 、47.8×103D和 9.6×103D位置处出现三
条正向调控的条带 ,叶组织蛋白图谱在 25.0×103D处出现一受正调控的条带。除地茎和叶组织
在 25.0×103D处同时出现受正向调控的蛋白条带外 ,盐处理后其它组织间表达受正向调控的蛋
白条带间存在差异 ,说明西伯利亚蓼不同部位对外界盐胁迫应答存在多样性。
关键词　西伯利亚蓼;盐胁迫;酚抽提法;十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳
The study of protein expression patterns in different parts of
Polygonum sibiricum after treatment with NaHCO3 through SDS—PAGE
LIU Guan-Jun　WANG Da-Hai　GUO Xiao-Rui　YANG Chuan-Ping　FENG Xin　ZHANG Bo
(Northeast Fo restry University , Harbin　150040)
Abstract　Proteins in under-ground stem , stem and leaf tissues of Polygonum sibiricum which were
watered wi th 3%NaHCO3 for 5 days , 10 day s and wi th tap w ater for control were ext racted by phe-
nol ex traction method and separated and analyzed by SDS—PAGE and the related sof tw are labw ord
version 3.0.The results show that tw o bands were up-regulated in the map of the under-ground tis-
sue wi th the molecular w eights of 34.1×103D and 25.0×103D , three bands w ere up-regulated in
the map of the stem tissue w ith the molecular weights of 58.1×103D 、47.8×103D and 9.6×103D
and one band w as up-regulated in the map of the leaf tissue wi th the molecular weight of 25.0 ×
103D.Apart from the same band at 25×103D position on the maps of the under-g round stem tissue
and the leaf tissue , the bands at other positions on the maps of three parts of the plant w hich were up-
regulated w ere different.The diversities of the pat terns of protein expression in dif ferent parts of the
plant are illuminated by the results that w ere gained.
Key words　Polygonum sibiricum ;salt-st ress;phenol ex traction method;SDS —PAGE
植物在整个生长周期中会遭受各种生物及非
生物胁迫的影响 ,在长期演变过程中植物进化出多
种机制来抵御外界胁迫因子 。无论植物采取何种
机制来防御外界胁迫对植物本身的伤害 ,植物体内
各种生化物质在时空上发生质和量的变化。而植
物体内各种与胁迫应答相关的生化物质的合成与
降解需要各种蛋白酶 、转运蛋白以及一些信号蛋白
等参与 ,有时这些防御相关的生化物质本身也属于
蛋白类 ,因此蛋白在植物抵抗外界胁迫损伤中扮演
着重要的角色[ 1] 。
十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS —PAGE)是分离和分析来自生物样品蛋白的
重要工具 。该技术方便 、价廉 、重复性好 ,近年来在
生物学研究方面得到了广泛运用[ 2～ 5] 。西伯利亚
蓼在生长过程中植株内积累大量的电泳干扰物质 ,
因此利用常规蛋白提取方案所提取的蛋白很难获
得低背景 、高信噪比的电泳图谱 ,常规植物蛋白提
取方案可以参考文献 6。
本文利用优化后的 Tris-饱和酚法对 3%
NaHCO3不同处理时间的西伯利亚蓼地茎 、茎和叶
组织的蛋白进行了抽提 ,用十二烷基硫酸钠—聚丙
烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)对抽提后的蛋白样
品进行分离 ,获得了低背景 、高信噪比的电泳图谱 。
利用 LabWork 3.0软件对数字化后的电泳图谱进
行了定量分析。结果表明 ,盐处理后西伯利亚蓼地
茎 、茎和叶部的蛋白与对照植株相应部位间的蛋白
表达存在差异;盐处理后具差异的蛋白条带在不同
部位间也存在差异。[ 6]
1　材料与方法
1.1　试验材料
取大棚生长一个月的西伯利亚蓼地茎扦插无
性系植株 ,用 3%碳酸氢钠溶液灌浇 ,分别处理 5
d 、10 d 、对照 ,用普通自来水浇灌。取材时用大量
自来水冲洗植株表面 ,以去除植株表面浮土 ,随后
用双蒸水冲洗 3次 ,迅速用滤纸吸干表面水分 ,分
地茎 、茎和叶放入-70℃冰箱备用 。
1.2　实验方法
1.2.1　蛋白提取
蛋白提取采用 Tris-饱和酚法 。取 1 g 左右的
植物材料(地茎 、茎和叶)放入研钵内 ,液氮速冻后
迅速研磨成粉末状 ,将粉末置于 38 mL 离心管内 ,
加 5 mL Tris-饱和酚和 50 μL β-巯基乙醇 ,摇匀 ,冰
浴1 h ,期间不断摇匀。10 000 r/min 离心 1 h ,弃
沉淀 , 将上清置另一离心管内 , 加 4 倍体积
0.1 mol/L乙酸铵甲醇溶液 ,摇匀 , -18℃静置 1 h
后10 000 r/min 离心 1 h。弃上清 ,沉淀分别用
10 mL 100%和80%丙酮(含 0.7%β-巯基乙醇)各
清洗两次 , 12 000 r/min 离心 30 min 收集沉淀 。
冷冻真空干燥沉淀 ,待丙酮完全挥发 ,向蛋白粉末
中加 300 μL 上样缓冲液(62.5 mol/ L Tris-HCl ,
0.3%SDS ,10%甘油 ,5%β-巯基乙醇 , 4 mol/ L 尿
素), 沉淀搅匀后超声处理 5 min ,使沉淀充分溶
解。18 000 r/min , 4℃离心 30 min , 将上清液置
1.5 mL离心管内 ,冰浴 ,待测浓度。
1.2.2　蛋白溶液定量
蛋白溶液定量采用 Bradford法 ,参考汪家政编
著《蛋白质技术手册》中的方法 ,作如下修改 。称取
牛血清蛋白用上样缓冲液配制成 2 mg/mL 标准溶
液。取 8个 5 mL 塑料离心管 ,分别加入 0 、2.5 、4 、
5 、6 、7.5 、9 和 10 μL 标准牛血清蛋白溶液 。用上
样缓冲液将各管体积补足至 10 μL 后向各离心管
中加入 3 mL Bradford 工作液 ,摇匀 ,放置 5 min。
将反应液转移至比色杯内 ,用 722型分光光度计
(LENG GUANG 722 ,上海精密仪器厂)在 595 nm
处测吸光度。用蛋白量和吸光度进行线性回归 ,制
作标准曲线:Y =105.199 4×A 　r=0.982 5 其
中 Y 为蛋白量(单位:μg), A 为吸光度 。分别吸取
10 μL上述提取的蛋白溶液放入 5 mL 塑料离心管
内 ,加入 3 mL Bradford 工作液 , 反应 5 min后在
595 nm 处测吸光度 。将测得的吸光度代入上式 ,
即为待测蛋白溶液浓度见表 1。
表 1　利用酚法对西伯利亚蓼地茎 、茎和叶部组织
提取的蛋白溶液的浓度
Table 1　The concentr ations of protein solutions extracted from
leaf , stem and under-ground stem tissues of
Polygonum sibiricum using pheno l extraction method
处理
Treatmen ts
材料 Samples
地茎(mg/mL)
Under-ground S tem
叶(mg/mL)
Leaf
茎(mg/mL)
Stem
0 d 2.2 2.27 1.87
5 d 2.11 2.37 2.69
10 d 2.4 2.83 2.26
1.2.3　灌胶和电泳
本实验采用 Leammili建立的不连续电泳缓冲
体系进行电泳。分离胶浓度为 12.5%,堆积胶浓
度为 4%,具体配方参考郭尧君编著的《蛋白质电
泳实验技术》。电泳仪(Elect rophoresis Power Sup-
ply , EPS—1001)和电泳槽(Hoefer SE—600)均为
Amersham Biosciences公司的产品。使用 0.75 mm
的垫片 ,按说明书安装完电泳槽 ,分别灌注分离胶
和堆积胶 ,插上梳子 ,待凝胶凝后拔出梳子用电泳
缓冲液(14.4 g Glycine , 3 g Tris-base , 1 g SDS , 1
L)冲洗样品池 ,装入电泳槽内。上样量为 32 和
48 μg/ lane ,加样总体积为 35 μL。加样前向蛋白
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溶液中加入 8.5 μL 10%的 SDS和 2μL 溴酚蓝溶
液 ,用上样缓冲液将上样总体积补至 35 μL ,震荡
混匀后室温放置 30 min使 SDS与蛋白分子充分作
用。用低分子量蛋白标准(低分子量蛋白标准 ,上
海生工)进行分子量标定。上样后立即进行电泳 。
初始电流设定为 12 mA/板胶 ,待溴酚蓝前沿进入
分离胶后将电流调至 24 mA/板胶 。溴酚蓝前沿离
底部 0.5 cm处停止电泳 ,电泳时间 5.5 h。
1.2.4　凝胶显色和数字化
电泳完毕后 ,凝胶用考马斯亮蓝显色。脱色后
的凝胶图像用台式扫描仪(ImageScanner Power-
Look II , UMAX)进行数字化。设定扫描参数为 ,
分辨率:300 dpi;色彩:256灰阶。
1.2.5　凝胶图像分析
采用 Labwo rk 3.0 软件对数字化后的凝胶图
像上的泳道 、蛋白条带进行自动识别和手工调整;
根据分子量标准确定各蛋白条带的表观分子量;对
各条带所包含的蛋白进行定量分析比较等。
2　实验结果与讨论
2.1　实验结果
2.1.1　西伯利亚蓼地茎蛋白电泳结果
图 1为西伯利亚蓼地茎蛋白电泳图谱 ,泳道由
左向右依次为分子量标准 、对照 、处理 5 d和10 d
图 1　地茎蛋白电泳图谱
由蛋白标准从左向右 ,前三泳道上样量为 32μg/ lane , 相邻的三
个泳道上样量为 48μg/ lane.前三泳道分别为对照 ,处理 5 d和
10 d的材料。其中标记 3 和 4的条带为表达受正调控的条带 ,
标记 1 、2和 5为表达受负调控条带。
Fig.1　The map of the under-ground stem protein electrophoresis
Coun ting f rom protein mark , f rom lef t to right , the f irst three lanes
are samples that loaded w ith 32μg total protein.the second three
lanes are samples that loaded w ith 48 μg total protein.In the f irst
and the second th ree lanes , the lanes from left t o right are the con-
t rol , the t reated wi th 5 d and 10 d samples.The bands labeled wi th
3 and 4 w ere up-regulated and labeled wi th 1 , 2 and 5 w ere dow n-
regulated.
表 2　用 3% NaHCO 3处理后地茎蛋白表达受正调控的条带
Table 2　The bands w hich were up-regulated in under-g round
stem tissue after treatment w ith 3% NaHCO3 solution
正调控
Up-Regulated
对照(μg)
Cont rol
处理 5天
5 d(μg)
处理 10天
10 d(μg)
分子量
Mw(×103D)
3 0.180 14 0.557 96 0.522 63 34.1
4 0.173 54 0.367 31 0.315 41 25.0
表 3　用 3% NaHCO3 处理后地茎蛋白表达受负调控的条带
Table 3　The bands which were dow n-regulated in
under-g round stem tissue af ter treatment with 3% NaHCO 3 solution
负调控
Dow n-Regulated
对照(μg)
Cont rol
处理 5天
5 d(μg)
处理 10天
10 d(μg)
分子量
Mw(×103D)
1 0.437 73 0.332 83 0.348 31 53.5
2 0.974 72 0.596 76 0.681 69 42.8
5 3.162 00 1.952 30 1.321 20 15.2
的样品。上样量分别为32 μg/ lane 。相邻的三个泳
道顺序与前 三个泳道相同 , 上样量 分别为
48 μg/ lane 。其它泳道为防止泳道弯曲而起屏蔽作
用的泳道。通过 Labw ork3.0 软件分析后发现处
理 5 d和10 d的样品在蛋白条带上没有明显差别 ,
但对照样品的蛋白条带与处理后的样品条带间存
在明显差异 。在 34.1×103D 和 25.0×103D处的
蛋白表达量分别增加近2倍和 1倍;在 53.5×103D、
图 2　茎部蛋白电泳图谱
由蛋白标准从左向右 ,前三泳道上样量为 32μg/ lane , 相邻三个
泳道上样量为 48μg/ lane.前三泳道分别为对照 ,处理 5 d和 10
d的材料。其中标记 2 、6和 7的条带为表达受正调控的条带 ,标
记 1 、3 、4和 5为表达受负调控的条带。
Fig.2　The map of the stem protein electropho resis
Counting from protein mark , f rom left to right , the first th ree lanes
are samples that loaded w ith 32μg total protein , the second three
lanes are samples that loaded w ith 48μg total protein.In the first
and the second three lanes , the lanes f rom left to right are the con-
t rol , the t reated w ith 5 d and 10 d samples.The bands labeled
w ith 2 、6 and 7 w ere up-regulated and labeled w ith 1 , 3 , 4 and 5
w ere down-regulated.
3633 期　　　　　刘关君等:用 SDS—PAGE研究 NaHCO3 处理后西伯利亚蓼不同部位蛋白表达的变化
表 4　用 3% NaHCO3处理后茎部蛋白表达受正调控的条带
Table 4　The bands which were up-regulated in stem
tissue after treatment w ith 3% NaHCO3 solution
正调控
Up-Regulated
对照(μg)
Control
处理 5天
5 d(μg)
处理 10天
10 d(μg)
分子量
Mw(×103D)
2 0.162 34 0.169 55 0.392 18 58.1
6 0.332 46 0.831 11 0.798 67 47.8
7 0.167 80 0.203 31 0.311 08 9.6
表 5　用 3% NaHCO3处理后茎部蛋白表达受负调控的条带
Table 5　The bands w hich were dow n-regulated in
stem tissue after treatment with 3% NaHCO 3 so lution
负调控
Dow n-Regulated
对照(μg)
Control
处理 5天
5 d(μg)
处理 10天
10 d(μg)
分子量
Mw(×103D)
1 0.787 87 0.192 08 0.202 88 61.8
3 1.202 20 1.127 50 0.733 62 53.4
4 0.544 39 0.243 88 50.9
5 0.599 84 0.151 97 0.175 10 50.5
42.8×103D和15.2×103D处的蛋白表达量都有不
同程度地下降。(软件分析结果见表 2 ,3)
2.1.2　西伯利亚蓼茎部蛋白电泳结果
图2为不同处理后西伯利亚蓼茎部蛋白表达图
谱 ,其泳道分布方式与图 1相同。处理 5 d和 10 d
的蛋白泳道间存在差异。由软件分析可知 ,对照和
处理之间的差异比较大 ,标注 2 、6和 7的蛋白条带
在盐处理后具有明显上升趋势 ,其分子量分别为
58.1×103D 、47.8×103D和9.6×103D。标注1 、3 、4
图 3　叶部蛋白电泳图谱
由蛋白标准从左向右 ,前三泳道上样量为 32μg/ lane , 相邻的三
个泳道上样量为 48μg/ lane.前三泳道分别为对照 ,处理 5 d和
10 d的材料。其中标记 5 的条带为表达受正调控的条带 ,标记
1 、2 、3和 4为表达受负调控的条带。
Fig.3　The map of the leaf pro tein electrophoresis
Count ing f rom protein mark from lef t to right , the first three lanes are
samples that loaded with 32μg total protein, the second three lanes are
samples that loaded with 48μg total protein.In the first and the second
three lanes , the lanes f rom lef t to right are the cont rol, the t reated with
5 d and 10 d samples.The bands labeled with 1, 2, 3 and 4 were
down-regulated, and labeled with 5 w as up-regulated.
表 6　用 3% NaHCO3处理后叶部蛋白表达受正
和负调控的条带
Table 6　The bands which were dow n-regulated in
leaf tissue after treatment w ith 3% NaHCO3 solution
负调控
Dow n-Regulated
对照(μg)
Cont rol
处理 5天
5 d(μg)
处理 10天
10 d(μg)
分子量
Mw(×103D)
1 0.392 82 0.381 48 0.240 93 69.9
2 2.247 90 2.229 70 0.830 95 65.4
3 0.362 22 0.255 20 0.193 88 40.0
4 0.562 92 0.368 67 0.297 33 31.41
表 7　用 3% NaHCO 3处理后叶部蛋白表达受正调控的条带
Table 7　The bands which w as up-regulated in
leaf tissue after treatment w ith 3% NaHCO3 solution
正调控
Up-Regulated
对照(μg)
Cont rol
处理 5天
5 d(μg)
处理 10天
10 d(μg)
分子量
Mw(×103D)
5 0.163 66 0.428 19 0.417 40 25.0
和 5的蛋白条带在盐处理后其表达量具降低趋势。
标注 4的蛋白条带(50.9×103D)处理 5 d 后用软
件无法检测到 ,处理 10 d后又可以用软件检测到
较淡的带纹。具体分析所得数据可参见表 4 , 5。
2.1.3　西伯利亚蓼叶部蛋白电泳结果
图 3为不同处理后西伯利亚蓼叶部蛋白表达
图谱 ,其泳道分布方式与图 1 相同 。通过软件分
析 ,发现在 69.9×103D 、65.4×103D 、40.0×103D
和 31.4×103D处(在电泳图谱上分别标 1 ,2 , 3 , 4)
的蛋白条的表达量都受到了负调控。在 25.0 ×
10
3
D位置出现了一较明显受正调控的蛋白带。具
体结果见表 6 , 7。
3　讨论
植物对外界盐胁迫应答反应存在广泛的多样
性 ,这种多样性包括不同物种间 、同一物种内的不
同个体间以及同一个体的不同生长发育阶段[ 1] 。
个体的不同部位对盐碱胁迫应答反应也存在多样
性。 AtHK T1在拟南芥中调控 Na+、K+进入植株
内 ,拟南芥植株在盐处理后 , AtHK T1主要在其根
部表达 ,控制 Na+运输到木质部以减少 Na+对根
部的毒害作用[ 7 , 8] 。 AtNHX 1和 AtNHX 2 为拟
南芥 AtNHX 家族中的成员 , AtNHX 1和 AtNHX
2在细胞内将细胞质中的 Na+区室化进入液泡 ,降
低细胞质中 Na+的浓度。NaCl对两者具有诱导表
达作用 , 用 NaCl 处理拟南芥后 , AtNHX 1 和
AtNHX 2只在植株的茎部和根部表达[ 9] 。植物在
盐处理后不同部位蛋白的表达差异说明植物不同
364 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷
部位对环境盐胁迫的反应机制的不同。植物的根
部组织是抵抗土壤盐胁迫的第一道防线 ,根部组织
对土壤盐分的选择性吸收和毒性离子(Na+)的排
阻作用对植物抵抗盐胁迫起着重要作用 。植物的
叶片组织是植物进行碳同化的场所 ,细胞基质和细
胞器基质中过高的 Na+浓度影响植物的光和作用
和其它代谢活动 , 尤其是当植物受到盐胁迫应激
时 ,植物叶表气孔暂时关闭 ,活性自由基浓度增加
对细胞的膜系统产生破坏作用 ,影响生物膜正常生
理功能 ,此时一些重建跨膜电势和清除胞质过高
Na
+和自由活性基团的基因表达受到正向调控 ,以
维持叶部细胞的正常代谢活动[ 1 , 10 , 11] 。植物茎被
认为在盐胁迫下对盐离子起着输导作用 ,对茎部离
子积累作用研究很少。用 SDS —PAGE 对 Tris-酚
提取后的西伯利亚蓼不同部位的蛋白进行分析后
发现 ,地茎的蛋白图谱在 34.1×103D和 25.0×
103D位置处出现了两条明显受正向调控的蛋白条
带 ,茎部蛋白图谱在58.1×103D 、47.8 ×103D 和
9.6×103D位置处出现了三条正向调控的蛋白带 ,
叶组织的蛋白图谱在 25.0×103D处出现一条受正
向调控的蛋白带 。除地茎和叶组织在25×103D附
近处出现的表达量上升的蛋白条带相同外 ,其他组
织间盐处理后表达量受正调控的蛋白条带各不相
同 ,这说明西伯利亚蓼不同部位对外界盐胁迫反应
存在多样性 ,不同组织采取不同策略来抵抗环境盐
胁迫 。
从软件分析后的报表中还发现 ,盐处理后不同
部位表达受抑制蛋白条带也存在多样性 。地茎 、茎
和叶片组织中表达受明显负调控的条带各不相同 。
植物不同部位行使着不同的生理功能 ,因此表达的
蛋白存在差异。许多报道指出 ,植物在盐处理后体
内的代谢活动受干扰 ,代谢速率减缓。由于不同组
织具有不同的生理功能 ,因此受阻碍的代谢类型也
不同 ,体现在蛋白电泳图谱上表达降低的蛋白带纹
存在差异。同时 ,受盐胁迫影响 ,不同蛋白的表达
恢复情况也不一 ,例如茎部组织蛋白图谱条带 4在
处理 5 d后无法用软件检测到 ,而处理10 d后其表
达量又上升 ,可以用软件检测到其表达量。
参　考　文　献
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