全 文 ：第 24 卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　7 月
Vol.24　No.3　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July 　2004
基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助(10511028)
第一作者简介:张秀英(1977—),女 ,硕士研究生 ,主要从事植物系统学研究工作。
＊通讯作者
收稿日期:2003-11-28
蹄盖蕨科 DNA 的提取和几种因素对 RAPD分析的影响
张秀英　范亚文＊
(哈尔滨师范大学生命与环境科学学院 ,哈尔滨　150080)
摘　要　以黑龙江省牡丹江市 4种蹄盖蕨科植物为材料 ,对其 DNA 提取及 RAPD分析进行了研
究 ,分别测试了模板浓度 、Taq DNA 聚合酶浓度 、引物浓度 、Mg2+浓度 、dN TP 浓度 ,确定适合蕨类
植物 DNA提取和 RAPD分析的较理想的扩增条件 ,为 RAPD分析应用于蹄盖蕨科遗传多样性研
究打下良好基础。
关键词　蹄盖蕨科;RAPD;随机引物
Athyriaceae plant DNA isolation and the effects on RAPD analysis
ZHANG Xiu-Ying　FAN Ya-Wen＊
(Department of Biolog ical ,Harbin No rmal University ,Harbin　150080)
Abstract　4 species of Athy riaceae f rom M udanjiang ,Heilongjiang Province have been used for the
isolat ion of the DNA and the analysis of RAPD.In the process of testing the content of DNA tem-
plates ,DNA polymerase ,primers , Mg2+ and dNTP , a suitable w ay has been found that very useful
for isolating the DNA of P teridophyta and its RAPD analyzing.The result suggest that the new w ay
can be a good start for RAPD analy sis in the Athy riaceae genet ic diversity research.
Key words　Athy riaceae;RAPD;random primer
RAPD用于种类鉴定是基于生物个体间 DNA
的多态性。RAPD分析不受组织和器官种类 、发育
阶段 、生境条件等诸多因素的影响 ,而且多态性丰
富 ,打破了以往采用形态特征和同工酶分析易受条
件影响 、多态性低的局限 ,同时与 RFLP 相比具有
技术简化 、成本低 、不需用物种特异探针[ 1] 等特
点。因此 , RAPD分析非常适合以种群为单位的遗
传研究。
蕨类植物是植物界的一个重要类群 ,它既是高
等的孢子植物又是原始的维管束植物 ,在植物界它
是介于苔藓和种子植物之间的一个类群 ,在植物界
的起源与进化研究中有着重要的意义。多年来 ,蕨
类植物分类学一直停留在形态解剖学水平上 ,其中
由于外部形态特征比较直观 、容易操作 ,是实验中
主要应用的分类依据 ,孢粉学的发展也进一步为蕨
类植物的系统分类提供佐证 。但由于开放的环境
和人为因素的影响 ,蕨类植物一些比较大的科 、属
(如水龙骨科 、蹄盖蕨科等)仍存在一些分类及系统
演化位置的问题 ,不利于蕨类植物的调查和开发利
用。本文从生物遗传本质 DNA 入手 ,通过对蹄盖
蕨科 4种植物的比较 ,力求探索出一条适合蹄盖蕨
科植物 RAPD 分析的新方法 ,为蹄盖蕨科的鉴定
与分类归属问题提供分子生物学借鉴依据 。
1　材料和方法
1.1　实验材料
本研究所采用材料均来自黑龙江省牡丹江地
下森林 , 分别为:中华蹄盖蕨(Athyrium sinense
Rupr)、蛾眉蕨(Lunathrium acrost ichoides(Sw.)
Ching)、羽节蕨(Gymnocarpium jessoense(Koidz.)
Koidz)、冷蕨(Cystopteris fragi lis(L.)Bernh),取新
鲜嫩叶 ,一部分阴凉处饥饿 4 ～ 5 d ,用于 DNA 制
备 ,一部分置于-70℃保存。
1.2　DNA 的提取
采用 CTAB法[ 2]提取总 DNA 。在液氮中研磨
300 ～ 500 mg新鲜叶子 ,立即加入650 μL提取缓冲
溶液于 63℃水浴30 min , 从水浴锅中取出 , 加
650 μL酚:氯仿(1:1)抽提 ,重复 2次 ,离心8 min ,
将上清转移至新管中 ,加40 μL 3 mol/L NaAc和
二倍体积的无水乙醇 ,颠倒混匀 , 0℃放置半小时 ,
离心5 min , 弃上清 , 加500 μL 1 × TE ,加3 μL
RNaseA(10 mg/mL)37℃, 30 min , 加 3μL pro-
teinaseK(10 ng/mL)37℃, 30 min , 取出加500 μL
酚:氯仿(1:1)抽提 ,离心15 min ,取上清 ,加70%乙
醇 ,离心4 min , 弃上清 , 室温干燥沉淀 , 加50 ～
100 μL 1 ×TE ,分装 ,用 721 型分光光度计测得
OD260 、OD280 、OD260/OD280值以确定 DNA 浓度和
纯度(表 1),电泳检查DNA有无降解(图 1)。或存
于 -20℃, 以备用。提取缓冲溶液:2%CTAB ,
1.42 mol/L NacL , 20 mmol/L EDTA(pH =8.0),
100 mmol/L Tris-HCL(pH=8.0), 2%PVP , 0.1%
抗坏血酸 ,0.2%β-巯基乙醇 。
1.3　扩增反应体系
每10μL 反应体积含1 μL 10×buffer;20 ng总
DNA;0.6μL (2.5 mmol/L)MgCl2;0.8 μL 的
dNTP
表 1　供试材料基因组 DNA 的紫外分析结果
Table 1　Results of optical density(OD)of materials
供试材料 Materials OD 260 OD280 OD 260/OD 280
中华蹄盖蕨 Athyrium sinense 0.019 2 0.010 2 1.882 4
蛾眉蕨 Lunathrium acrostichoides 0.024 6 0.013 2 1.863 6
羽节蕨 Gymnocarpium jessoense 0.007 3 0.004 0 1.825 0
冷蕨 Cystop teris f ragi lis 0.035 8 0.020 3 1.763 5
图 1　供试材料基因组 DNA 电泳结果
F ig.1　Electropho retic results of genomic DNA
of materials in A thy riaceae
(0.2μmol/L);Taq(5 U/μL)酶 1个单位;0.2μmol/ L
引物(0.5OD)0.2 mL ,其余体积以ddH2O补足。
1.4　扩增反应程序
在HYBAID PCR扩增仪上按下列程序进行扩
增:预变性92℃3 min , 36℃ 30 s , 72℃ 1 min , 1 个
循环;92℃变性1 min , 37℃退火1 min , 72℃延伸
2 min ,40个循环;72℃延伸10 min ,1个循环 。
1.5　扩增产物检测
取 10μL 扩增产物于1.4%琼脂糖凝胶电泳 ,
电泳缓冲液为 1×TAE 。在凝胶中加入0.5μg/mL
EB 。电泳完毕时于凝胶成像系统上观察拍照 。
2　结果与讨论
2.1　721紫外分光光度仪检测
一般说来 ,DNA 的OD260/OD280比值低于1.5 ,
则难进行 RAPD扩增[ 3] 。从表 1可以看出基因组
DNA 的比值均在1.7 ～ 1.9范围内 ,说明其内蛋白
质含量 、RNA等杂质较少 ,纯度好 。基因组电泳结
果如图 1 所示:DNA 主带清晰 , 片段大小约为
40 kb左右 。
2.2　模板浓度的影响
RAPD分析时不同植物使用的模板 DNA浓度
各不相同[ 4] ,图 2为不同水平的模板 DNA 对 PCR
扩增结果的影响 。比较了10 ～ 30 ng/μL的模板浓
度对扩增的影响。从扩增带型和扩增强度来看 ,模
板浓度低于10 ng/μL时(1泳道),扩增产物少且带
型模糊 , 15 ～ 25 ng/μL时 ,带型基本一致 ,重复性
好 ,模板浓度超过30 ng/μL时 ,带型有弥散现象 ,重
复性差 ,因此选择模板的最适水平为20 ng/μL。
2.3　Taq DNA聚合酶的影响
Taq DNA 聚合酶是扩增反应的关键因素 ,改
变 Taq DNA聚合酶浓度 ,从高到低共设置 6 个梯
度1.5 、1.25 、1.0 、0.75 、0.5 、0.25 U 。
图 2　模板 DNA 浓度对扩增带型的影响
Fig.2　Effect of template DNA concentration
on amplification pattern
344 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷
图 3　Taq DNA聚合酶浓度对扩增带型的影响
F ig.3　Effect of Taq polymerase concentration
on amplification pattern
表 2　随机引物的序列
Table 2　Sequence of random primer
序号 No. 序列 Sequence 序号 No. 序列 S equence
SBSA14 TCTGTGCTGG SBSA19 CAAACGTCGG
SBSP13 GGAGTGCCTC SBSQ02 TCTGTCGGTC
SBSQ10 TGTGCCCGAA SBSQ18 AGGCTGGGTG
由图 3 可见 , Taq DNA 聚合酶具有很高的活
性 ,即使在低浓度下(0.25 U)也有扩增结果 ,只是
条带稍少且不稳定;在高浓度(1.5 U)下带型丰
富 ,出现模糊现象 ,而且非特异性产物增多;1.0 U
和1.25 U扩增出的条带多且清晰 。Taq DNA 聚合
酶量太少 ,会导致产物量减少 ,量过多 ,成本高 ,易
出现非特异性扩增。从实验效果及节约实验费用
的角度考虑 ,在10 μL反应体中 ,1.0 U Taq DNA聚
合酶量较合适。
2.4　引物浓度的影响
本实验设置 6个不同的引物浓度:0.05 、0.10 、
0.20 、0.30 、0.40 、0.50μmol/ L(部分引物的序列见
表 2)。由图 4 看出:当 引物浓 度水平小 于
0.05 μmol/L(1泳道)时 ,扩增带少 ,亮度弱 ,扩增效
果不理想;当引物水平由0.1 ～ 0.4μmol/ L(2 ～ 5泳
道)逐渐升高时 ,扩增效果明显改散 ,带的数量增
多 ,亮度明显增强 ,且趋于稳定一致 。这是因为引
物浓度过低 ,无法与所有的模板 DNA 结合位点结
合 ,导致扩增结果不理想;引物浓度过高时 ,会促使
引物错误的引导非特异性产物—引物二聚体的合
成 ,非特异性产物和引物二聚体亦均是 PCR反应
的底物 ,与靶序列竞争 DNA 聚合酶和底物 dN TP ,
图 4　不同引物浓度的扩增带型的影响
Fig.4　Effect of concentration of primer
on amplification pattern
均使靶序列的扩增量降低 ,而出现非特异条带[ 5] 。
结合实验费用和效果等因素考虑 ,引物浓度应采用
0.2 μmol/L。
2.5　Mg 2+浓度的影响
镁离子浓度为 Taq酶活性不可缺少的辅助因
子 ,对反应的特异性和扩增效率有重大影响 。一般
PCR反应所用的镁离子浓度在0.2 ～ 2.5 mmol/L
之间[ 6] ,本实验参照标准的 PCR反应中各成分的含
量 ,设计了 Mg2+浓度梯度:0.1 , 0.2 , 0.5 , 1.0 , 1.5 ,
2.0 ,2.5 ,3.0 ,3.5 mmol/L。
由表 3 可 以 看出 , Mg2+ 浓度 在 1.0 ～
2.5 mmol/L都能扩出较好的带 。当 Mg2+浓度小
于0.5 mmol/L时 ,无扩增产物;当 Mg2+浓度等于
0.5 mmol/L时 ,产物不稳定;1.0 mmol/ L有扩增产
物;当 Mg2+浓度在1.5 ～ 2.5 mmol/L时 ,产生的条
带多 ,且清晰 ,以2.5 mmol/ L时 ,条带最多;当大于
2.5 mmol/L主带亮度减弱 ,且不稳定 ,出现非特异
性扩增。Mg2+较小变动可导致扩增产物较大差
异 ,可见 Mg2+浓度是 PCR 成功与否的关键因
素[ 7] 。本实验采用2.5 mmol/ L。
2.6　dN TP 浓度的影响
dNTP 是 PCR反应的原料 ,其浓度大小直接
影响产物的质量 、特异性及合成的可靠性。一般使
用浓度在 50 ～ 200 μmol/L 之间 ,过高会导致聚合
酶错误的渗入 ,过低又会影响合成效率 ,而影响扩
增效果[ 6] 。此实验在30 ～ 300 μmol/ L之间 ,设置了
dNTP 浓度梯度 。
表 3　Mg 2+浓度对 PCR反应的影响
Table 3　Effect of Mg2+ concentration on PCR reaction
Mg2+(mmol/ L) Template 20 ng　　Primer 0.2μmol/ L　　Taq 1.0 u　　dNTP200μmol/ L
0.1 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
结果 Results - - +/ - + ++ ++ ++ +/ - +/ -
　注:+有扩增产物;++表扩增效率;+/ -扩增产物不稳定
3453 期　　　　　　　　　　张秀英等:蹄盖蕨科 DNA 的提取和几种因素对 RAPD分析的影响
表 4　dNTP 浓度对 PCR反应的影响
Table 4　Effect of dNTP concentra tion on PCR reaction
dNTP(μmol/ L) Template 20 ng　　Primer 0.2μmol/ L　　Taq 1.0 u　　dNTP200μmol/ L
30 50 100 150 175 200 225 250 300
结果 Results - - +/ - + + ++ ++ ++ +/ -
　注:+有扩增产物;++表扩增效率;+/ -扩增产物不稳定
由表 4 可以看出 , 150 ～ 250 μmol/L都能产生
条带 ,当 dNTP 小于150μmol/L时 ,产生的条带弱
或无 ,不稳定;150 ～ 175 μmol/L时 , 有扩增产物;
200 ～ 250 μmol/L时条带间差异不显著 ,说明 PCR
反应对 dNTP 量的要求不很严格 ,150 μmol/L即可
满足扩增要求 ,随着量的增多 ,扩增产物也增多 ,但
过高时 ,其易与 Mg2+结合 ,从而降低游离 Mg2+浓
度 ,近而影响 Taq DNA 聚合酶的活性。因此在蹄
盖蕨科中采用200 μmol/ L为宜 。
2.7　退火温度的影响
退火温度是影响 RAPD反应最重要的条件之
一 ,它具有相对的灵活性 ,是优化 RAPD反应的重
要控制措施[ 8] 。在整个反应体系组成确定时 ,对
于热循环中的退火温度设置了 5个梯度 ,看其对扩
增结果的影响 。由图 5可见 ,温度低于 36℃或高
于39℃,不能得到满意的结果 ,引物退火所需的温
度取决于引物的碱基组成 、长度和浓度 ,合适的退
火温度应低于引物在PCR条件下真实 Tm(Tm=4
(G+C)+2(A+T))[ 9]值的5℃。对于 RAPD通常
使用的十个碱基的引物 ,退火温度一般低于40℃,
Williams指出 ,40℃以上的退火温度会抑制 RAPD
反应[ 10] 。温度只要在许可范围内就可得到扩增产
物 ,只是温度太低会出现非特异性片段 。因此建议
对蹄盖蕨科植物采用37℃的退火温度。
综上所述 ,模板 DNA的量 、引物浓度 、镁离子浓
度 、脱氧核苷三磷酸(dNTP)浓度 ,Taq 酶的用量以及
扩增程序等都会影响 DNA扩增 ,从而影响扩增产
物的重复性 ,以致影响 RAPD分析的可靠性[ 11] 。因
图 5　退火温度对扩增结果的影响
Fig.5　Effect of annealing temperature on amplification results
此 ,为了获得重复性好 ,可用于 RAPD分析的 DNA
片段 ,研究前进行以上条件的摸索 ,并加以确定 ,是
非常有必要的 。本实验确定了对于蕨类植物进行
RAPD 分析较理 想的扩增条件:2.5 mmol/L
Mg2+;0.2 mmol/ LdNTP;约20 ng总 DNA/10 μL
反应体积;引物浓度0.2 μmol/L;1 个单位较好的
Taq酶/10 μL反应体积 。在 RAPD实验进行中 ,改
变研究的物种或更换所用的药品 、仪器时 ,有必要对
实验条件重新进行摸索。任何条件的变化都可能引
起扩增带型的变化 ,为保证实验的精确性和可重复
性 ,对于特定物种的同一批 RAPD实验 ,应在优化实
验参数的前提下 ,尽可能地保持条件的恒定。
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