全 文 ：第24 卷　第 4期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　10月
Vol.24　No.4　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2004
第一作者简介:吴建慧(1966—),女 ,硕士 ,主要从事植物逆境生理生化研究工作。
＊通讯作者Author for correspondence.
收稿日期:2004-01-05
低温胁迫下玉米幼苗叶片活性氧的产生及保护酶活性的变化
吴建慧1　杨　玲1　孙国荣2＊
(1.东北林业大学 ,哈尔滨　150040)
(2.扬州大学生物科学与技术学院 ,扬州　225009)
摘　要　在光照和黑暗条件下 ,对低温胁迫玉米幼苗叶片中超氧自由基(O2—·)产生速率 、超氧化物歧
化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)动态变化过程的研究结果表明 ,不同强度低温胁迫
后 ,O2—·产生速率增加;保护酶 SOD 、CAT 活性下降 ,POD活性升高。同一低温胁迫下光照处理后的O2—·
产生速率 、SOD 、CAT 、POD活性与黑暗处理相比差异达到极显著水平。
关键词　玉米幼苗;低温胁迫;光照;活性氧;保护酶
Generation of activated oxygen and change of cell defense enzyme activity
in leaves of maize seedling under the stress of low temperature
WU Jian-Hui1　YANG Ling1　SUN Guo-Rong2＊
(1.Northeast Forestry University ,Harbin　150040)
(2.College of Biosciences and Biotechnology , Yangzhou University , Yangzhou　225009)
Abstract　Changes of activated oxygen O2—· , activity of enzymes involving cell defense in leaves of maize
seedling after effects of low temperature and light were studied.The results showed that the generation rate of
activated oxygen O2
—· increased;the activities of SOD and CAT decreased and POD increased under different low
temperature stress;many notable distinguishes in facts such as generation of activated oxygen O2—· and changes
of the activities of SOD , CAT , POD had been found between light and dark after the same low temperature
stress.
Key words　maize seedling;low temperature stress;light;activated oxygen;cell defense enzyme
在环境胁迫下 ,绿色植物中由活性氧造成的氧
化胁迫是一种普遍现象[1 , 2] 。近年来 ,有关逆境胁迫
对植物细胞伤害的活性氧代谢机制研究正日益深
入[ 3～ 5] 。植物在正常情况下 ,体内活性氧产生与清
除处于平衡状态 ,不会导致细胞伤害[ 6] 。但逆境胁
迫会促进活性氧产生 ,严重时导致植物伤害或死
亡[ 7] 。植物对氧化胁迫的抗性与活性氧自由基清除
能力的大小密不可分。超氧化物歧化酶(SOD)、过
氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等是植物体内自
由基的清除剂 ,三者协调一致使生物自由基维持在
正常水平从而防止自由基伤害 ,因此它们被称为保
护酶系统[ 6] 。根据这一理论已对许多植物的抗寒机
理进行了研究[ 4 ,8～ 10] 。
6～ 10℃的低温可以使有些热带植物遭受寒害 ,
甚至死亡[ 11] 。起源于热带的玉米 ,是一种喜温的C4
植物 ,它对温度条件要求较高 ,在生长期内受到低温
冷害的侵袭常造成大幅度减产。不少学者已从气
象 、栽培的角度对低温下玉米生育期延迟 、产量下
降[ 12 ,13]等作过报道 ,但有关玉米在低温胁迫下特别
是有光照的低温胁迫下活性氧代谢机制研究尚少见
报道。本文在黑暗和光照条件下对低温胁迫玉米幼
苗叶片活性氧的产生和保护酶的变化进行研究 ,以
期从活性氧的产生与清除的角度 ,揭示玉米幼苗在
低温条件下的生理反应机制 ,为进一步有效地防御
低温冷害 ,提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料吉单 141玉米种子 ,由黑龙江省农科
院提供。玉米种子经25℃24 h浸种后 ,置于恒温培
养箱中(DHP—781)28℃催芽72 h , 发芽后播种在装
有珍珠岩的营养钵中 ,浇以 Hoagland营养液培养 ,在
植物生长箱中(25℃/18℃,12 h光照/12 h黑暗 ,光照
强度为4 000 Lx)长至 3叶 1心期。将上述幼苗分为
4组 ,分别置于8℃+光照(白天)、8℃+黑暗 、2℃+
光照(白天)和2℃+黑暗条件下处理7 d ,光照强度
为3 000 Lx 。并于处理的 0、1 、3 、5 、7 d分别取幼苗叶
片进行各项生理指标的测定。各处理的 0天即为对
照(25℃+光照)每组实验均设 3个重复。
1.2　方法
1.2.1　超氧自由基(O2—·)产生速率的测定
按Hassan[ 14]和周志刚[ 15]等的方法 。反应体系
为0.01mol/L甲硫氨酸(Met),2.5×10-5 mol/L核黄素
(RFV),1.65×10-4mol/L氮蓝四唑(NBT), 0.2 mol/L
磷酸钾缓冲液(pH 8.0)和叶提取液。取0.25 g鲜叶
加1.5mL 62.5%磷酸缓冲液(pH 7.8),冰浴研磨匀
浆。15 000 r/min离心15min ,上清液即为叶提取液 ,
在自然光下照光5 min后立即测定。其原理为核黄
素分子在还原剂甲硫氨酸存在下 ,吸收一个光子被
还原为半醌形式 ,或者自氧化产生O2—· ,O2—·将 NBT 还
原为蓝色产物 ,其最大吸收在560 nm处 ,O2—·的清除剂
可使OD560值降低 ,用光反应前后体系溶液 OD560之
差值表示O2—·的量 。O2—·产生速率以■OD560min-1·μg-1
protein表示。
1.2.2　超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
酶液的制备[16] :取0.25 g鲜叶加62.5%(pH 7.8)
磷酸缓冲液1.5 mL ,冰浴研磨匀浆。15 000 r/min离
心15min ,上清液即为酶液。酶活性测定参照刘祖
祺[ 17]方法 ,以抑制NBT光化还原50%作为一个酶活
力单位(U),酶活性以U min-1·μg-1 protein表示。
1.2.3　过氧化氢酶(CAT)活性的测定
酶液的制备同 SOD。酶活性测定采用高锰酸钾
滴定法[ 16] , 酶活性用mg·H2O2 min-1·μg-1 protein 表
示。
1.2.4　过氧化物酶活性的测定(POD)
酶液的制备与 SOD制备相同。酶活性测定采
用愈创木酚显色法[ 18] 。酶活性以每分钟OD470增加
0.01为一个酶活力单位(U),酶活性以U min-1·mg-1
protein表示 。
2　结果与分析
2.1　光照和黑暗条件下低温胁迫玉米幼苗叶片超
氧自由基(O2—·)的变化
O2
—·是形成其它活性氧的主要分子 ,它伤害植物
的机理之一在于参与启动膜脂过氧化或膜脂脱脂作
用[ 19] ,从而破坏膜的结构。经低温处理后玉米幼苗
叶片O2—·产生速率增加(图 1)。在光照和黑暗条件
下 ,同一低温处理的 O2—·产生速率的变化趋势相似;
不同低温处理的O2—·产生速率存在差异。2℃低温处
理的幼苗 ,O2—·产生速率在低温胁迫进程中 ,逐渐升
高 ,后期回落。8℃低温处理的幼苗 ,O2—·产生速率在
胁迫初期不是升高而是下降 ,而后逐渐升高又回落 ,
但高于对照。2℃低温胁迫下的O2—·产生速率明显高
于8℃低温胁迫下的O2—·产生速率 ,两者差异达极显
著水平。同一低温下的光照处理与黑暗处理相比
O2
—·产生速率显著增加(表1)。
2.2　光照和黑暗条件下低温胁迫玉米幼苗叶片保
护酶活性的变化
2.2.1　超氧化物歧化酶活性的变化
低温胁迫使SOD活性降低(图 2)。在光照和黑
暗条件下 ,同一低温处理的 SOD变化趋势相似;不
同低温处理的SOD活性变化存在差异。2℃低温处
理的幼苗 ,其 SOD活性在胁迫的初期下降速率较
慢 ,从 第三天迅速下 降 , 比对照下降 24%和
44%。而8℃低温处理的幼苗 , 其SOD活性在胁
图 1　光照和黑暗条件下低温胁迫对O2—·产生速率的影响
Fig.1　Effect of low temperature stress under light or
dark on O2
—· generation
4574期　　　　　　　　吴建慧等:低温胁迫下玉米幼苗叶片活性氧的产生及保护酶活性的变化
图 2　光照和黑暗条件下低温胁迫对 SOD活性的影响
Fig.2　Effect of low temperature stress under light
or dark on SOD activity
迫的初期先升高后下降 ,且下降速率较慢 ,到第 5天
比对照下降26%和46%。2℃低温胁迫下的 SOD活
性明显小于8℃低温胁迫下的SOD活性 ,两者差异达
极显著水平 。同一低温下光照处理与黑暗处理相比
超氧化物歧化酶活性显著降低(表 1)。
2.2.2　过氧化氢酶活性的变化
低温胁迫降低玉米幼苗过氧化氢酶活性(图
3)。经光照及黑暗的同一低温胁迫后 ,玉米幼苗
CAT 活性的变化趋势相似。不同强度低温胁迫后
CAT 活性的变化存在差异。2℃低温处理的幼苗在
胁迫的初期 CAT 活性下降速率较快 ,处理3 d后分别
比对照下降30%和31%,在胁迫的后期下降速
图 4　光照和黑暗条件下低温胁迫对 POD活性的影响
Fig.4　Effect of low temperature stress under the light
and the dark on POD activity
图 3　光照和黑暗条件下低温胁迫对CAT 活性的影响
Fig.3　Effect of low temperature stress under light
or dark on CAT activity
率较缓慢 ,并保持在稳定的水平;而8℃低温处理的
幼苗 ,其 CAT 活性在胁迫的初期略有升高而后迅速
下降 ,在胁迫的后期下降速率平缓 ,但始终高于 2℃
低温处理的幼苗。2℃低温胁迫下的 CAT 活性明显
小于8℃低温胁迫下的CAT 活性 ,两者差异达极显著
水平。同一低温下的光照处理与黑暗处理相比过氧
化氢酶活性显著降低(表1)。
2.2.3　过氧化物酶活性的变化
低温胁迫使玉米幼苗过氧化物酶活性呈现先降
低后逐渐升高的变化趋势(图4)。光照及黑暗条件
下同一低温处理后的 POD活性变化趋势相似 ,不同
低温处理的 POD活性的变化略有不同。2℃低温处
理的幼苗 ,其 POD活性在低温胁迫的前3 d逐渐降
低 ,比8℃低温处理的降低幅度大 ,即对低温更敏感。
延长胁迫时间 ,POD活性开始迅速升高 ,升高的速率
明显高于8℃低温处理的幼苗。而8℃低温处理的幼
苗在胁迫的初期 POD活性略下降 ,下降速率相对较
慢 ,但始终高于2℃低温处理的幼苗。在胁迫的后期
POD活性升高 ,升高的速率低于2℃低温处理的幼
苗。不同强度低温胁迫使玉米幼苗过氧化物酶活性
差异达极显著水平;同一低温下光照处理与黑暗处
理相比过氧化物酶活性
表 1　光照和黑暗条件下低温胁迫玉米幼苗 O2—·产生速率 、SOD、CAT 、POD活性变化方差分析
Table 1　Variance analysis of the changes of O2—· generation rate , activities of SOD , CAT , POD after effects of low temperature and light
项目 Items 变异来源 Source of variant 平方和 DF 自由度 SS 均方 MS F 值 F
超氧自由基产生速率
Generation rate of O2
—·
不同温度间 Among temperature/ temperature 1 33.190 37.276 885.44＊＊
同一低温光照与黑暗间 Among light/dark 1 3.850 0.180 7.82＊
SOD 酶活性 不同温度间 Among temperature/temperature 1 326.606 340.180 900.69
＊＊
同一低温光照与黑暗间 Among light/dark 1 29.750 29.718 78.68＊＊
CAT 酶活性 不同温度间 Among temperature/ temperature 1 70.458 87.642 608.84
＊＊
同一低温光照与黑暗间 Among light/dark 1 12.470 0.594 5.43＊
POD酶活性 不同温度间 Among temperature/ temperature 1 0.844 0.880 20.76
＊＊
同一低温光照与黑暗间 Among light/dark 1 0.430 0.429 10.13＊＊
458 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24卷
差异达显著水平(表 1)。
3　讨论
3.1　不同强度低温胁迫对玉米幼苗活性氧和保护
酶活性的影响
在8℃(不论黑暗还是光照)低温胁迫的第一
天 ,SOD 、CAT 活性升高 ,POD与正常情况相比没有
明显下降(图 2 ～ 4),此时植物体清除自由基的能力
提高 ,从而抑制了 O2—·的产生 ,使 O2—·的产生速率下
降(图 1)。随着胁迫间的延长 ,SOD 、CAT活性开始
下降 ,POD下降速率增加 ,O2—·的产生速率升高;在
胁迫的后期(后4 d),SOD 、CAT 继续下降 ,但下降速
率已明显减慢 ,此时 POD也由下降转为上升 ,整个
保护酶系统的清除能力明显加强 ,O2—·的产生速率
逐渐增加后出现下降趋势。在2℃(不论黑暗还是
光照)低温胁迫的进程中 ,胁迫前期 SOD 、CAT 、POD
活性明显下降 ,活性氧清除能力减小 ,O2—·的产生速
率升高 ,在胁迫的后期 , SOD 、CAT 下降速率减低 ,
POD活性由下降转为上升 ,O2—·的产生速率减慢 ,这
一点与8℃低温胁迫相同。综上所述 ,活性氧代谢
失调是玉米幼苗叶片低温胁迫下受伤的主要原因
之一。另外 ,实验从另一个侧面也反映出了玉米对
不同强度的低温反应不同。适当的低温胁迫温度
和时间(如温度为8℃和胁迫时间不超过1 d的情况
下),即在胁强和胁迫时间不超过植物活性氧调控
限度时 ,可诱导 SOD 、CAT 的活性提高(图 2 ,3),以
清除植物体内由于环境胁迫所产生的活性氧自由
基 ,从而避免活性氧自由基对植物的伤害 。在较低
的温度胁迫下 ,即胁强较大时(图 2 ～ 4),SOD 、CAT
和POD活性迅速降低 ,导致细胞 O2—·的产生速率升
高 ,膜受到伤害 。
3.2　低温胁迫下光照对玉米幼苗活性氧和保护酶
活性的影响
植物对氧化胁迫的抗性与活性氧清除能力的
大小密不可分。低温与光照的协同作用对冷敏感
植物番茄和黄瓜所造成的伤害比单独的低温处理
要严重的多。本研究中 ,与低温胁迫相比 ,光照对
玉米幼苗的胁迫伤害要小得多 ,光照加剧低温对玉
米幼苗的伤害。各指标的方差分析结果(表 1)均为
这一结论提供了有力的证据。
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