全 文 ：第 25卷　第 2期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2005年　4月Vol.25　No.2　　　　　　　　　　　　BULLETINOFBOTANICALRESEARCH April, 　2005
基金项目:国家自然科学基金(30170176)资助项目
第一作者简介:吕建洲(1957—),男 ,副教授 ,主要从事植物保护工作研究工作。
＊　通讯作者 Authorforcorrespondence　E-mail:hengqingzhang@ 163.com
收稿日期:2004-08-07
凉水 、丰林国家自然保护区红松居群遗传多样性的 RAPD分析
吕建洲　吴隆坤　刘德利　李　岩　裴　赢　张恒庆＊
(辽宁师范大学生命科学学院 , 大连　116029)
摘　要　采用了 RAPD分子标记技术分析了凉水和丰林国家自然保护区红松(Pinuskoraiensis)居
群的遗传多样性 。 10个随机引物检测到 61个可重复的位点 ,多态位点比率为 0.693 5。Nei指数
统计结果表明 , 红松的遗传多样性凉水居群(0.263 4)大于丰林居群(0.260 7)。对比分析了这
两个天然红松居群的遗传多样性变化 ,红松种内的遗传变异主要存在于居群内 ,居群间存在一定
的遗传分化 。
关键词　红松;遗传多样性;RAPD
ComparisonofgeneticdiversityofPinuskoraiensisintwonationalnature
reservesbyRAPDmarker
L Jian-Zhou　WULong-Kun　LIUDe-Li　LIYan　PEIYing　ZHANGHeng-Qing＊
(ColegeofLifeScience, LiaoningNormalUniversity, Dalian　116029)
Abstract　WithRAPDmethod, thepaperstudiedgeneticdiversityanddiferentiationoftwonatural
populationsofPinuskoraiensisinLiangshuiNationalNatureReserveandFenglinNationalNatureRe-
serve.ThroughtheamplificationofRAPDwith10randomprimers, 61repeatablelociweredetected, in
theamplificationandpercentageofpolymophiclociwas0.693 5%.Nei sindexshowedthelevelsof
geneticdiversityofLiangshuipopulation(0.263 4)washigherthanFenglin (0.260 7);geneticvaria-
tionexistedmainlywithinpopulations, therewerelitlegeneticdiferentiationbetweenpopulations.
Keywords　Pinuskoraiensis;geneticdiversity;RAPD
红松林在中国分布于长白山 、张广才岭 、完达
山和小兴安岭的低山和丘陵地带 ,是我国东北东部
山区地带性顶级群落 。百年前天然红松阔叶林曾
是覆盖东北山区最主要的植被类型 ,但是由于上个
世纪人类的大规模采伐 ,绝大部分的红松遭到破
坏 ,使得红松的天然分布区域逐渐缩小。
RAPD技术是 1990年由 Wiliams和 Welsh首
先提出的[ 1] ,该技术利用一个随机的寡核苷酸引
物 ,通常是 10个核苷酸 ,以生物的基因组 DNA作
模板进行 PCR扩增反应 ,经琼脂糖凝胶电泳来检
测 DNA序列的多态性 。 20世纪 90年代以来
RAPD标记广泛应用于动植物遗传育种 、基因诊
断 、种群遗传学 、生物系统与进化的研究 。早在
1991年 Sederof等用 RAPD标记构建了火炬松
(Pinustaeda)具有 200个 RAPD位点的遗传图
谱[ 2] ;Mosseler等用 RAPD标记确认了濒危松属植
物(Pinuspine)低水平的遗传多样性[ 3] 。随后欧洲
赤松(Pinussylvestris)[ 4 ～ 6] ,白云杉和恩氏云杉(Pi-
ceaglauca和 P.engelmanni)[ 7] ,辐射松(Pinusra-
diata)[ 8] ,银杉(Cathayaargyrophrla)[ 9] ,红松(Pi-
nuskoraiensis)[ 10, 11] 等树种相继进行了 RAPD研
究。
本研究用 RAPD分子标记技术 ,对中国东北地
区的凉水和丰林两个国家级自然保护区内的天然
红松(Pinuskoraiensis)居群进行了遗传多样性 、遗
传结构研究 ,为合理地保护 、利用与开发红松遗传
资源提供可靠的科学依据 。
1　实验材料和方法
1.1　实验材料
样本于 2002年 6月采自位于黑龙江省的凉
水 、丰林两个国家级自然保护区的天然红松林 。这
两个自然保护区都位于小兴安岭的南坡 ,是我国目
前保存下来最为典型和完整的原生红松针阔叶混
交林分布区之一 ,也是中国和亚洲东北部很具代表
性的温带原始红松针阔叶混交林区 。凉水国家自
然保护区本区地处小兴安岭南坡达里带岭支脉的
东坡 ,海拔高度在 280 ～ 707 m之间 ,为典型的低山
丘陵地貌;该保护区的主要保护对象是以红松为主
的温带针阔叶混交林生态系统统。丰林国家自然
保护区本区地处小兴安岭南坡 ,保护区地形平缓 ,
海拔 280 ～ 683m,为坡状的低山丘陵地和宽广谷
地 ,丰林河及汤旺河的支流贯穿全区;该保护区主
要保护对象为原始红松母树林。由于保护区地形
和保护目标的差异 ,目前这两个保护区内的林型也
有很大的差异。
采样时分单株取样 ,个体的间距大于 500 m,
取当年生幼叶 ,所有样品均采自 150年树龄以上的
成年树 ,其中凉水自然保护区样本数为 40个 ,丰林
自然保护区的样本数为 34个。采集的针叶用塑料
袋装好 ,于 0 ～ 4℃条件下带回实验室 ,超低温冰箱
保存 ,用于提取 DNA。
1.2　实验方法
1.2.1　DNA的提取
采用前文 [ 10] 方法提取红松总 DNA。 DNA溶
于0.1×TE缓冲液 ,琼脂糖凝胶电泳后 ,用美国冷
泉港 P41G型凝胶成像系统照相 ,采用 GelPro32
软件对比样品条带与 DL2000分子量标准的亮度
测定 DNA浓度 ,用于 PCR反应的模板用双蒸水稀
释后备用。
表 1　用于红松 RAPD分析的随机引物及序列
Table1　RandomoligonucleotideprimersandsequencesforP.koraiensisRAPD
引物
Primers
引物序列
Sequences
(5′-3′)
引物
Primers
引物序列
Sequences
(5′-3′)
引物
Primers
引物序列
Sequences
(5′-3′)
引物
Primers
引物序列
Sequences
(5′-3′)
UBC-184 CAAACGGCAC UBC-213 CAGCGAACTA UBC-225 CGACTCACAG UBC-295 CGCGTTCCTG
UBC-564 CGGCGTTACC UBC-460 ACTGACCGGC UBC-504 ACCGTGCGTC UBC-519 ACCGGACACT
UBC-570 GGCCGCTAAT UBC-600 GAAGAACCGC
1.2.2　引物的筛选
RAPD引物采用 UBC的 ConiferKitPrimers试
剂盒 ,经预备试验选择扩增产物稳定 、重复性好的
引物对所有个体的总 DNA进行扩增 ,从 50个检测
引物中共筛选出 10个引物 ,引物的序列见表 1。
1.2.3　红松 RAPD的反应体系
RAPD参照张恒庆等的方法[ 12] ,经 5次重复
实验优化后确定反应体系如下:总体积20 μL,包括
30 ng基因组 DNA, 15ng随机引物 , 125 μmol/L
dNTP混合物 , 1 UTaqDNA聚合酶 , 2.0 mmol/ L
MgCl2。反应程序为:94℃预变性 5min;35次热循
环 ,条件为 94℃、1 min, 36℃、 1min, 72℃、2 min;
最后在 72℃下延伸7 min。RAPD每次反应均设一
空白对照 ,以无菌 ddH2O代替模板 ,以排除系统误
差。
PCR扩增试剂购自宝生物工程(大连)有限公
司 ,反应在 ThermoElectronCorporation公司生产的
Px2热循环仪中进行。
1.2.4　扩增产物的检测
采用水平板琼脂糖凝胶电泳技术 , 检测 PCR
扩增结果。在 0.5xTBE电泳缓冲液中 , 凝胶浓度
为1.2%,以 DL2000作为分子量标准 , 进行稳压电
泳 ,电压 3V/cm,电泳结束后 ,用美国冷泉港 P41G
型凝胶成像系统照相 , 记录实验结果 。只记录那
些电泳谱带清晰 , 并能在重复实验中稳定出现的
位点 。根据各条带的迁移率及带的有无 ,记录位点
带的出现与否 ,有带记为 1,无带记为 0,与对照反
应产物具有相同迁移率的带作为污染带 ,不予记
1932期 吕建洲等:凉水 、丰林国家自然保护区红松居群遗传多样性的 RAPD分析
录 。
1.2.5　数据统计分析
在 RAPD分析中 , 电泳图谱中的每一条带作
为一个分子标记 (molecularmarker),它代表了模
板上与引物互补的一对结合位点 (locus),在本实
验条件下 ,迁移率相同的谱带视为同源位点。个体
间多态性主要是由于模板上两个或其中一个与引
物结合的位点发生碱基序列变异 ,表现为某一特定
扩增带的有或无;另一个产生多态的原因是模板上
与引物互补位点之间插入或缺失部分 DNA序列 ,
导致位点间距离发生变化 ,表现为扩增产物分子量
的差异 。本研究采用 POPGENEVERSION32软
件 [ 13] ,对实验结果进行统计分析 ,计算了各居群多
态位点比率(P)、Nei基因多样性指数(H)和遗传
分化系数(GST)。
2　实验结果
实验对凉水和丰林两个居群的 74个红松个体
的总 DNA进行了 RAPD分析 。每个引物检测到
的位点数在 2 ～ 11个之间 ,各位点的 DNA片段长
度介于 250 ～ 2 100 bp之间 ,共检测到 61个位点 ,
平均每个引物检测到 6.1个位点 。
2.1　多态位点比率
在 RAPD标记检测到的 61个位点中多态位点
为 46个 ,红松群体内多态位点比率为 0.693 5(表
2),居群间多态位点比率为凉水地区 >丰林地区。
表 2　红松居群内多态位点比率
Table2　PercentageofpolymorphiclociwithinpopulationsP.Koraiensis
居群
Population
样本数
Samplesize
位点数
Totalloci
多态位点数
Polymorphicloci
多态位点比率
Percentageofpolymorphicloci
凉水 40 61 40 0.645 2
丰林 34 59 37 0.596 8
合计 Total 74 61 43 0.693 5
表 3　用 Nei指数估算的红松龄居群内 、居群间遗传多样性及遗传分化
Table3　GeneticdiferentiationandgenediversitywithinandamonggroupsofP.koraiensisestimatedbyNei sindex
引物 Primers 居群内基因多样性 HAC 总基因多样性 HT 居群间基因多样性 DST 遗传分化系数 GST
Ave. 0.267 1 0.291 9 0.024 8 0.084 9
2.2　用 Nei指数计算的红松遗传多样性
由 Nei指数估算的凉水居群红松遗传多样性
为 0.263 4、丰林居群 红松的 遗传多 样性为
0.260 7。红松居群内 、居群间的遗传多样性及遗
传分化见表 3。
由上述结果可以看出红松的遗传多样性凉水
居群大于丰林居群 。居群间遗传分化系数为
0.084 9,说明红松遗传多样性主要存在于居群内 ,
只有不足8.5%的遗传多样性存在于居群间。
3　讨论
对红松群体的遗传多样性研究开始于上世纪
90年代 ,最早的报道主要集中在等位酶水平。杨
一平等 [ 14]对 4个天然红松群体进行了 3种酶 4个
位点的分析 , Kim[ 15]对 8个红松群体进行了 15种
酶 23个位点的研究 , 祖元刚等[ 16]分析了 3个红松
群体的 10种等位酶 18个位点的多样性 。对已报
道的天然红松群体的等位酶研究结果的统计表明 ,
红松群体的平均多态位点比率为 70.24%,居群间
的遗传分化低于 6%。红松在等位酶水平上检测到
的遗传多样性在松属植物中基本处于中等水平 ,在
植物界中则处于较高水平 [ 17] 。本研究在 DNA水
平上检测到的红松天然群体的遗传多样性与蛋白
水平上的研究结果具有一致性 ,在居群间的遗传分
化上 , DNA水平上检测到的遗传分化高于等位酶 。
针对松科植物的 RAPD分析虽然已有报道 ,但由于
资料尚不充分且已有的结果中物种间的差异较大 ,
还无法对松科植物在 DNA水平上的多态状况做一
归纳 。例如:Mosseler等[ 2]对纽芬兰岛多脂松群体
进行 69个引物的 RAPD分析 ,发现所有位点均为
194 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷
单态;Szmidt等[ 4]对欧洲赤松的两个群体的 RAPD
分析中 ,多态位点比率达到 88.65%;汪小全等[ 9]对
银杉进行了 RAPD分析 ,多态位点比率仅为 32%;
Khasa和 Dancik[ 7] 对白云杉和恩氏云杉的 RAPD
分析表明 ,多态位点分别占总位点的 74%和 70%。
对于红松群体的遗传多样性 DNA水平上的研究 ,
主要集中于我国学者的 RAPD分析 。张恒庆等 [ 10]
曾对凉水国家自然保护区 8个样地 72个红松个体
进行了 RAPD分析 ,多态位点比率为 58.51%。夏
铭等[ 11]采用 RAPD技术分析了中国东北 3个天然
红松居群 60个个体 ,多态位点比率为 57.68%。
本研究红松群体内总的多态位点比率为
69.35%,其中凉水居群为 64.52%、丰林居群为
59.68%。从已发表的红松 RAPD研究结果看(表
4),本研究所获得的红松遗传多样性要高于以往
研究的结果 。对比不同研究的采样策略 、所用的引
物检测位点数目 、树木年龄 ,样地的生态条件 ,我们
认为下列因素是影响 RAPD结果的主要因子:
(1)样本的数量 。在遗传多样性的 RAPD分
析中 ,不同的研究目的所使用的样本数量和检测位
点数量是各有侧重的 ,对比夏铭与张恒庆研究结
果 ,我们可以看出 ,虽然检测的位点数量两者相差
一倍多 ,但由于后者检测了更多的样本 ,检出的多
态位点比率仍然超出前者 。因此 ,作者认为在进行
群体遗传多样性检测时 ,保证一定的样本数量是必
要的 。
(2)采样策略 。除样本数量外 ,采样策略即样
品的代表性是影响 RAPD分析结果的一个重要因
素。本文作者 2000年曾利用 RAPD技术分析过凉
水自然保护区五种林型下的红松遗传多样性 ,其采
样间距为 20 m;而本研究的样品间距在 500 m以
上。因此 ,虽然本研究所用样品数量没有以前的
多 ,但样品来自凉水保护区内更大的范围的个体 ,
样品包含了更多的遗传变异。
表 4　红松 RAPD研究结果
Table4　StatisticsofP.koraiensisRAPD
居群
Population
样本数量
Numberof
samples
引物数量
Numberof
primers
检测位点数量
Numberofloci
检测多态位点数量
Numberof
polymorphicloci
多态位点比率
Percentageof
polymorphicloci
Nei指数
Nei sIndex
资料来源
References
凉水 72 16 96 55 58.21 0.286 8 张恒庆 2000
凉水 20 38 227 121 53.3 0.256 7 夏铭 2001
虎林 20 38 216 114 52.78 0.240 6 夏铭 2001
黑河 20 38 215 108 50.23 0.243 6 夏铭 2001
凉水 40 10 61 40 64.52 0.263 4 本文
丰林 34 10 59 37 59.68 0.260 7 本文
与丰林自然保护区相比 ,凉水国家自然保护区
内保存着较多的遗传变异 ,这一结果与夏铭对凉
水 、虎林 、黑河三个红松群体遗传多样性研究相一
致 。凉水国家自然保护区保存着我国目前较大的
原始红松林 ,该地区也是红松的现代分布中心 [ 10] ,
该保护区的保护对象是以红松为主的温带针阔叶
混交林生态系统 。区内森林类型多样 ,生境范围较
宽 ,群体数量大 ,人为干扰很少 ,原始林中群落结构
复杂 ,物种丰富 ,气候 、土壤 、局部生境都很适合红
松生长 ,有利于遗传变异的积累 。丰林自然保护区
的地势较为平坦 ,目前保留的红松林近乎纯林 ,该
保护区是以红松母树林为保护目标的 ,成熟林和过
熟林比例较大 ,在管理中的一些卫生间伐等过程 ,
可能会导致一些遗传多样性的丢失 。
Hamrick曾指出[ 18] ,具有高水平遗传变异的植
物种多为寿命长 、地理分布广 、风媒授粉和处于演
替末期的物种 ,而红松基本具备了全部这些特征 。
但从红松的演化史来看 ,我国的红松分布区是第四
纪冰川结束后 ,从南部的避难中心朝鲜半岛向北迂
回形成的 [ 3, 10] 。由于红松地理分布的特点和亚洲
东北部受冰川侵袭路线的影响 ,冰期红松种群的数
量会大大减少 ,使其种内的遗传多样性遭到损失 ,
形成 “瓶颈效应 ”,从而使红松的遗传多样性低于
应有的水平 ,同样的结果也发生于纽芬兰岛多脂松
群体 [ 3] 。
近一个世纪以来 ,由于受到人类的经济活动的
1952期 吕建洲等:凉水 、丰林国家自然保护区红松居群遗传多样性的 RAPD分析
影响 ,红松的总面积急剧减少 ,斑块数量增多 ,针阔
混交林的景观多样性和均匀性降低 ,使得红松的个
体数量和遗传多样性均受到损失。又由于红松是
长寿命物种 ,其遗传变异的积累需要相当长的时
间 。因此 ,红松遗传多样性一旦丢失很难恢复 ,对
现存红松针阔混交林的保护应该得到足够的重视。
参　考　文　献
1.WiliamsJGK, UbalikKAR, LivakJ, etal.DNApolymor-
phismsamplifiedbyarbitaryprimersareusefulasgenetic
markers.NucleicAcidResearch, 1990, 18:6531 ～ 6535
2.SederofR.Genomemappinginpinestakeshape.Probe,
1991, 1:1 ～ 3
3.MosselerA, EggerKN, HughesGA.Lowlevelsofgenetic
diversityinredpineconfirmedbyrandomamplifiedpoly-
morphicDNAmarkers.CanJForRes, 1992, 22:1332 ～
1337
4.LuMZ, SzmidtAE, WangXR.InheritanceofRAPDfrag-
mentsinhaploidanddiploidtissuesofPinussylvestris
(L.).Heredity, 1995, 74:582 ～ 589
5.SzmidtAE, WangXR, LuMZ.Empiricalassessmentofal-
lozymeandRAPDvariationinPinussylvestris(L.)using
haploidtissueanalysis.Heredity, 1996, 76:412 ～ 420
6.LuMZ, WangXR, SzmidtAE.Molecularpropertiesof
RAPDsinPinussylvestris(L.)andtheirimplicationsforge-
neticanalysis.ForestGenetics, 1997, 4(4):227 ～ 234
7.KhasaPD, DancikBP.Rapididentificationofwhite-En-
gelmannsprucespeciesbyRAPDmarkers.Theoreticaland
appliedgenetics, 1996, 92:46 ～ 52
8.HongYP, HipkinsVD, StraussSH.ChloroplastDNAdi-
versityamongtrees, populationsandspeciesintheCalifor-
niaclosed-conepine(Pinusradiata, P.miuricataandP.
attanuata).Genetics, 1993, 135:1187 ～ 1196
9.汪小全 , 邹喻苹 , 张大明.银杉遗传多样性的 RADP分
析.中国科学(C辑), 1996, 26(5):436 ～ 441
10.张恒庆 , 安利佳 , 祖元刚.凉水国家自然保护区天然红
松林遗传变异的 RAPD分析.植物研究 , 2000, 20(2):
201 ～ 206
11.夏铭 ,周晓峰 , 赵士洞.天然红松群体遗传多样性的
RAPD分析.生态学报 , 2001, 21(5):730 ～ 737
12.张恒庆 ,安利佳 , 祖元刚.红松 RAPD实验中各组成成
分含量对实验结果的影向.植物研究 , 1999, 19(2):183
～ 188
13.YehHC, YangRC, BoyleTBJ, etal.Theuser-friendly
sharewareforpopulationgeneticanalysis.MolecularBiology
andBiotechnologyCenter.UniversityofAlberta, Canada,
1997
14.杨一平 , 王述礼 , 尹瑞雪.红松群体内和群体间同工酶
变异的研究.林业科学 , 1989, 25(3):201 ～ 207
15.KimZinSuch, SookWooLee.Geneticdiversityandstruc-
tureofnaturalpopulationofPinuskoraiensisinKorea.For-
estGenetic, 1994, 1(1):41 ～ 49
16.祖元刚 ,张恒庆 , 颜廷芬 , 等.天然红松林等位酶研究.
植物研究 , 1999, 19(1):75 ～ 79
17.葛颂 ,洪德元.遗传多样性及其检测方法.见:陈灵芝主
编.生物多样性研究的原理与方法.北京:中国科技出版
社 , 1994.123 ～ 140
18.HamrickJL, GodtMJW.AlozymediversityinPlantspe-
cies.In:BrowADH.CleggMT, KahlerALandWeirBS
eds.PlantPopulationGenetics, BreedingandGeneticRe-
sources.Sunderland:Sinauer, 1990, 43 ～ 63
196 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷