全 文 ：第 20 卷　第 2 期　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2000 年　4 月
Vol.20　No.2　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH April , 　2000
凉水国家自然保护区
天然红松林遗传变异的 RAPD分析
张恒庆1　安利佳3　祖元刚2
(1.辽宁师范大学生物系 , 大连　116029)
(2.东北林业大学森林植物生态学开放研究实验室 , 哈尔滨　150040)
(3.大连理工大学生物工程系 , 大连　116012)
摘　要　采用随机扩增多态 DNA(random amplif ied polymorphic DNA RAPD)技术 ,
研究了凉水国家自然保护区天然红松林的遗传变异水平及其分布规律。16个 10bp
长度的随机引物在 8个实验样地内 72个个体中共检测了 96 个位点 ,其中 55个是
多态位点 。在种水平上 ,红松的多态位点比率为 P =58.51%;Nei′s遗传变异指数
为H =0.2868;Shannon′s指数为 I=0.3654 ,所有的变异中 ,有 92.47%的变异存在
于样地内 , 7.53%的变异存在于样地间。根据各遗传多样性在不同样地的分布 ,初
步探讨了红松遗传变异水平与其种群发生及生境的相互关系。
关键词　红松;RAPD;遗传变异;遗传多样性
RAPD ANALYSIS ON GENETIC VARIATION
OF PINUS KORAIENSIS IN LIANG SHUI
NATIONAL NATURAL RESERVE
ZHANG Heng-qing1　AN Li-jia3　ZU Yuan-gang2
(1.Department of Biology LiaoN ing No rmal University Dalian 116029)
(2.Open Research Laboratory of Fo rest Plant Ecology , Northeast Forestry University , Harbin 150040)
(3.Department of Bioengineering , Dalian University o f Technology , Dalian 116012)
Abstract　The genetic variation and the regulation of genet ic diversity dist ribution of
Pinus koraiensis were studied by random amplified polymorphic DNA (RAPD)analy-
sis.72 individuals come from 8 plots in Liang Shui natural reserve were amplified by
PCR react ion.A total of 96 loci were obtained from 16 random primers , among which
55 loci w ere polymorphic.In species level , the percentage of polymorphic loci is P =
58.51%, Nei′s gene diversity is H =0.2868 and Shannon′s informat ion index is I=0.
收稿日期:1999-7-29
3654.The degree of genetic differentiation among 8 plots Gst=0.0753.According to
the characterized of every plot , relationship between the level of genetic variation and
character of populat ion habitat w ere discussed.
Key words　Pinus koraiensis;RAPD;genetic variation;genetic diversity
红松(Pinus koraiensis)是我国境内寒温带针阔混交林中的主要树种 ,至上世纪末还广
泛的分布于亚洲东北部 ,俄罗斯远东地区南部 ,朝鲜半岛和日本北部山区[ 1 , 2] 。自本世纪初
以来 ,由于人类活动的严重干扰 ,红松分布区面积急剧缩小 ,该地区原始的天然红松林逐渐
被次生的阔叶林取代[ 1 ,3] 。由于红松的巨大经济价值和生态学意义 ,从五十年代起 ,我国就
对红松的种群生物学 、生理学 、群落结构 、砍伐方式 、病虫害防治以及天然红松林的更新策略
进行了大量的研究工作 ,取得了很多的研究成果[ 4 ～ 6] 。但涉及红松遗传学方面的研究工
作 ,国内外却报道的不多 。黑龙江省凉水国家自然保护区地处中国东北东部小兴安岭山脉
的东南部 ———达里带岭支脉的东坡 。地理坐标为 128°48′30″～ 128°55′50″E ,47°7′39″～ 47°
14′22″N ,保护区总面积为 6394公顷 ,森林覆被率为 91.3%,是我国目前保存下来的较大片
的原始红松林之一 ,该地区也是红松的现代分布中心。保护区为典型的低山丘陵地貌 ,海拔
高度在 280 ～ 707m之间 ,山地平均坡度 10°～ 15°。本区地处欧亚大陆东缘 ,具有明显的温
带大陆性季风气候特征 ,年平均气温-0.3°,平均降水量 676.0mm ,平均相对湿度 78%,无
霜期 100 ～ 120天 ,本区气候特点是冬长夏短 ,夏季温凉多雨 ,冬季严寒干燥而多风雪 。
该保护区的主要保护对象是以红松为主的温带针阔叶混交林生态系。区内森林类型多
样 ,既有处于演替顶极状态的原始红松林 ,兴安落叶松林和云冷杉林 ,又有处于不同演替阶
段的次生林 ,几乎囊括了小兴安岭山脉的所有森林类型 ,它能为人类提供小兴安岭阔叶红松
林生态系统的原始本底资料 ,是小兴安岭林区开发前的真实缩影 ,具有很高的科学研究价
值。
1　材料和方法
1.1　样品的采集
实验所用材料于 1996年 6月在凉水国家自然保护区内采集 ,根据保护区内红松林生境
中坡向 ,立地型的差异 ,确定了 8个样地 ,每个样地采集 9个个体。结合红松主要伴生树种
的不同 ,将混交林划分为以下五种林型 。
1.枫桦红松林:主要伴生树种为枫桦(Betula costata)同时混生有云杉(Picea asperata)
和水曲柳(Faxinus mandshurica)。
2.椴树红松林:主要伴生树种为椴树(Tilia amurensis),同时混生有云杉 ,冷杉 Abies
fabri)和枫桦。
3.云冷杉红松林:主要伴生树种为云杉 ,冷杉 ,同时混生有枫桦 。
4.鱼鳞云杉红松林:主要伴生树种为鱼鳞云杉(Picea jezoensis),同时混有生椴树和色
木(Acer mono)。
5.白桦红松林:主要伴生树种为白桦(Betula platyphylla),同时混生有榆树(Umus
jappnica)。
分单株取样 ,样本间间隔大于 20米。所有样品均来自成体树 ,树龄在 120 ～ 200 年之
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间。采集当年生的幼叶 ,保存于 0 ～ 4℃带回实验室 。采集的具体情况见表 1。
表 1　 红松样品的来源及生态因子
Table 1 Sample size and habitat characteristics of the 8 plots
样地号
Plot No.
样品数
Samples
number
林型
Forest type
优势树种组成及比例
Dominante species and it′s percent
坡向
Exposure
立地型
Terrain
1 9 枫桦红松林 红松 7/枫桦 2/云杉 1 北 阴面斜坡
2 9 椴树红松林 红松 5/椴树 3/枫桦 1/冷杉 1 东北 阴面缓坡
3 9 云冷杉红松林 红松 5/云杉 3/冷杉 2 东南 阳面缓坡
4 9 枫桦红松林 红松 8/枫桦 1/水曲柳 1 西南 阳面缓坡
5 9 鱼鳞云杉红松林 红松 6/鱼鳞云杉 2/椴树 1/色木 1 东南 阳面斜坡
6 9 白桦红松林 红松 5/白桦 3/冷杉 1/榆树 1 西北 阴面缓坡
7 9 云冷杉红松林 红松 5/云杉 2/冷杉 2/枫桦 1 东北 谷地
8 9 椴树红松林 红松 4/椴树 2/冷杉 2/云杉 1/枫桦 1 西南 阳面斜坡
1.2　模板 DNA提取:
采用改进的 CTAB方法提取红松幼叶的总 DNA[ 7] ,粗提的 DNA 用 RNase A 和蛋白酶
K纯化处理后 ,经紫外分光光度计(DU-T 型)和琼脂糖凝胶电脉-EB染色的荧光强度双
重测定 DNA含量 ,用于 PCR反应的 DNA 模板用 0.1×TE 稀释至使用浓度 。
1.3　PCR扩增
PCR反应在 200μl的薄壁反应管中进行 ,总反应体积 20μl ,反应中引物购自 Operon 公
司 ,DNA聚合酶购自北京天象人生物工程公司 ,扩增反应在 PE -9600 型 PCR仪上进行。
每次反应均设一空白对照 ,以无菌 ddH2O 代替模板 ,以排除系统误差。PCR反应体系及扩
增条件同前[ 7] 。
本研究从 80个引物中筛选出 16个能够获得稳定扩增产物的引物 ,用这些引物对所有
个体进行了 PCR扩增 ,引物序列及检测的位点数目见表 2。
1.4　扩增产物的检测
采用水平板琼脂糠凝胶电泳技术 ,检测 PCR扩增结果 ,在 0.5xTBE电泳缓冲液中 ,凝
胶浓度为 1.2%。以λDNA/Ecor Ⅰ/Hind Ⅲ作为分子量标准 ,进行稳压电泳 ,电压 3V/cm ,
电泳时间为 3小时。电泳结束 ,经 EB 染色后在 UV300型透射紫外灯下照相 ,记录实验结
果。记录时只记那些电泳谱带清晰 ,并能在重复实验中稳定出现的位点 。根据各分子量标
记的迁移率及带的有无 ,统计记录位点带的出现与否 ,有带的记为 1 ,无带的记为 0 ,与对照
反应产物具有相同迁移率的带子作为污染带 ,不予记录 。
1.5　数据统计分析
在 RAPD分析中 ,电泳图谱中的每一条带作为一个分子标记(molecular marker),它代
表了模板上与引物互补的一对结合位点(locus),在本实验条件下 ,迁移率相同的谱带视为同
2032 期　　　　　张恒庆等:凉水国家自然保护区天然红松林遗传变异的 RAPD 分析
源位点。个体间多态性主要是由于模板上两个或其中一个与引物结合的位点发生碱基序列
变异 ,表现为某一特定扩增带的有或无 ,另一个产生多态的原因是模板上与引物互补位点之
间插入或缺失部分 DNA 序列 ,导致位点间距离发生变化 ,表现为扩增产物分子量的差异。
本研究采用 POPGENE软件[ 8] 。对实验结果进行统计分析 。计算了各样地多态位点比率
(P);Nei氏遗传变异指数(H);Shannon′s指数(I)。分析了红松遗传多样性在样地间的分
布。
表 2 引物的核苷酸序列及检测的位点数
Table 2　Sequencs of DNA oligonucleotide primers and the numbers of loci detected
引物
Primer
核苷酸序列(5～ 3)
Primer sequences
检测位点总数
Detected loci number
单态位点数
Monmorphic loci
多态位点数
Polymorphic loci
OPH-07 CTGCATCGTG 6 2 4
OPI-01 ACCTGGACAC 5 3 2
OPI-09 TGGAGAGCAC 4 1 3
IPI-14 TGACGGCGGT 6 3 3
OPN-16 TCTCCGCCCT 7 2 5
OPN-01 CTCACGTTGG 5 3 2
OPN-09 TGCCGGCTTG 7 2 5
OPN-12 CACAGACACC 8 5 3
OPP-14 CCAGCCGAAC 6 2 4
OPQ-01 GGGACGATGG 9 3 6
OPQ-06 GAGCGCCTTG 5 3 2
OPQ-12 AGTAGGGCAC 3 3 0
OPQ-19 CCCCCTATCA 7 2 5
OPZ-12 TCAACGGGAC 7 1 6
OPZ-15 CAGGGCTTTC 4 2 2
OPZ-20 ACTTTGGCGG 5 2 3
Total 16 94 39 55
2　结　果
本研究在 16个随机引物对 72个红松个体的扩增中共检测了 94个位点 ,扩增出的有效
片段长度介于 280 ～ 2.4kb 之间 。每个引物检测的位点数在 3 ～ 9 之间 。多态位点比率
(P);Nei′s氏遗传变异数(H);Shannon′s(I)指数在各个样地的分布见表 3。
从表 3中我们可以看出 ,在凉水保护区内 ,分布于西南方向阳面斜坡上的椴树红松林(8
号样地)中的红松各项遗传多样性处于最高水平 。而分布于东北方向的谷地中的云冷杉红
松林(7号样地)中的红松遗传多样性水平最低。在各样地平均水平上红松多态位点百分比
为 P=45.32(SD=3.807);Nei′s遗传多样性为 Ht=0.1888(SD=0.0260);Shannon′s指数
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为 I=0.2588(SD=0.0374)。在种的水平上红松多态位点百分比为 P=58.15%,Nei′s遗传
多样性为 Ht=0.2868 。样地间的遗传分化为 Gst=0.0753 。即在凉水国家自然保护区内红
松的遗传变异有 92.47%存在于不同的林型内部 ,7.53%变异存在于样地之间。
表 3 红松遗传多样性在 8个样地中的分布
Table 3 Genetic variation in 8 plots of P.koraiensis
Plo t No. P(%) H I
1
2
3
4
5
6
7
8
45.25
47.69
42.17
46.82
44.08
48.24
38.21
50.12
0.1825(0.1766)
0.1959(0.2439)
0.1794(0.2103)
0.1836(0.2122)
0.1854(0.2843)
0.2102(0.2085)
0.1416(0.1875)
0.2317(0.2654)
0.2568(0.1852)
0.2775(0.2683)
0.2237(0.1928)
0.2603(0.2531)
0.2706(0.2875)
0.2819(0.1897)
0.1892(0.2644)
0.3104(0.2918
3　讨　论
红松是裸子植物中的一个古老的树种 ,化石资料和古地理研究证明 ,至少在第三纪的中
新世红松就存在于东亚地区[ 9] 。红松具有长寿命 ,风媒传粉 ,依靠动物传播种子的生活史
特点[ 10 ,11] 。这些特点使红松具有较高的基因重组频率 ,天然红松林中具有较高的杂合率。
对红松的等位酶分析已证实了这一点[ 12～ 14] 。然而 ,在红松的演化进程中 ,第四纪冰川时期
的气候变迁使红松种群数量大为减少 ,由此造成的瓶颈效应 ,直接影响了现代红松基因库的
规模 。因为对于象红松这样长寿命的物种来说 ,遗传多样性和种群数量的恢复过程是十分
缓慢的。因此 ,与松科其他研究结果相比较 ,红松在 DNA多态水平上表现出来的遗传多样
性仅处于中等水平[ 15 ～ 17] 。
红松是一个耐荫树种 ,尤其是在其生长发育的早期 ,需要有其它阔叶树种的庇护[ 5] 。
本研究发现 ,分布于凉水保护区西南方向阳面斜坡上椴树红松林中的红松遗传多样性水平
较高 ,其原因很可能是这个坡向上的光照不如南坡那么强烈 ,在红松林发育早期 ,林中光照
不是很强 ,加之阔叶树的庇护 ,红松幼苗得到较好的生长条件。在红松林发育的中期 ,阔叶
树种由于受到光照的限制很容易被红松取代。另外 ,斜坡上排水条件较好 ,有利于红松生
长 ,光照和水分条件改善了红松的生长环境 ,增强了红松的竞争能力 ,使得在这个坡向的红
松林中保持了较高的遗传多样性。
在本研究调查的 8个样地中 ,来自谷地的云冷杉红松林中红松的遗传多样性最低。与
红松阔叶林相比 ,云杉冷杉红松林多分布于云杉冷杉林和红松阔叶混交林的相接地带 ,构成
狭窄的山地寒温性针叶林亚带 。在小兴安岭地区大多分布于海拔 700 ～ 800m 之间 ,但在冷
湿气候条件下 ,也可随云杉冷杉林而分布到低海拔地区 。在凉水保护区内 ,该种林型大多在
海拔 300 ～ 450m 之间 ,这种冷湿的立地条件 ,不利于阔叶树生长而红松却能适应。由此形
成的红松云冷杉林 ,也是本地区有特色的主要森林植被类型 。但是 ,因为这种林型处于红松
2052 期　　　　　张恒庆等:凉水国家自然保护区天然红松林遗传变异的 RAPD 分析
分布的边缘地区 ,加之生境中的水 ,热条件恶劣 ,红松的自然选择压力增大 ,由此导致该林型
中红松遗传多样性的贫乏 。
结合红松的遗传多样性水平和种群生活史分析 ,红松是一个稳定种群 。但是 ,由于红松
的生殖周期很长 ,受强烈干扰后 ,红松遗传多样性和种群数量的恢复过程是十分缓慢的。因
此 ,保护现存天然红松林免受人类活动的干扰 ,是恢复和重建该地区红松阔叶林生态系统的
当务之急 。
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