全 文 ：第 22 卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2002 年　10 月
Vol.22　No.4　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2002
大血藤 DNA提取及 RAPD研究初探
李钧敏1　金则新1　边才苗1　钟章成2
(1.台州师范专科学校 ,临海　317000)
(2.西南师范大学 ,重庆　400715)
摘　要　以浙江天台山大血藤为材料 ,对其 DNA提取和 RAPD分子标记方法进行了研究。结果
表明:所采用的经改进的 SDS 提取法可获得高质量的大血藤 DNA ,分子量大于 23kb ,可满足
RPAD扩增;用 15个不同的随机引物对所提取的 12个个体的大血藤 DNA 进行了 RAPD分子标
记分析 ,其中 14个引物扩增产物具有多态性。建立了大血藤 DNA 提取和 RAPD标记的分析程
序 ,为 RAPD分析应用于大血藤遗传多样性研究打下了良好的基础 。
关键词　大血藤;DNA;提取;RAPD
DNA EXTRACTIONANDRAPDANALYSISOF SARGENTODOXA CUNEATA
LI Jun-min1　JIN Ze-xin1　BIAN Cai-miao1　ZHONG Zhang-cheng2
(1.TaiZhou Teachers College , Linghai 317000)
(2.Southwest China No rmal University , Chongqing 400715)
Abstract　DNA ex traction and RAPD amplification of Sargentodoxa cuneata was studied.The re-
sults show ed that the good quality DNA of Sargentodoxa cuneata was gained using improved SDS
method and the length of DNA fragment w as mo re than 23kb.The isolatd DNA could be used fo r
RAPD analyses with mo re purification.RAPD markers were examined in 12 individuals Sargento-
doxa cuneata , and 14 of 15 primers reveal polymorphisms.The RAPD analysis procedure in this ex-
periment lays a good foundat ion fo r application of RAPD in Sargentodoxa cuneata genetic research.
Key words　Sargentodoxa cuneata;DNA;ex traction;RAPD
　　大血藤(Sargentodoxa cuneata (Oliv.)Rehd.
et Wils)隶属大血藤科(Sargentodoxaceae)大血藤属
(Sargentodoxa),大血藤科为我国所特有[ 1] 。大血
藤为落叶木质藤本 ,长达 10m ,根和藤可入药 ,有强
筋骨 、活血散瘀 、止痛 、通经之效 ,并可治疗阑尾炎 、
风湿性关节炎等 ,又可用作杀虫剂[ 2] 。国内外对
大血藤的研究较少 ,仅对大血藤的次生代谢产物如
三萜类皂素[ 3] 、木质素[ 4] 等有所研究 。为探索大
血藤种群的遗传变异 ,从分子水平研究植物的变异
与环境关系 ,有必要探索微量 、快速且适用于大批
量样品 DNA 提取的方法。本文以改进的 SDS 法
提取大血藤 DNA 并进行 RAPD分析的可行性 ,为
开展大血藤种质资源的遗传多样性研究打下基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料取自浙江省天台山大血藤的天然居
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870160)
第一作者简介:李钧敏(1973-),女 ,硕士 ,讲师 ,主要从事分子生物学的教学与科研。
收稿日期:2001-05-10
群 ,随机选取 12个单株 ,于植株上选择幼嫩干净叶
片采集 , -70℃冰箱保存
1.2　方法
1.2.1　DNA提取及纯化
DNA 提取根据刘康德等方法[ 5] 改进 , 取
-70℃冻存叶片研磨成粉状 ,取 0.1g 转入 1.5 mL
离心管中 ,加入 500 μL 提取缓冲液(100 mmol/ L
Tris·HCl(pH8.0), 3%可溶性 PVP , 20 mmol/ L β-
巯基乙醇 , 20 mmol/L EDTA(pH8.0)), 8 , 000 r/
min离心 5min ,弃上清 ,取沉淀加入 500 μL 裂解
缓冲液(100 mmol/L Tris·HCl(pH8.0), 20 mmol/
L EDTA(pH8.0),500 mmol/L NaCl , 1.5%SDS),
65℃水浴 30 min ,不时轻轻颠倒 ,取出加入 500 μL
氯仿/异戊醇(24:1),颠倒成乳浊状 , 10 , 000 r/min
离心 10 min ,取上清加入 0.25(v/v)乙醇和 0.11
(v/v)5M KAc(pH4.8),立即10000 r/min离心10
min ,取上清加入 0.6(v/v)异丙醇 ,置 -20℃冰箱
30 min , 12 , 000 r/min 离心 10 min ,取沉淀 ,溶于
30μL TE(含 RNase 5(g/mL)备用 。
DNA定量采用紫外分光度计(日本岛津 UV
-7401PC紫外可见分光光度计)与琼脂糖凝胶电
泳双重定量。紫外分光光度法以 λDNA 为标准
品 ,以 A260对 DNA 进行定量;电泳图谱经 UTHSC-
SA ImageTool软件分析荧光面积 ,与标准 DNA分
子量参照物比较定量而得 。
1.2.2　RAPD反应程序
扩增反应条件:15 μL PCR反应体积 ,1×Taq
酶缓冲液 ,0.1 mmol/L 4×dNTP ,1U Taq酶(上海
华美公司), 10 ng 模板 DNA , 20 pmol引物(上海
Sangon公司);1.5 mmol/L M gCl2;2 mg/mL BSA 。
对照加入除模板 DNA 外的以上各成分 ,用双蒸水
代替总 DNA 。
扩增程序:本实验所用的 PCR仪为上海高机
公司生产的SRX-481 PCR仪 ,适合大血藤 RAPD
分析的 PCR反应程序(用 6℃循环水冷却):94℃5
min 1 个循环 ,再 94℃ 1 min , 40℃ 1min , 72℃ 2
min ,共 40个循环;最后一个循环 72℃延伸 5min ,
使 DNA 片段完全延伸。
电泳检测:RAPD产物用 1.4%琼脂糖凝胶电
泳 ,电泳缓冲液为 1×TAE.用λDNA/(EcoRI +
HindⅢ)做分子量标记 。在凝胶中加入 0.5μg/mL
EB.电泳完毕于紫外透射仪上观察拍照 , Leica数
码相机拍照保存。
2　结果与分析
2.1　大血藤叶片 DNA的提取
用不同的方法处理 、抽提大血藤叶片 DNA ,以
紫外分光光度法测定其 230 nm 、260 nm 、280 nm 、
320 nm 的光吸收值(abso rbancy ,A)即 A230 、A260 、
A280及 A320 ,以 A260/A280代表 DNA的纯度与质量 ,
以 A260/A230及 A320代表 DNA 中污染杂质的程
度[ 6] ,结果如表 1及图 1所示 。由于大血藤叶片中
含有较多次生代谢产物 ,会严重影响提取 DNA 的
质量 ,直接提取大血藤 DNA 会因存在大量的氧化
的多酚化合物而呈褐色。因此我们在提取过程中
加入缓冲液进行浸泡 ,以除去部分可溶性的多酚化
合物 ,并加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与 β-巯基乙
醇防止多酚化合物的氧化 。由表 1可知缓冲液浸
泡的次数不同会导致所抽提 DNA的质量不同(不
仅颜色有较大差异 ,而且从吸光度比较差异也较
大)。一般的植物若多酚化合物含量低则浸泡 1次
就可得到满意质量的 DNA ,而多酚化合物含量高
的则浸泡 3次就足以去除大量的多酚化合物等次
生代谢产物 ,得到满意质量的 DNA 。
SDS 法提取的 DNA 得率较高 ,但常含有较多
的蛋白质与多糖 ,导致 DNA 的不可溶解 ,不利于
下一步的 PCR操作 ,有时甚至抑制了 PCR扩增反
应的进行 ,尤其是对于植物老叶 DNA的抽提或是
多糖含量较多的植物叶片 DNA 的抽提。一般常
规的方法[ 7]采用加入 1/3(v:v)5M KAc(pH4.8),
冰浴 30 min以沉淀蛋白质与多糖 ,但由于时间较
长 ,因此我们参照相关文献采用 0.25(v/v)乙醇和
0.11(v/v)5M KAc(pH4.8)沉淀蛋白质和多糖 。
表 1结果显示两种沉淀方法皆可获得质量较好的
DNA ,可满足下一步的分子生物学操作 ,而单一地
利用乙醇或 KAC 或不对蛋白质与多糖进行处理
均难以达到满意的结果。大血藤叶片经提取缓冲
液浸泡 3次 ,再经蛋白质与多糖的沉淀处理 ,质量
较好:A260/A280可达 1.8左右 , A260/A230可达 2.0
左右 ,A320小于 0.01。
由图 1 可知 , 所抽提的 DNA 的分子量都在
23kb以上 ,确定基本上是基因组 DNA ,并且可知
DNA 都未被打断。
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图 1　大血藤基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图谱
Fig.1　Analy sis of genomic DNA from Sargentodoxa cuneata by agarose gel electrophoresis
M:λDNA/ Hind Ⅲ标准分子量参照物;M.λDNA/ Hind Ⅲ molecular w eight standard.
1.λDNA
2.未经缓冲液浸泡大血藤叶片提取的 DNA并经 0.25(v/ v)乙醇和 0.11(v/ v)5M KAc(pH4.8)沉淀去杂质;The genomic DNA of Sar-
gentodo xa cuneata extracted w ithout buffer marinat ing and the DNA was t reated wi th 0.25(v/v)ethanol and 0.11(v/ v)5M KAc(pH4.8)
3.经缓冲液浸泡 1次的大血藤叶片提取的 DNA 并经 0.25(v/ v)乙醇和 0.11(v/ v)5M KAc(pH4.8)沉淀去杂质;The genomic DNA of
Sargentodoxa cuneata extracted w ith once buf fer marinat ing and the DNA was t reated wi th 0.25(v/ v)ethanol and 0.11(v/ v)5M KAc
(pH4.8)
4.经缓冲液浸泡 2次的大血藤叶片提取的 DNA 并经 0.25(v/ v)乙醇和 0.11(v/ v)5M KAc(pH4.8)沉淀去杂质;The genomic DNA of
Sargentodoxa cuneata ext racted w ith twice buf fer marinating and the DNA was t reated wi th 0.25(v/ v)ethanol and 0.11(v/ v)5M KAc
(pH4.8)
5.经缓冲液浸泡 3次的大血藤叶片提取的 DNA 并经 0.25(v/ v)乙醇和 0.11(v/ v)5M KAc(pH4.8)沉淀去杂质;The genomic DNA of
Sargentodoxa cuneata ext racted w ith thrice buffer marinating and the DNA w as t reated w ith 0.25(v/ v)ethanol and 0.11(v/v)5M KAc
(pH4.8)
6.经缓冲液浸泡 3次的大血藤叶片提取的DNA 并经 1/ 3(v/ v)5M KAc(pH4.8)冰浴 30min沉淀杂质;The genomic DNA of Sargentodoxa
cuneata extracted wi th thrice buf fer marinating and the DNA w as t reated wi th 1/ 3(v/ v)5M KAc(pH4.8)then be bathed on ice for 30min
7.经缓冲液浸泡 3次的大血藤叶片提取的 DNA 未经杂质去除;The genomic DNA of Sargentodoxa cuneata ext racted w ith tw ice buffer
marinating and the DNA w as not t reated
表 1　大血藤 DNA抽提和纯化分析
Table 1　The analy sis of DNA extracted from Sargentodoxa cuneata
提取液洗涤
Buffer marinating
杂质去除方法
Method for wiping of f impurity
A 260/A 280 A 260/A230 A 320 DNA颜色
Color of DNA
DNA提取液未洗涤
Without buf fer
DNA提取液洗涤 1遍
Once buf fer marinating
DNA提取液洗涤 2遍
Tw ice buffer marinating
DNA提取液洗涤 3遍
Thrice buffer marinat ing
0.25(v/ v)乙醇和
0.11(v/ v)5M
KAc(pH4.8)沉淀杂质
DNA treated w ith
0.25(v/ v)ethanol and
0.11(v/ v)5M
KAc(pH4.8)
0.86 0.28 0.132 暗褐色
Dust color
1.40 0.90 0.038 黄褐色
Snuff color
1.57 1.39 0.028 淡褐色
Hazel
1.78 1.86 0.006 淡黄色
Yellowy
DNA提取液洗涤 3遍
Hrice buf fer marinating
1/ 3(v/ v)5M KAc(pH4.8)
冰浴沉淀杂质
DNA treated w ith
1/ 3(v/ v)5M KAc(pH4.8)and
be bathed on ice for 30min
1.89 2.38 -0.003 淡黄色
Yellow y
DNA提取液洗涤 3遍
Hrice buf fer marinating
不沉淀杂质
DNA w ithout t reating
1.57 0.88 0.020 黄褐色
Snuff color
4854 期　　　　　　　　　　　　　　李钧敏等:大血藤 DNA 提取及 RAPD 研究初探
2.2　RAPD标记
在 RAPD分析中常应用植物嫩叶抽提 DNA ,
所得 DNA质量较好 ,杂质较少 ,可不经纯化直接
应用于 PCR分析 。但有时标本为老叶时 ,所抽提
的 DNA 常需经过纯化才可进行满足 PCR扩增 ,这
样就增加了试剂的用量 ,且不适合大批量样品的抽
提 ,很难应用于分子生态学的研究 。应用本文所述
的方法可适用于植物老叶 DNA的提取 。
以 7月份从天台山采集的大血藤老叶为标本 ,
经本文方法抽提并经 0.25(v/v)乙醇和 0.11(v/v)
5M KAc(pH4.8)沉淀去杂质得大血藤基因组
DNA ,对其进行 RAPD 扩增试验 。所获得的 DNA
应用于 RAPD分析时模板 DNA 的用量范围大 ,原
DNA经 5倍稀释至 50 倍稀释均可获得清晰的条
带(结果未显示)。取大血藤 DNA 进行 RAPD扩
增 ,从 60个引物中共筛选出扩增条带清晰 ,重复性
好的 15个随机引物作为正式扩增的引物。 RAPD
分析结果显示在 12个体中 15个随机引物可扩增
出明显的条带 ,其中 14 个引物的扩增产物具有多
态性 ,见图 2 。可见采用改进的 SDS法提取的大血
藤DNA符合 RAPD分析的要求 ,此分析程序可用
作大血藤遗传多样性 、系统发育等方面的研究 。
图 2　大血藤 DNA 的 RAPD 扩增图谱(引物 S102)
Fig.2　RAPD amplification of Sargentodoxa
cuneata DNA(primer S102)
箭头示 RAPD扩增的多态性位点;
M.λDNA/ Eco R I+Hind Ⅲ分子量标准参照物;
1～ 12:大血藤个体 1～ 12RAPD扩增结果;
The arrow s show the polymorphism of RAPD amplifi cation.M .
λDNA/ Eco R I +Hind Ⅲ molecular w eight standard
1～ 12:RAPD amplifi cat ion of the Sargentodoxa cuneata sample
1～ 12
3　结语
为了获得高质量的大血藤基因组 DNA ,满足
对其遗传多样性研究的需要 ,有必要对其 DNA 抽
提进行研究。本文所用方法较简单 ,适合老叶与嫩
叶的抽提 ,省去了许多纯化步骤 ,不需进行酚/氯仿
的抽提 ,因此可适于大批量样品 DNA 的快速抽
提。应用所用的 RAPD 程序及条件进行扩增时 ,
可获得清晰的条带 ,重复性好。另外经七子花 、水
杉 、云锦杜鹃 、青菜等植物老叶的 DNA 提取试验 ,
本文方法可适用于各种不同植物老叶 DNA 的提
取 ,并可直接应用于 RAPD分析(结果未示)。
参　考　文　献
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