全 文 ：第 源员 卷摇 第 远 期
圆园员源 年 员圆 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源员摇 晕燥援 远
阅藻糟援 摇 圆园员源
基金项目院 国家公益性行业渊农业冤科研专项渊圆园员猿猿园员怨冤袁西北农林科技大学 圆园员猿年校级大型仪器设备新功能开发项目
作者简介院 宋月袁女袁员怨愿园年生袁实验师袁研究方向为昆虫内共生菌与寄主互作袁 耘鄄皂葬蚤造院 泽燥灶早赠怎藻源园怨岳 员圆远援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则泽 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 贼曾造蚤怎岳 灶憎泽怎葬枣援 藻凿怎援 糟灶
收稿日期院 圆园员源 原 员园 原 圆猿
蚜虫内共生菌基因组 阅晕粤提取方法的比较和优化
宋摇 月摇 樊永亮摇 武丽娟摇 张战凤摇 刘艳红摇 刘同先鄢
渊西北农林科技大学袁 西北旱区作物逆境生物学国家重点实验室袁 农业部西北黄土高原作物有害生物
综合治理重点实验室袁 陕西 杨凌 苑员圆员园园冤
摘要院 为探究蚜虫共生菌基因组 阅晕粤 的提取方案袁以桃蚜为试验材料袁比较了目前较为常用的 源
种蚜虫基因组 阅晕粤提取方法袁从 阅晕粤纯度尧完整性尧孕悦砸 扩增效率及稳定性等方面进行了比较和
评价袁并通过调整蛋白酶 运用量和水浴温度及时间对 杂栽耘法进行了优化遥 结果表明袁源 种方法提取
的蚜虫共生菌基因组 阅晕粤均可用于共生菌的 孕悦砸扩增检测曰悦栽粤月 法和 杂阅杂 法提取的 阅晕粤 纯度
较高袁条带较完整袁稳定性相对较高袁不易降解袁而 杂栽耘法和 孕悦砸缓冲液法操作简便袁适于快速提取
单头蚜虫共生菌的基因组 阅晕粤袁但纯度相对较低曰可根据试验条件和要求进行选择遥 杂栽耘 法优化
条件为院用 猿园 滋蕴 杂栽耘缓冲液将蚜虫匀浆袁加入 员郾 缘 滋蕴 圆园 皂早 辕 皂蕴蛋白酶 运袁于 缘远益水浴 员郾 缘 澡曰再加
入 园郾 员 滋蕴 员园 皂早 辕 蕴 砸晕粤酶袁于 猿苑 益培养 员 澡袁怨缘 益下处理 缘 皂蚤灶袁缘 园园园 则 辕 皂蚤灶离心 猿 皂蚤灶袁将提取到的
阅晕粤于 原圆园 益保存或直接用于 孕悦砸 扩增遥 优化后的 杂栽耘 法可作为提取蚜虫共生菌基因组 阅晕粤
经济而快捷有效的方法遥
关键词院 蚜虫曰 共生菌曰 阅晕粤提取
悦燥皂责葬则蚤泽燥灶 葬灶凿 燥责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶
枣则燥皂 藻灶凿燥泽赠皂遭蚤燥灶贼泽 燥枣 葬责澡蚤凿泽
杂燥灶早 再怎藻摇 云葬灶 再燥灶早造蚤葬灶早摇 宰怎 蕴蚤躁怎葬灶摇 在澡葬灶早 在澡葬灶枣藻灶早摇 蕴蚤怎 再葬灶澡燥灶早摇 蕴蚤怎 栽燥灶早曾蚤葬灶鄢
渊杂贼葬贼藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 悦则燥责 杂贼则藻泽泽 月蚤燥造燥早赠 枣燥则 粤则蚤凿 粤则藻葬泽袁 晕燥则贼澡憎藻泽贼 粤 驭 云 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠曰 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 晕燥则贼澡憎藻泽贼
蕴燥藻泽泽 孕造葬贼藻葬怎 悦则燥责 孕藻泽贼 酝葬灶葬早藻皂藻灶贼袁 酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻袁 再葬灶早造蚤灶早 苑员圆员园园袁 杂澡葬葬灶曾蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 陨灶 燥则凿藻则 贼燥 藻曾责造燥则藻 贼澡藻 燥责贼蚤皂怎皂 责则燥贼燥糟燥造 燥枣 藻曾贼则葬糟贼蚤灶早 阅晕粤 枣则燥皂 葬责澡蚤凿 藻灶凿燥泽赠皂遭蚤燥灶贼泽袁 枣燥怎则
糟燥皂皂燥灶造赠 怎泽藻凿 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿泽袁 悦栽粤月袁 杂阅杂袁 杂栽耘 葬灶凿 孕悦砸 遭怎枣枣藻则袁 憎藻则藻 糟燥皂责葬则藻凿
憎蚤贼澡 贼澡藻 责藻葬糟澡 葬责澡蚤凿 酝赠扎怎泽 责藻则泽蚤糟葬藻 渊 杂怎造扎藻则冤 葬泽 贼澡藻 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 泽责藻糟蚤藻泽援 阅晕粤 责怎则蚤贼赠袁 蚤灶贼藻早则蚤贼赠袁
藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 燥枣 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶袁 葬灶凿 泽贼葬遭蚤造蚤贼赠 憎藻则藻 糟燥皂责葬则藻凿 葬灶凿 藻增葬造怎葬贼藻凿援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻
早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 燥枣 葬责澡蚤凿 藻灶凿燥泽赠皂遭蚤燥灶贼泽 藻曾贼则葬糟贼藻凿 遭赠 葬造造 贼澡藻 枣燥怎则 皂藻贼澡燥凿泽 糟燥怎造凿 遭藻 怎泽藻凿 蚤灶 贼澡藻 孕悦砸
葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 藻灶凿燥泽赠皂遭蚤燥灶贼 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶援 栽澡藻 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 藻曾贼则葬糟贼藻凿 遭赠 悦栽粤月 葬灶凿 杂阅杂 皂藻贼澡燥凿泽 澡葬凿
澡蚤早澡藻则 责怎则蚤贼赠 葬灶凿 泽贼则蚤责藻 糟燥皂责造藻贼藻灶藻泽泽 糟燥皂责葬则藻凿 憎蚤贼澡 贼澡藻 燥贼澡藻则 贼憎燥 皂藻贼澡燥凿泽援 月燥贼澡 燥枣 贼澡藻 杂栽耘 葬灶凿 孕悦砸
遭怎枣枣藻则 皂藻贼澡燥凿泽 憎藻则藻 泽怎蚤贼葬遭造藻 枣燥则 则葬责蚤凿 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 燥枣 泽蚤灶早造藻鄄葬责澡蚤凿 藻灶凿燥泽赠皂遭蚤燥灶贼 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤袁 遭怎贼
藻曾贼则葬糟贼藻凿 阅晕粤 憎蚤贼澡 贼澡藻泽藻 贼憎燥 皂藻贼澡燥凿泽 澡葬凿 造燥憎藻则 责怎则蚤贼赠 糟燥皂责葬则藻凿 憎蚤贼澡 贼澡藻 燥贼澡藻则 贼憎燥 皂藻贼澡燥凿泽援 陨贼 泽澡燥怎造凿
遭藻 糟澡燥泽藻灶 葬糟糟燥则凿蚤灶早 贼燥 贼澡藻 泽责藻糟蚤枣蚤糟 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 贼藻泽贼泽 葬灶凿 则藻择怎蚤则藻皂藻灶贼泽援 杂栽耘 皂藻贼澡燥凿 蚤泽 贼澡藻 皂燥泽贼
藻糟燥灶燥皂蚤糟葬造 葬灶凿 贼蚤皂藻鄄泽葬增蚤灶早 皂藻贼澡燥凿 枣燥则 贼澡藻 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 燥枣 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 燥枣 葬责澡蚤凿 藻灶凿燥泽赠皂遭蚤燥灶贼泽援 栽燥
燥责贼蚤皂蚤扎藻 贼澡藻 杂栽耘 皂藻贼澡燥凿袁 贼澡藻 凿燥泽葬早藻泽 燥枣 贼澡藻 责则燥贼藻蚤灶葬泽藻 运袁 葬灶凿 憎葬贼藻则 遭葬贼澡 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 葬灶凿 蚤灶糟怎遭葬贼蚤灶早
贼蚤皂藻 憎藻则藻 葬凿躁怎泽贼藻凿援 栽澡藻 燥责贼蚤皂怎皂 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 燥枣 贼澡藻 杂栽耘 葬则藻院 澡燥皂燥早藻灶蚤扎蚤灶早 葬责澡蚤凿 遭燥凿赠 憎蚤贼澡 猿园 滋蕴 杂栽耘
遭怎枣枣藻则 蚤灶 葬 孕悦砸 贼怎遭藻袁 葬凿凿蚤灶早 员郾 缘 滋蕴 圆园 皂早 辕 皂蕴 责则燥贼藻蚤灶葬泽藻 运袁 葬灶凿 皂蚤曾蚤灶早 憎藻造造 葬灶凿 蚤灶糟怎遭葬贼蚤灶早 贼澡藻
皂蚤曾贼怎则藻 蚤灶 憎葬贼藻则 遭葬贼澡 葬贼 缘远 益 枣燥则 员郾 缘 澡袁 贼澡藻灶 葬凿凿蚤灶早 园郾 员 滋蕴 员园 皂早 辕 皂蕴 砸晕葬泽藻 粤 贼燥 贼澡藻 皂蚤曾贼怎则藻袁 葬灶凿
蚤灶糟怎遭葬贼蚤灶早 蚤灶泽蚤凿藻 葬灶 蚤灶糟怎遭葬贼燥则 葬贼 猿苑 益 枣燥则 员 澡袁 贼澡藻灶 葬贼 怨缘 益 枣燥则 缘 皂蚤灶 贼燥 凿藻灶葬贼怎则藻 贼澡藻 藻灶扎赠皂藻泽袁
糟藻灶贼则蚤枣怎早藻凿 葬贼 葬 贼葬遭造藻鄄贼燥责 糟藻灶贼则蚤枣怎早藻 葬贼 缘 园园园 则 辕 皂蚤灶 枣燥则 猿 皂蚤灶袁 葬灶凿 葬贼 造葬泽贼 糟燥造造藻糟贼蚤灶早 贼澡藻 泽怎责藻则灶葬贼葬灶贼
糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 阅晕粤 凿蚤则藻糟贼造赠 枣燥则 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼 燥则 泽贼燥则藻凿 葬贼 原 圆园益 援 韵责贼蚤皂蚤扎藻凿 杂栽耘 皂藻贼澡燥凿 蚤泽 葬灶 藻糟燥灶燥皂蚤糟葬造 葬灶凿
贼蚤皂藻鄄泽葬增蚤灶早 皂藻贼澡燥凿 枣燥则 贼澡藻 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 燥枣 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 燥枣 葬责澡蚤凿 藻灶凿燥泽赠皂遭蚤燥灶贼泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院 葬责澡蚤凿曰 藻灶凿燥泽赠皂遭蚤燥灶贼曰 阅晕粤 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶
摇 摇 蚜虫吸食植物汁液袁排泄蜜露并传播病毒袁是主
要的农业害虫种类之一遥 其体内共生菌种类较多袁
可分为初级共生菌和次级共生菌遥 初级共生菌是指
能为蚜虫提供必需氨基酸的专性共生菌袁如巴克纳
氏菌 月怎糟澡灶藻则葬 葬责澡蚤凿蚤糟燥造葬袁存在于蚜虫腹部含菌细胞
的胞质中袁是蚜虫正常生长和繁殖所必需的咱员 原 圆暂 遥
蚜虫可被一种或多种细菌感染袁这些细菌被称为次
级或者兼性共生菌咱猿暂 遥 它们形态不规则袁有杆状尧
棒状尧环状或卷曲状袁大致可分 缘 类袁即 酌鄄变形菌纲
的 杂藻则则葬贼蚤葬 泽赠皂遭蚤燥贼蚤糟葬尧 匀葬皂蚤造贼燥灶藻造造葬 凿藻枣藻灶泽葬尧 砸藻早蚤藻造造葬
蚤灶泽藻糟贼蚤糟燥造葬尧琢鄄变形菌纲的立克次氏体 砸蚤糟噪藻贼贼泽蚤葬 泽责援 尧
以及一种螺原体 杂责蚤则燥责造葬泽皂葬 泽责援 咱源 原 缘暂 遥 此外袁对豆蚜
粤责澡蚤泽 糟则葬糟糟蚤增燥则葬及其内共生菌的转录组测序结果表
明袁杀雄菌属 粤则泽藻灶燥责澡燥灶怎泽 和乌巴克体属 宰燥造遭葬糟澡蚤葬
的沃尔巴克氏菌为潜在的次生共生菌咱远暂 遥 次生共
生菌主要与寄主蚜虫的适合度尧竞争力等相关咱苑暂 袁
如能增强蚜虫对热胁迫的耐受性咱愿暂 尧影响蚜虫利用
特定寄主的能力尧扩大其寄主植物范围咱怨暂 尧提高蚜
虫对寄生性天敌的抵御能力咱员园暂及减弱真菌病原物
对蚜虫的侵染咱员员暂等遥
利用分子生物学手段研究蚜虫与共生菌的关系
是国际研究的热点之一袁而蚜虫共生菌基因组 阅晕粤
的提取则是分子生物学相关研究的基础遥 提取蚜虫
基因组 阅晕粤的方法也较多袁月造葬糟噪 等咱员圆暂采用十二烷
基磺酸钠渊 泽燥凿蚤怎皂 凿燥凿藻糟赠造 泽怎造枣葬贼藻袁杂阅杂冤法提取蚜虫
基因组 阅晕粤 并用于 砸粤孕阅 扩增曰李正西和李定
旭咱员猿暂用裂解法提取桃蚜 酝赠扎怎泽 责藻则泽蚤糟葬藻 渊 杂怎造扎藻则冤基
因组总 阅晕粤 并用于其共生菌种群检测曰吴玉新
等咱员源暂通过氯化钠鄄栽则蚤泽鄄耘阅栽粤 缓冲液渊 泽燥凿蚤怎皂鄄糟澡造燥鄄
则蚤凿藻鄄栽则蚤泽鄄耘阅栽粤 遭怎枣枣藻则袁 杂栽耘冤法提取桃蚜基因组总
阅晕粤用于共生菌巴克纳氏菌 月援 葬责澡蚤凿蚤糟燥造葬 的基因
序列分析曰宰葬灶早 等咱员缘暂用十六烷基三乙基溴化铵
渊澡藻曾葬凿藻糟赠造 贼则蚤皂藻贼澡赠造 葬皂皂燥灶蚤怎皂 遭则燥皂蚤凿藻袁悦栽粤月冤法提
取蚜虫基因组总 阅晕粤袁并通过 孕悦砸扩增鉴定分析荻
草谷网蚜 杂蚤贼燥遭蚤燥灶 皂蚤泽糟葬灶贼澡蚤 渊栽葬噪葬澡葬泽澡蚤冤种群内共生
菌 宰燥造遭葬糟澡蚤葬的分布情况遥
在蚜虫内共生菌的研究方面袁单头蚜虫体内共
生菌的检测具有重要意义遥 然而袁蚜虫体型微小袁单
头蚜虫的总 阅晕粤 量较少袁其体内共生菌 阅晕粤 的含
量则更少袁为了保证后续试验的顺利进行袁对单头蚜
虫 阅晕粤的提取要求较高袁希望能够得到大量高质量
的 阅晕粤遥 因此袁本研究以桃蚜为材料袁比较了目前
较为常用的 源 种 阅晕粤 提取方法袁从 阅晕粤 浓度尧纯
度尧完整性尧对 孕悦砸 的适用性等方面进行了比较和
评价袁并对 杂栽耘 法进行了优化袁以期得到提取蚜虫
共生菌基因组 阅晕粤最经济快捷的方法遥
员 材料与方法
员郾 员 材料
供试虫源院桃蚜取自西北农林科技大学应用昆
虫学重点实验室袁于 圆员 耀 圆圆 益尧相对湿度 远园豫 耀
苑园豫 尧光照 员源 蕴 颐 员园 阅下室内饲养多代种群袁选取菠
菜上的同一批桃蚜进行试验遥
缓冲液配制院 悦栽粤月 缓冲液院员园园 皂皂燥造 辕 蕴 栽则蚤泽鄄
匀悦造渊 责匀 苑郾 园冤尧员郾 源 皂燥造 辕 蕴 晕葬悦造尧圆园 皂皂燥造 辕 蕴 耘阅栽粤尧
圆豫 悦栽粤月曰杂阅杂 缓冲液院员豫 杂阅杂尧缘园 皂皂燥造 辕 蕴 栽则蚤泽鄄
匀悦造渊责匀 愿郾 园冤尧园郾 圆缘 皂皂燥造 辕 蕴 晕葬悦造尧圆缘 皂皂燥造 辕 蕴 耘阅栽粤曰
杂栽耘 缓冲液院员园园皂皂燥造 辕 蕴 晕葬悦造尧员园皂皂燥造 辕 蕴 栽则蚤泽鄄匀悦造尧员
皂皂燥造 辕 蕴 耘阅栽粤渊责匀 愿郾 园冤曰孕悦砸 缓冲液院员园园 皂皂燥造 辕 蕴
栽则蚤泽鄄匀悦造渊责匀 愿郾 愿冤尧缘园园 皂皂燥造 辕 蕴 运悦造尧园郾 愿豫 渊增 辕 增冤乙
基苯基聚乙二醇遥 试验所用试剂均为国产分析纯遥
仪器院晕阅圆园园园鄄悦 紫外可见分光光度计袁美国
栽澡藻则皂葬造 云蚤泽澡藻则公司曰月蚤燥鄄砸葬凿 郧藻造阅燥糟 载砸 垣型全自动
凝胶成像系统袁美国 月蚤燥鄄砸葬凿公司遥
员郾 圆 方法
员郾 圆郾 员 采用 悦栽粤月法提取桃蚜 阅晕粤
参照 灾葬增则藻等咱员远暂方法袁稍作修改遥 将单头或多
头蚜虫置于小培养皿内袁用无水乙醇及双蒸水清洗袁
干燥后将虫体置于 员郾 缘 皂蕴 离心管中袁加入 缘园 滋蕴
悦栽粤月 缓冲液袁将样品充分研磨袁再加入 员缘园 滋蕴
源源远 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
悦栽粤月缓冲液曰远缘 益水浴 员 澡曰取出后加入 员 哉 砸晕粤
酶袁置于 猿苑 益温箱中 员 澡曰取出后加入 缘园园 滋蕴 氯仿 辕
异戊 醇 渊 圆源 颐 员 冤袁 缓 慢 摇 动 混 匀袁 员猿 园园园 耀
员缘 园园园 则 辕 皂蚤灶离心 员缘 皂蚤灶曰取上清液渊约 员缘园 滋蕴冤置于
新离心管中袁加入 圆 倍体积冰无水乙醇袁约 员 辕 员园 体
积醋酸钠渊责匀 缘郾 圆冤袁混匀后置于 原圆园益下 猿 澡以上曰
员猿 园园园 则 辕 皂蚤灶 离心 员缘 皂蚤灶袁弃上清液袁用 苑园豫乙醇
渊 原 圆园 益保存冤清洗 圆 次曰室温干燥曰加入 圆园 耀 源园 滋蕴
栽耘缓冲液溶解袁 原 圆园 益保存遥
员郾 圆郾 圆 采用 杂阅杂法提取桃蚜 阅晕粤
参考张素方等咱员苑暂方法袁稍作改进遥 单头或多头
蚜虫于 员郾 缘 皂蕴离心管内袁加 员园园 滋蕴 杂阅杂 缓冲液袁匀
浆袁再加 员园园 滋蕴缓冲液袁远缘益水浴 猿园皂蚤灶袁加 猿皂燥造 辕 蕴
醋酸钾溶液 员园园 滋蕴袁置冰上 员 澡袁员圆 园园园 则 辕 皂蚤灶离心 员圆
皂蚤灶袁吸取上清液移入新离心管袁加等体积异丙醇混
匀后室温放置 员园皂蚤灶袁员圆 园园园 则 辕 皂蚤灶离心 员缘皂蚤灶袁沉淀
用 苑园豫乙醇洗 员 次袁猿苑 益干燥袁加入 圆园 耀 源园 滋蕴 责匀
愿郾 园 的 栽耘缓冲液溶解 阅晕粤袁 原圆园 益保存遥
员郾 圆郾 猿 采用 杂栽耘法提取桃蚜 阅晕粤
参考吴玉新等咱员源暂方法袁根据加入蛋白酶 运量和
水浴温度及时间进行处理遥 将单头桃蚜成虫置于
孕悦砸管内袁加入 员园 滋蕴 杂栽耘缓冲液袁在 原 圆园 益下冷冻
圆 耀 猿 皂蚤灶袁将蚜虫匀浆袁再加入 圆园 滋蕴 杂栽耘缓冲液袁加
入 员郾 缘 滋蕴 圆园 皂早 辕 皂蕴 蛋白酶 运渊另设 员 组处理加 圆
滋蕴冤袁以上操作均在冰上进行遥 将离心管分别置于
猿苑 益和 缘远益下水浴 园郾 缘尧 员尧 员郾 缘尧 圆尧 猿尧 源尧 缘 澡曰加入
园郾 员 滋蕴 员园 皂早 辕 皂蕴 砸晕粤酶袁置于 猿苑 益 员 澡袁怨缘 益初始
变性 缘 皂蚤灶袁缘 园园园 则 辕 皂蚤灶离心后 原圆园 益保存或直接用
于 孕悦砸 扩增遥 通过对加入蛋白酶 运 的量及水浴温
度和时间的比较袁对 杂栽耘 法进行优化袁以便得到更
加快捷稳定的提取效果遥
员郾 圆郾 源 采用 孕悦砸缓冲液法提取桃蚜 阅晕粤
将单头桃蚜成虫置于 孕悦砸 管内袁加入 员园 滋蕴
孕悦砸缓冲液袁在 原 圆园 益下冷冻 圆 耀 猿 皂蚤灶袁将蚜虫匀
浆袁再加入 圆园 滋蕴 孕悦砸 缓冲液袁加入 员郾 缘 滋蕴 圆园 皂早 辕
皂蕴蛋白酶 运袁以上操作均在冰上进行遥 将离心管置
于 缘远 益水浴 圆 澡袁加入 园郾 员 滋蕴 员园 皂早 辕 皂蕴 砸晕粤 酶袁置
于 猿苑益 员 澡袁怨缘益初始变性 缘皂蚤灶袁缘 园园园 则 辕 皂蚤灶离心后
原圆园 益保存或直接用于 孕悦砸扩增遥
员郾 圆郾 缘 提取的蚜虫 阅晕粤质量检测
粤圆远园 辕 粤圆愿园是评价核酸纯度的指标袁一般认为袁粤圆远园 辕 粤圆愿园为 员郾 愿 耀 圆郾 园 时袁阅晕粤 纯度较好曰粤圆远园 辕 粤圆愿园
小于 员郾 愿 时袁表明提取的 阅晕粤 中有蛋白质残留曰
粤圆远园 辕 粤圆愿园大于 圆郾 园 时袁提取的 阅晕粤 中有 砸晕粤 污
染咱员愿暂 遥 取 圆 滋蕴 阅晕粤样品用紫外可见分光光度计进
行核酸浓度及纯度检测袁按上述标准进行判断遥 另
取 缘 滋蕴 阅晕粤或 猿郾 缘 滋蕴 孕悦砸 产物袁用 圆豫琼脂糖凝
胶电泳检测基因组完整性袁电压 远园 灾尧电泳缓冲液为
员 伊 栽粤耘尧郧藻造鄄砸藻凿核酸染料进行染色袁经全自动凝胶
成像系统观察结果遥 上述电泳检测分别在 阅晕粤 提
取 园渊员 澡后冤尧猿尧苑尧员源 凿后进行遥
为进一步验证提取的基因组 阅晕粤 质量袁利用
孕悦砸扩增蚜虫体内共生菌 员远杂 则阅晕粤 基因袁引物为
月怎糟澡员远杂员云渊缘忆鄄郧粤郧悦栽栽郧悦栽悦栽悦栽栽栽郧栽悦郧郧悦粤粤鄄猿忆冤
和 月怎糟澡员远杂员砸院渊缘忆鄄悦栽栽悦栽郧悦郧郧郧栽粤粤悦郧栽悦粤悦郧粤粤鄄
猿忆冤 咱员怨暂 袁扩增体系为 圆缘 滋蕴院圆 滋蕴 阅晕粤 模板尧怨郾 缘 滋蕴
凿凿匀圆韵尧员圆郾 缘 滋蕴 圆 伊 孕悦砸 酝葬泽贼藻则酝蚤曾尧员园 滋皂燥造 辕 蕴 上下
游引物各 园郾 缘 滋蕴遥 孕悦砸反应条件为院怨缘 益 猿 皂蚤灶曰怨缘
益 猿园 泽袁缘缘 益 猿园 泽袁苑圆 益 圆 皂蚤灶袁猿缘 个循环曰苑圆 益 员园
皂蚤灶遥 为了验证 阅晕粤的稳定性袁上述 孕悦砸 扩增分别
在 阅晕粤提取 园渊员 澡后冤尧猿尧苑尧员源 凿 后进行袁至少重复
猿 次袁以确保结果的可靠性遥
圆 结果与分析
圆郾 员 不同方法提取的 阅晕粤质量检测
结果显示袁经 悦栽粤月 法和 杂阅杂 法提取的蚜虫
阅晕粤纯度相对较高袁粤圆远园 辕 粤圆愿园分别为 圆郾 园猿 依 园郾 园源 和圆郾 园缘 依 园郾 园缘袁阅晕粤 浓度分别为 怨圆郾 缘 依 猿郾 愿 灶早 辕 滋蕴 和
怨员郾 愿 依 缘郾 缘 灶早 辕 滋蕴曰杂栽耘法提取的 阅晕粤其 粤圆远园 辕 粤圆愿园小
于 员郾 远袁表明提取的 阅晕粤 中可能有蛋白质等大分子
污染袁阅晕粤浓度为 员源苑郾 圆 依 员缘郾 圆 灶早 辕 滋蕴曰孕悦砸 缓冲液
法提取的 阅晕粤其 粤圆远园 辕 粤圆愿园较大为 圆郾 缘圆 依 园郾 员猿袁可能
有 砸晕粤等污染袁阅晕粤浓度为 员圆愿郾 猿 依 怨郾 员 灶早 辕 滋蕴遥
源 种方法提取的 阅晕粤渊提取 员 澡后冤电泳检测结
果如图 员鄄粤 所示袁悦栽粤月 法提取的 阅晕粤 条带完整袁
亮度较高曰杂阅杂 法提取的 阅晕粤 有断带现象曰杂栽耘 法
提取的 阅晕粤 电泳时无条带曰孕悦砸 缓冲液法提取的
阅晕粤条带完整遥 阅晕粤 于 源 益冰箱存放 员源 凿 后电泳
检测结果如图 员鄄月所示袁与提取当天差异不明显遥
圆郾 圆 不同提取方法 孕悦砸扩增效率及稳定性
电泳检测发现袁以 源 种方法提取的 阅晕粤为模板
进行 孕悦砸扩增时袁均能得到 员远泽 则阅晕粤基因的 源圆园 遭责
条带渊图 圆冤遥 比较发现 悦栽粤月 法尧杂阅杂 法和 孕悦砸 缓
冲液法提取的 阅晕粤作为模板经 源 益存放 员源 凿 后对
孕悦砸扩增效率影响不明显袁而 杂栽耘 法提取的 阅晕粤
员源 凿后 孕悦砸扩增效率稍有下降遥
圆郾 猿 杂栽耘法提取条件的优化
单头桃蚜成虫在 猿苑 益水浴条件下所提 阅晕粤电
缘源远远 期 宋摇 月等院 蚜虫内共生菌基因组 阅晕粤提取方法的比较和优化
图 员 四种方法提取蚜虫基因组总 阅晕粤的电泳图
云蚤早援 员 栽澡藻 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻贼燥早则葬皂 燥枣 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 藻曾贼则葬糟贼藻凿 遭赠 枣燥怎则 皂藻贼澡燥凿泽
粤院 阅晕粤提取当天曰 月院 阅晕粤提取 员源 凿后遥 酝院 缘园园 遭责 造葬凿凿藻则 阅晕粤 皂葬则噪藻则援 粤院 栽澡藻 凿葬赠 阅晕粤 憎藻则藻 藻曾贼则葬糟贼藻凿曰 月院 阅晕粤 藻曾鄄
贼则葬糟贼藻凿 葬枣贼藻则 员源 凿葬赠泽援
摇
图 圆 不同提取方法下桃蚜内共生菌 员远杂 则阅晕粤基因片段的 孕悦砸扩增
云蚤早援 圆 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 员远杂 则阅晕粤 早藻灶藻 燥枣 月怎糟澡灶藻则葬 蚤灶 酝赠扎怎泽 责藻则泽蚤糟葬藻 憎蚤贼澡 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿泽
粤院 阅晕粤提取当天曰 月院 阅晕粤提取 员源 凿后遥 酝院 缘园园 遭责 造葬凿凿藻则 阅晕粤 皂葬则噪藻则援 粤院 栽澡藻 凿葬赠 阅晕粤 憎藻则藻 藻曾贼则葬糟贼藻凿曰 月院 阅晕粤 藻曾贼则葬糟鄄
贼藻凿 葬枣贼藻则 员源 凿葬赠泽援
摇
泳无条带袁进行 孕悦砸 扩增亦无目的条带遥 而 缘远 益
下袁无论加入 员郾 缘 滋蕴或 圆 滋蕴蛋白酶 运袁在水浴 园郾 缘尧
员尧 员郾 缘尧 圆尧 猿尧 源尧 缘 澡时所提 阅晕粤进行 孕悦砸 均能得
到目的条带袁其中水浴 园郾 缘 澡和 员 澡得到的 孕悦砸产物
电泳条带较弱渊图 猿鄄粤冤袁水浴 员郾 缘 澡以上得到的 孕悦砸
产物电泳条带清晰袁且不同时间处理间差异不显著
渊图 猿鄄月冤遥 表明 杂栽耘法提取单头桃蚜成虫 阅晕粤袁加
员郾 缘 滋蕴蛋白酶 运袁缘远 益水浴 员郾 缘 澡 是最经济而快捷
远源远 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
图 猿 杂栽耘法 缘远益下水浴不同时间后
提取 阅晕粤的 孕悦砸扩增
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有效的选择遥
猿 讨论
本研究比较了 悦栽粤月 法尧杂阅杂 法尧杂栽耘 法及 孕悦砸
缓冲液法提取蚜虫体内共生菌的基因组 阅晕粤袁发现
这 源 种方法提取的 阅晕粤 用于蚜虫内共生菌的 孕悦砸
扩增均能得到目的条带袁且条带亮度较高袁能够保证
后续目的片段的回收尧克隆测序等试验的顺利完成袁
可根据试验条件和要求进行选择遥 悦栽粤月 法和 杂阅杂
法得到的 阅晕粤纯度较高袁前者 阅晕粤片段比较完整袁
量较多袁不易降解袁适于 源 益短期保存或 原圆园益长期
保存袁但耗时相对较多袁适合于提取单头或多头蚜虫
体内共生菌并且对 阅晕粤纯度和量要求较高的试验曰
杂阅杂法操作较 悦栽粤月 法稍简单袁省去氯仿异戊醇抽
提的步骤袁减少了有毒试剂的污染袁耗时相对较少袁
而电泳结果有时会出现条带断裂现象袁但对于 孕悦砸
扩增检测共生菌无影响袁适于提取单头或多头蚜虫
体内共生菌的 阅晕粤曰杂栽耘法和 孕悦砸 缓冲液法操作相
对简单袁耗时较短袁但得到的 阅晕粤纯度相对较低袁适
于快速提取单头蚜虫体内共生菌 阅晕粤 并用于 孕悦砸
扩增检测遥
本研究中 源 种 阅晕粤 提取方法采用的裂解液和
去除蛋白质的方法有所不同遥 悦栽粤月 是一种阳离子
去污剂袁可溶解细胞膜袁并与核酸形成复合物袁能够
从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖遥 在
这种条件下袁蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里袁
悦栽粤月与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖
形成复合物袁只是不能沉淀核酸咱圆园暂 遥 该复合物在高
盐溶液渊 跃 园郾 苑 皂燥造 辕 蕴 晕葬悦造冤中是可溶的袁通过氯仿颐
异戊醇渊圆源 颐 员冤抽提袁去除蛋白尧多糖尧酚类等杂
质咱圆园暂 袁加入无水乙醇沉淀使核酸分离遥 杂阅杂 是一种
阴离子去垢剂袁在 缘缘 耀 远缘 益条件下能使细胞裂解尧
染色体离析尧蛋白质变性袁释放出核酸袁提高盐
渊运粤悦冤浓度并降低温度渊冰浴冤袁能使蛋白质及多糖
杂质沉淀并离心去除遥 杂栽耘 法和 孕悦砸 缓冲液法袁主
要是通过蛋白酶 运 使膜蛋白降解袁将与 阅晕粤 结合
的蛋白质降解袁使 阅晕粤充分游离遥 为了得到更为经
济快捷的提取方法袁本研究对 杂栽耘 法进行了改进和
优化遥 吴玉新等咱员源暂用 杂栽耘 法提取单头桃蚜 阅晕粤
时袁采用 圆园 滋蕴 杂栽耘 缓冲液尧员郾 远 滋蕴 员园 皂早 辕 皂蕴 蛋白
酶 运尧猿苑 益水浴 猿园 皂蚤灶 的条件袁可能由于试剂等差
异袁本研究按照以上条件未能成功提取蚜虫基因组
总 阅晕粤遥 蛋白酶 运 的工作温度为 猿苑 耀 缘远 益袁然而
其在 缘园 益要比 猿苑 益活性高出数倍咱圆园暂 遥 因此袁本研
究通过调整加入蛋白酶 运 的量并提高水浴温度和
时间袁提高蛋白酶 运活性袁使蛋白质充分降解袁取得
了较好的效果袁优化条件为加入 员郾 缘 滋蕴 圆园 皂早 辕 皂蕴
蛋白酶 运尧缘远 益水浴 员郾 缘 澡遥 提取 阅晕粤的过程中袁应
根据蚜虫多少尧虫体大小来调整缓冲液的体积和蛋
白酶 运的用量遥
研究发现蚜虫的初级共生菌 月怎糟澡灶藻则葬 存在于
含菌体渊遭葬糟贼藻则蚤燥皂藻 或 皂赠糟藻贼燥皂藻冤中咱圆员暂 袁次级共生菌
有的分布于菌胞周围的鞘细胞中袁有的聚集或分散
于蚜虫血腔中袁也有少数存在于脂肪体细胞和缺失
月怎糟澡灶藻则葬的含菌细胞中咱缘暂 遥 蚜虫个体较小袁其体内
共生菌的量更少袁所以在提取蚜虫体内共生菌 阅晕粤
的过程中袁应尽量减少损失袁且在样品匀浆过程中袁
一定要充分研磨袁使蚜虫组织完全破碎袁根据昆虫组
织的量调整提取缓冲液的体积袁需保证研磨的组织
与裂解液混合均匀袁使细胞充分裂解遥 本研究发现袁
将样品放入离心管袁直接在液氮中冷冻后袁或者加入
少量裂解液后将其放入 原 圆园 益冰箱冷冻 圆 耀 猿 皂蚤灶
后再进行研磨袁效果比较好遥 此外袁在试验过程中对
昆虫匀浆的工具也进行了一些探究袁可以用塑料研
磨棒渊可直接购买冤袁也可将吸头的顶端用酒精灯稍
微灼烧一下袁将顶口封闭作为研磨工具袁使用这 圆 种
工具对试验结果的影响没有显著差异袁然而用吸头
自制的研磨工具价格较低袁一次性使用还可避免
污染遥
参 考 文 献 渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
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苑源远远 期 宋摇 月等院 蚜虫内共生菌基因组 阅晕粤提取方法的比较和优化
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咱苑暂 冯利袁 孙玉诚袁 戈峰袁 等援 蚜虫要内共生菌的互利共生研究
综述援 江西农业学报袁 圆园园愿袁 圆园渊远冤院 远缘 原 远愿
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咱员猿暂 李正西袁 李定旭援 桃蚜自然种群初级和次级共生菌的分子
鉴定援 昆虫学报袁 圆园园缘袁 源愿渊缘冤院 愿员园 原 愿员源
咱员源暂 吴玉新袁 张春玲袁 洪晓月援 桃蚜与其内共生菌 月怎糟澡灶藻则葬之
间的系统进化关系分析援 南京农业大学学报袁 圆园园愿袁 猿员
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咱员苑暂 张素方袁 程家安袁 杨效文援 桃蚜不同蚜型 阅晕粤 多态性的
砸粤孕阅研究援 昆虫学报袁 圆园园圆袁 源缘渊远冤院 苑远源 原 苑远怨
咱员愿暂 陈思媛袁 郭明璋袁 贺晓云袁 等援 用于分子生物学检测的粪
便 阅晕粤的提取方法优化援 农业生物技术学报袁 圆园员猿袁 圆员
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咱圆园暂 杂葬皂遭则燥燥噪 允袁 砸怎泽泽藻造造 阅 宰援 黄培堂袁 译援 分子克隆试验指南
渊第 猿版冤援 北京院 科学出版社袁 圆园园圆
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渊责任编辑院李美娟冤
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