全 文 ：第 21 卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001年　7 月
Vol.21　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2001
部分小檗科植物的 RAPD分析
王　艇　苏应娟　朱建明　范国宽　陈　瑾
(中山大学生命科学学院 , 广州　510275)
摘　要　利用随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术分析了部分小檗科(Berberidaceae)5个属6种植
物:猫儿刺(Berberis julianae Schneid.),日本绿叶小檗(Berberis thunbergii DC.),阔叶十大功劳
(Mahonia bealei(Fo rt.)Carr.),南天竹(Nandina domest ica Thunb.),淫羊藿(Epimedium sagit-
tatum(S.et Z.)Maxim.)和八角莲(Dysosma versipellis (Hance)M .Cheng.)。经筛选 Sangon公司
的60个引物 ,其中29个引物的谱带清晰并呈多态性 。采用 UPGMA法对求出的遗传距离进行聚
类分析 ,结果显示:在小檗科内建立十大功劳属(Mahonia)和南天竹属(Nandina)是合理的。
关键词　小檗科;RAPD;系统发育
RAPD ANALYSIS ON SOME SPECIES OF BERBERRIDACEAE
WANG Ting　SU Ying-juan　ZHU Jian-ming　FAN Guo-kuan　CHEN Jin
(School of Life Sciences , Zhongshan University , Guang zhou 510275 )
Abstract　The fresh leaves of Berberidaceae were collected as materials including 5 genera and 6
species:Berberis julianae Schneid., Berberis thunbergii DC., Mahonia bealei (Fort.)carr., Nan-
dina domesrt ica Thunb., Epimedium sagit tatum(S.et Z.)Maxim., Dysosma versipell is (Hance)
M.Cheng..The to tal DNA were isolated by improved CTAB method.60 random primers produced
by Sangon were screened and 29 could amplify good RAPD Products.The dendrogram was construct-
ed from genetic distances through UPGMA method , and the phylogeny of Berberidaceae w as dis-
cussed based on it.
Key words　Berberidaceae;RAPD;phylogeny
　　
小檗科 Berberidaceae是种类较多的一科 ,有 15
属 600多种 ,分布于北温带 、热带高山和南美洲。我
国有 11属 ,约 200种 ,即小檗属 Berberis 、十大功劳
属 Mahonia 、山荷叶属 Diphylleia 、鲜黄连属 Jef fer-
sonia 、南天竹属 Nandina 、八角莲属 Dysosma 、红毛
七属 Caulophy llum 、牡丹草属 Leont ice 、桃儿七属
S inpodophy llum 、足叶草属 Podophyl lum 和淫羊藿
属Epimedium 。目前对小檗科的比较形态学[ 1～ 3] 、
花粉形态[ 1 , 4]及其外壁超微结构 、细胞学及植物化
学研究进行了大量研究[ 5 ～ 7] ,但小檗科有关植物的
分子系统学和进化遗传学研究的报道却非常有限 。
本文采用 RAPD 技术研究了部分小檗科
(Berberidaceae)植 物猫 儿刺 (Berberis julianae
Schneid.), 日 本绿 叶小 檗 (Berberis thunbergii
DC.), 阔叶十大功劳(Mahonia bealei (Fo rt.)
国家自然科学基金(39500013 , 39700117)和广东省自然科学基金(950099 , 970176)资助项目
第一作者简介:王艇(1969-),男 ,博士 ,副教授 ,主要从事植物分子生物学研究工作。
收稿日期:2001-2-16
Carr.),南天竹(Nandina domestica Thunb.), 淫羊
藿(Epimedium sagit tatum(S.et Z.)Maxim.)和八
角莲(Dysosma versipellis (Hance)M.Cheng.)并在
分子水平上对小檗科植物的系统发育进行了探讨 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
　　表 1 实验材料及来源
Table 1 The taxa abd origin
属名 Genus name 种名 Species name 来源 Orig in
小檗属 Berberis 猫儿刺(Berberis julianae Schneid .) 中国科学院武汉植物所
小檗属 Berberis 日本绿叶小檗(Bereris thunbergii DC.) 中国科学院武汉植物所
十大功劳属 Mahonia 阔叶十大功劳(Mahonia bealei(Fort.)Carr.) 中国科学院武汉植物所
南天竹属 Nandina 南天竹(Nandina domestica Thunb.) 中国科学院武汉植物所
淫羊藿属 Epimedium 淫羊藿(Epimedium sagittatum (S.et Z)Maxim.) 中国科学院武汉植物所
八角莲属 Dysosma 八角莲(Dysosma versipellis(Hance)M.Cheng.) 中国科学院华南植物所
1.2　主要试剂
提取植物基因组 DNA 用十六烷基三甲基溴化
铵(CTAB)购自美国 SIGMA 公司(优级纯)。检测
基因组DNA用标准分子量λ-DNA / Hind Ⅲ购自
美国 Promega 公司(21226 , 7421 , 5804 , 5634 , 4878 ,
3530bp)。DNA 快速纯化回收试剂盒购自北京原平
生物技术有限公司。
用于 PCR扩增的试剂(10mer 寡核苷酸随机引
物 、Tag DNA 聚合酶 、dNTP 、10×buf fer 、Mg2+)均
购自 Sangon公司 。检测 RAPD 扩增产物所用标准
分子量标记购自华美公司(21226 , 5148 , 4973 ,
4268 , 3530 , 2027 , 1904 , 1584 , 1375 , 947 , 831 ,
564 , 125 bp)。其余试剂均为国产分析纯 。
1.3　DNA 的提取与浓度 、纯度检测
从每种样品中取新鲜叶片 0.5克 ,置于已经灭
菌的研钵中 ,加液氮迅速研磨成粉末 ,分装于 2 个
1.5 ml的 Eppendorf管中 ,加 0℃预冷丙酮轻轻振荡
1 min , 10 000 rpm 离心 5 min ,弃上清 ,重复二次 。
每管中加入1 m l 60℃预热的 2%CTAB 提取液 , 5μl
蛋白酶K(终浓度 10 mg/ml),充分混匀 ,60℃保温 4
小时。500μl 氯仿:异戊醇(24:1)抽提 10min , 13
000 rpm 离心 15min ,取上清 ,重复一次 。取上层水
相加入 2/3 体积 4℃预冷异丙醇 ,轻轻混合 ,置 -
20℃静置沉淀过夜。9 000 rpm 离心 5min ,可见管
底有半透明沉淀 ,弃上清 ,取沉淀。每管加入 800μl
4℃预冷的 70%乙醇漂洗 20分钟 ,3 000 rpm 离心
10 min ,弃上清 ,重复一次 。沉淀空气干燥 1小时 ,
用 100μl pH 8.0的 TE溶解 。纯化后总 DNA于 1.
4%琼脂糖凝胶(加溴化乙锭至 0.5μg/ml)100v 电
泳 1小时 , 254nm 紫外灯下观察并拍照记录。Phar-
macia Bio tech公司 Ultrospec 2000 型分光光度计上
波长 260nm 和 280nm 处测定吸光光度值(A),根据
A260/A280比值判断 DNA 样品的纯度 ,由 A260的
值估算浓度。
1.4　RAPD分析
扩增 反 应在 PERKIN ELMER 公 司 Ge-
neAmpTM PCR System 2400 型热循环仪上进行 。
反应体积 25 μl , 其中 10×buffer 2.5μl , 随机引物
0.4μM , dNTPs 各 100μM , Mg 2+ 2.0 mM , 模板
DNA约 25ng , Tag DNA 聚合酶 1.0 U(Sangon 公
司), 反应混合物用 20μl矿物油覆盖 。
扩增程序:95℃预变性 200 秒;94℃变性 1 分
钟 , 36℃复性 1分钟 ,72℃延伸 2分钟 , 40个循环;
72℃延长 10 分钟。
RAPD扩增产物经 1.4%琼脂糖凝胶电泳(加
溴化乙锭至 0.5 μg/ml)分离 , 254nm 紫外灯下观察
并拍照记录。
1.5 数据处理
任意两个样本间的遗传距离(D)根据以下公式
计算:
D=1-F
F= 2NXY
NX+NY
其中 F 为任意两个样本间的相似系数 , N x , Ny
分别是样本X 、Y扩增出的DNA 片段总数 ,N xy是样
本 X和 Y共有的 DNA 片段数。
根据遗传距离(D值)矩阵(表 3 )采用 UPGMA
(unweighted pair group method w ith arithmetic
mean)法进行聚类分析 ,构建树系图(图 1)。
2　实验结果
2.1　小檗科总 DNA的提取
本实验开始采用改进的 CTAB法提取小檗科 6
种植物总 DNA ,但是所提的模板进行 PCR 却无扩
4293 期　　　　　　　　　　　　　　王　艇等:部分小檗科植物的 RAPD 分析
增。测它们的吸光值 ,发现 A260/A280 比值为 1.5
左右 ,即模板中含有较多蛋白杂质 ,影响了扩增。为
此我们又进行了改进 ,即在 CTAB水浴时加入终浓
度10 mg/ml的蛋白酶 K ,彻底消化蛋白杂质 。经氯
仿:异戊醇(24:1)抽提后测吸光值 , 发现 A260/
A280比值为 1.8 左右 ,后续的 PCR反应也获得成
功。
2.2　随机引物的筛选和扩增结果
对 60个引物(上海生工生物工程有限公司)进
行筛选 ,其中 29个引物(表 2)的扩增产物经琼脂糖
凝胶电泳能得到分离良好并呈多态性的带型(图
2)。
　　表 2 用于本实验的引物及其序列
Table 2 The primers and their sequences
引物编号
Primer No.
寡核苷酸序列(5 - 3 )
Oligonucleotide Sequence
引物编号
P rimer No.
寡核苷酸序列(5 - 3 )
Oligonucleotide Sequence
S29 GGGTAACGCC S36 AGCCAGCGAA
S32 TCGGCGATAG S64 CCGCATCTAC
S80 ACTTCGCCAC S81 CTACGGAGGA
S99 GTCAGGGCAA S97 ACGACCGACA
S100 TCTCCCTCAG S150 CACCAGGTGA
S152 TTATCGCCCC S156 GGTGACTGTG
S151 GAGTCTCAGG S506 GTCTACGGCA
S509 TGAGCACGAG S507 ACTGGCCTGA
S155 ACGCACAACC S96 AGCGTCCTCC
S159 ACGGCGTATG S511 GTAGCCGTCT
S517 CCGTACGTAG S519 CCTCCTCATC
S512 ACAGGTGCGT S92 CAGCTCACGA
S90 AGGGCCGTCT S501 TGCGGGTCCT
S65 GATGACCGCC S505 GACCTAGTGG
S85 CTGAGACGGA
　　表 3 任意 2个样本间的遗传距离
Table 3 Genetic distance between any samples
M.bealei B.thunbe-rgii B.julianae N.domestica E.sagittatu-m D.versipell-is
M.bealei 0 0.585 0.704 0.589 0.652 0.597
B.thunbergii 0 0.455 0.593 0.702 0.677
B.julianae 0 0.86 0.6 0.725
N.domestica 0 0.648 0.743
E.sagittatum 0 0.642
D.versipellis 0
3　讨　论
从以上树系图可以看出本实验所研究的小檗科
可以分为三个层次。首先 ,日本绿叶小檗与猫儿刺
可以归为小檗属 , 另外的四个种可以归为一个组 。
其中 ,南天竹所在的南天竹属与阔叶 十大功劳所在
的十大功劳属又可以分为一组。另外 ,淫羊藿所在
的淫羊藿属与八角莲所在的八角莲属又可以分为一
组。
张金谈通过对花粉形态的研究认为小檗属与十
大功劳属为一个类群 ,它们的花粉都具有螺旋状萌
发孔或合沟(短沟),外壁均为细网状纹饰。八角莲
属与淫羊藿属具有 3 沟花粉分在一个类群[ 1] ,这与
本实验结果一致 ,通过 RAPD技术得出两者之间的
遗传距离为 0.642。
430 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
图 1.根据 RAPD 数据 , 应用 UPGMA 法构建的小檗科 6
个个体遗传树系图
Fig.1　Genetic dendrogram of Berberidaceae generated by
using UPGMA algorithm to cluster RAPD data
图 2　随机引物的 S-65(a), S-29(b)扩增产物
Fig.2　Amplification products of primer S-65(a), S -29
(b)
1.M.bealei 2.B .thunbergii 3.B .julianae 4.N .domesti-
ca 5.E .sagittatum 6.D.versipellis M:2kb DNA Ladder
小檗属与十大功劳属在形态上十分相似 ,曾有
人将两属合并为小檗属 ,而将十大功劳作为小檗属
下的一个组。从本实验作出的树系图可以看出十大
功劳属并不能隶属于小檗属 ,而应该单独作为一个
属。
对于南天竹属 , 多数分类学家(Hutchinson ,
1959;Buchheim , 1964;Tax taджЯН, 1960 , 1970)把
它看作一个科[ 1] 。花粉形态学的研究认为其接近
于小檗科 。本实验结果认为南天竹属应该属于小檗
科 ,并且其与十大功劳属的亲缘关系比较近 ,它们之
间的遗传距离为 0.589。
参　考　文　献
1.苏应娟 , 干国平 ,程莲银等.乌云伞的解剖学和花粉形态学
研究.武汉植物学研究 , 1993 , 11(1):91 ～ 93
2.苏应娟 , 刘启宏 , 程莲银等.湖北八角莲属 3 种植物的解
剖学研究.武汉植物学研究 , 1994 , 12(2):111～ 116
3.李广明.药用植物桃儿七营养器官解剖学特点研究.植物
学报 , 1982 , 24(6):519～ 523
4.张金谈 , 王萍莉.小檗科花粉形态研究.植物分类学报 ,
1983 , 21(2):130 ～ 141
5.马绍宾 , 胡志浩.小檗科鬼臼亚科植物的核型研究.云南
植物研究 , 1996 , 18(3):325 ～ 330
6.陈懿亨.国产鬼臼类药用植物资源研究.药学学报 , 1979 ,
17(1):101 ～ 107
7.Su Yingjuan ,Wang Ting , Yang Weidong et al.DNA extrac-
tion and RAPD analy sis of Podocarpus.ACTA SCI.NAT.U-
NIV.SUNYATSENI.1998 , 37:13～ 18
4313 期　　　　　　　　　　　　　　王　艇等:部分小檗科植物的 RAPD 分析