全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（４）： ５５２ － ５５８ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０４􀆰 ００４
基金项目：河北省自然科学基金（Ｃ２０１３４０７１０８），河北省教育厅重点课题 （ＺＤ２０１３１０４１），秦皇岛市科技支撑计划（２０１４０２Ｂ０２８）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｚｉｄｉａｎｈｅ１９７２＠ １６３． ｃｏｍ
收稿日期： ２０１４ － １１ － １９
棘孢木霉 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ在土壤中定殖量
的荧光定量 ＰＣＲ检测
贺字典１，２∗　 宋士清１ 　 高玉峰１ 　 石延霞２ 　 李宝聚２
（１．河北科技师范学院生命科技学院， 秦皇岛 ０６６００４； ２．中国农业科学院蔬菜花卉研究所， 北京 １０００８１）
摘要： 为快速准确检测棘孢木霉 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ 在土壤中的定殖量，构建了荧光定量 ＰＣＲ
检测体系，并运用该体系对防治黄瓜枯萎病后土壤中的棘孢木霉数量进行了检测。 结果表明：所建
立的荧光定量 ＰＣＲ检测体系对棘孢木霉 ＤＮＡ特异性强，Ｒ２ 为 ０􀆰 ９９８，检测限点为 １５ ｆｇ ／ μＬ；在灭菌
土壤中检测到的棘孢木霉 ＤＮＡ 的拷贝数大于 １ ８６６ ｆｇ ／ μＬ 时，对黄瓜枯萎病的防治效果高于
６４􀆰 ２９％ ；在黄瓜整个生育期内，检测到土壤中的棘孢木霉定殖量呈现先降后升的变化趋势，第 ７ 天
时，棘孢木霉 ＤＮＡ拷贝数为 ３２０ ｎｇ ／ μＬ，５６ ｄ后棘孢木霉 ＤＮＡ 拷贝数迅速上升，最高可达 ５􀆰 １６ ×
１０４ ｎｇ ／ μＬ，且对黄瓜枯萎病的防治效果为 ６４􀆰 ２９％ ～７６􀆰 ８１％ 。 研究表明，荧光定量 ＰＣＲ 方法检测
土壤中棘孢木霉数量具有快速、灵敏度高、可靠性强等优点，可用于检测生防菌棘孢木霉施用后的
定殖量和生防效果。
关键词： 棘孢木霉； 荧光定量 ＰＣＲ； 定殖量； 检测技术
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｉｌｓ ｂｙ
ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
Ｈｅ Ｚｉｄｉａｎ１，２∗ 　 Ｓｏｎｇ Ｓｈｉｑｉｎｇ１ 　 Ｇａｏ Ｙｕｆｅｎｇ１ 　 Ｓｈｉ Ｙａｎｘｉａ２ 　 Ｌｉ Ｂａｏｊｕ２
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｅｂｅｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｑｉｎｈｕａｎｇｄａｏ ０６６００４，
Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ａｎｄ Ｆｌｏｗｅｒ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ， ａ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔ， ｉｎ ｓｏｉｌｓ ｒａｐｉｄｌｙ ａｎｄ
ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ， ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｔ． ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｓｏｉｌ⁃ｂｏｒｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｗｉｌｔ
ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
ａｓｓａｙ， ｗｉｔｈ ａ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９８ ａｎｄ ａ ｌｏｗｅｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ １５ ｆｇ ／ μＬ， ｃｏｕｌｄ
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ Ｔ． ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ， ｗｈｅｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｇｅｎｔ
ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｉｎ ｓｔｅｒｉｌｅ ｓｏｉｌ， ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ １ ８６６ ｆｇ ／ μＬ， ｔｈｅ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ
ｔｏ ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｗａｓ ａｂｏｖｅ ６４􀆰 ２９％ ． Ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｇｅｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ
ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ｓｅｖｅｎ ｄａｙｓ （３２０ ｎｇ ／ μＬ） ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ ａｆｔｅｒ ５６ ｄａｙｓ， ｔｈｅ ｇｒｅａｔｅｓｔ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ
ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｓｏｉｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ． ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ ｒｅａｃｈｅｄ ｕｐ ｔｏ
５􀆰 １６ ×１０４ ｎｇ ／ μＬ ａｔ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｆｒｏｍ ５６ ｄ ｔｏ ８０ ｄ， ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ６４􀆰 ２９％ －７６􀆰 ８１％ ． Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｆａｓｔ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｒｅｌｉａｂｌｅ， ａｎｄ ｃｏｓｔ⁃ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ．
ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ ｉｎ ｓｏｉｌｓ， ａｎｄ ｉｓ ｏｆ ｇｒｅａｔ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｗｉｌｔ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ； ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ； ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
　 　 自发现木霉菌对植物病原菌具有拮抗作用以
来，木霉生防菌产品 Ｔｏｐｓｈｉｅｌｄ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｘ（Ｚｉｍａｎｄ ｅｔ
ａｌ． ，１９９６）、木霉菌酯素、木霉菌素（刘士旺，２００３）等
已经商品化并实现规模化生产。 将木霉菌施用到土
壤后，除与土壤中的生物因子，如微生物、植物的根
系分泌物等相互作用外（Ｌｕ ｅｔ ａｌ． ，２００４；Ｒｕｄｒａｐｐａ ｅｔ
ａｌ． ，２００８），非生物因子如农药（庄敬华等，２００５）、化
肥和有机质等（高增贵等，２００８；贺字典等，２０１１），
也会影响到外源施入木霉菌的定殖能力。
传统的土壤微生物定量方法主要有寄主侵染法
（Ｄａｖｅｙ，１９６２）、植物材料诱捕法（Ｐａｐａｖｉｚａｓ ｅｔ ａｌ． ，
１９７５）、植物残体分离法（ｖａｎ Ｂｒｕｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ． ，１９８６）、
土壤团粒法（Ｓａｉｎｚ ｅｔ ａｌ． ，１９９８）及平板稀释计数法
等。 尽管以上方法多数采用了选择性或半选择性培
养基（Ｖａｒｇａｓ Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ． ，２００９），但这些培养基常缺乏
种类特异性，且土壤微生物定量研究的工作量大，费
时费力，易受环境因子影响，重复性差，所以，这些方
法常常不能全面和准确地评价自然条件下土壤木霉
菌种群密度（张硕成，１９９１）。 近年来，实时荧光定
量 ＰＣＲ（ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ， ＲＴ⁃
ＰＣＲ）技术在微生物生态学研究中得到了广泛应用，
为环境样品中目的木霉菌的检测提供了新方法
（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ，２００５）。 因此，借助荧光定量 ＰＣＲ 技
术，直接检测生防木霉菌施入土壤后不同时期的动
态变化，就可以间接地确定土壤中木霉菌的数量增
殖情况，确定其存活期的长短。 魏巍等（２０１３）设计
的特异性引物 ＤＧ和 ＤＴ 对木霉菌进行实时荧光定
量 ＰＣＲ检测，标准曲线相关系数为 ０􀆰 ９９３。 Ｃｏｒｄｉｅｒ
ｅｔ ａｌ． （２００７）利用基于序列特征性扩增区域 （ ｓｅ⁃
ｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎ，ＳＣＡＲ）的 ｑＰＣＲ
技术检测了深绿木霉 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ 在土壤
中的生长繁殖情况。
棘孢木霉 Ｔ． ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ 是由 Ｓａｍｕｅｌｓ ｅｔ ａｌ．
（１９９９）命名的木霉新种，在我国由章初龙和徐同
（２００５）首次报道。 棘孢木霉不仅对土传病害如黄
瓜枯萎病、番茄枯萎病和水稻恶苗病的防治效果良
好（贺字典，２０１０；Ｓａｎｔａ ｅｔ ａｌ． ，２０１０；Ｓｅｇａｒｒａ ｅｔ ａｌ． ，
２０１０），还可以提高植物的抗逆能力（Ｑｉ ＆ Ｚｈａｏ，
２０１３）。 Ｖｉｔｅｒｂｏ ｅｔ ａｌ． （２００４；２０１０）测定发现棘孢木
霉 Ｔ２０３ 体内的 ａｃｄＳ基因能降低逆境对油菜根系伸
长的抑制作用。 Ｖｉｔｅｒｂｏ ＆ Ｉｌａｎ （ ２００６ ） 证实了
ＴａｓＨｙｄ１ 疏水蛋白基因可能调控棘孢木霉 Ｔ２０３ 与
植物根系的互作与定殖能力，缺失该基因后棘孢木
霉在植物根系上的定殖力显著降低。 上述研究所采
用的定量检测方法均为平板稀释记数法，未见采用
荧光定量 ＰＣＲ 技术检测棘孢木霉在土壤中定殖量
的研究报道。 因此，本研究采用荧光定量 ＰＣＲ 技
术，建立土壤中生防菌棘孢木霉的定量检测方法，开
展利用棘孢木霉制剂防治黄瓜枯萎病时生防菌和病
原菌种群动态变化的监测，明确二者在土壤中群体
生态学上的互作规律并探讨其生防机理，以期为制
剂改进和防效评价提供新信息和技术支撑。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试木霉菌株及黄瓜品种：棘孢木霉 Ｔ． ａｓｐｅｒｅｌ⁃
ｌｕｍ、哈茨木霉 Ｔ． ｈａｒｚｉａｎｕｍ、长枝木霉 Ｔ． ｌｏｎｇｉｂｒａ⁃
ｃｈｉａｔｕｍ、绿色木霉 Ｔ． ｖｉｒｉｄｅ以及粘绿木霉 Ｔ． ｖｉｒｅｎｓ，
均为本实验室分离鉴定和保藏菌种。 腐皮镰孢菌
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ、尖镰孢菌 Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、辣椒疫霉
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ、瓜果腐霉菌 Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒ⁃
ｍａｔｕｍ以及立枯丝核菌 Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ，均为中国
农业科学院蔬菜花卉研究所菜病综防实验室分离和
保藏。 黄瓜品种为津春 ５ 号，由天津农业科学院
提供。
培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘ⁃
ｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ）：马铃薯 ２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ、琼脂粉
２０ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ，不加入琼脂粉即为 ＰＤ 液体
培养基；燕麦培养基：燕麦片 ３０ ｇ、琼脂 ２０ ｇ、蒸馏水
１ ０００ ｍＬ。
试剂及仪器：ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ，日本 ＴａＫａＲａ
公司；ＤＮＡ产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶 ＤＮＡ 回收
试剂盒、质粒提取试剂盒，天根生化科技（北京）有
限公司；感受态细胞、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ｅｘ ＴａｑＴＭ、Ｐｒｅｍｉｘ
（包含 Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶），宝生物工程
（大连）有限公司；染料 ｇｏｌｄｅｎ ｖｉｅｗ，博迈德生物工
程有限公司。 引物 ＩＴＳ１Ｓ （ ＣＣＡＡＡＣＴＣＴＴＴＣＴＧ⁃
ＴＡＧＴＣＣＣＣ）和 ＩＴＳ１Ｒ（ＧＣＡＴＴＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴ）由
生工生物工程（上海）有限公司合成。 ３Ｋ１５ 型高速
离心机，德国 Ｓｉｇｍａ公司；ＤＹＹ⁃６Ｃ型电泳仪，北京市
六一仪器厂；真空冷冻干燥机（Ｍｏｄｕｌｙ⁃Ｄ 冷冻腔），
美国 ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ 公司；ＮＤ⁃２０００Ｃ 紫外分光光度
计，美国 ＮａｎｏＤｒｏｐ公司；Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ ｉＣｙｅｌｅｒ ｉＱ５ 型荧光
定量 ＰＣＲ 仪、 ＰＴＣ⁃２００ 型 ＰＣＲ 仪，美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ
公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 菌株 ＤＮＡ提取
在燕麦培养基上培养辣椒疫霉和瓜果腐霉，在
３５５４ 期 贺字典等： 棘孢木霉 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ在土壤中定殖量的荧光定量 ＰＣＲ检测
ＰＤＡ平板上培养腐皮镰孢、尖镰孢和立枯丝核菌，
待长满平板后，用灭菌蒸馏水洗下孢子或孢子囊，分
别吸取 ５ ｍＬ于相应 ＰＤ液体培养基中，２８℃、１５０ ｒ ／
ｍｉｎ振荡培养 ７ ｄ，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎ，得到菌
丝体，用灭菌滤纸吸干，置于 － ８０℃冰箱中保存备
用。 采用改良 ＣＴＡＢ法提取基因组 ＤＮＡ：在预冷的
研钵中迅速加入液氮将菌丝体、孢子或孢子囊研磨
成粉末后，称取 １ ｇ 菌粉于 ５ ｍＬ 离心管中，加入 １
ｍＬ预热的 ＣＴＡＢ，用涡旋器混匀。 ６５℃温育 １ ｈ，期
间上下颠倒 ２ ～ ３ 次。 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ，吸
取上清液，加入等体积的 ２４ ∶ １的氯仿 ∶ 异戊醇，上
下颠倒 ７ ～ ８ 次，放置 １０ ｍｉｎ。 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０
ｍｉｎ。 吸取上清液，加入 ２ ／ ３ 体积预冷的异丙醇，
－ ２０℃放置至产生絮状沉淀。 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０
ｍｉｎ。 弃上清液，沉淀用 ７０％乙醇冲洗 ２ 次，在无菌
操作台上侧风吹干。 加入 １ × ＴＥ ３０ ～ ５０ μＬ，４℃过
夜溶解。 保存于 － ２０℃备用。
１􀆰 ２􀆰 ２ 荧光定量 ＰＣＲ标准曲线的绘制
吸取棘孢木霉质粒 ＤＮＡ １ μＬ，用 ９９ μＬ 灭菌
ｄｄＨ２Ｏ稀释后， ＮＤ⁃２０００Ｃ 紫外分光光度计在 ２６０
ｎｍ下测定其吸光值，然后用灭菌 ｄｄＨ２Ｏ 稀释为
１０ － １ ～ １０ － ６系列浓度的标准品，经过三步法进行定
量 ＰＣＲ 扩增，用于制作棘孢木霉 ＤＮＡ 荧光定量
ＰＣＲ检测的标准曲线。 采用 ２５ μＬ反应体系：ＳＹＢＲ
Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（２ × ）１２􀆰 ５ μＬ、１０ μｍｏｌ ／ Ｌ引物 ＩＴＳ１Ｓ
和 ＩＴＳ１Ｒ各 １ μＬ、 ＤＮＡ 模板 １ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ９􀆰 ５ μＬ。
荧光定量 ＰＣＲ 扩增条件：９５℃预变性 １０ ｓ；９５℃变
性 １０ ｓ，６０℃退火 １５ ｓ，７２℃延伸 ３０ ｓ，４５ 个循环，
５５℃延伸 １０ ｓ，按 ０􀆰 １℃ ／ ｓ 升温速率从 ５５℃升至
９５℃，每升高 ０􀆰 ５℃检测 １ 次荧光信号，进行熔解曲
线分析。 以标准质粒 ＤＮＡ浓度对数为横坐标，反应
循环数（Ｃｔ）为纵坐标绘制标准曲线。 根据下列公
式计算样本浓度和基因拷贝数 （ Ｈｉｅｔａｌａ ｅｔ ａｌ． ，
２００３）。 待测样本浓度（ｎｇ ／ μＬ） ＝ ＯＤ２６０ × ５０ ×稀释
倍数；样本分子量 ＝ 碱基数 × ３２４；待测样本拷贝
数 ＝ （待测样本浓度 ／样本分子量） × ６ × １０１４。
１􀆰 ２􀆰 ３ 引物特异性和重复性检测
以棘孢木霉 ＤＮＡ 和其它 ９ 种真菌 ＤＮＡ 为模
板，利用引物 ＩＴＳ１Ｓ ／ ＩＴＳ１Ｒ 进行普通 ＰＣＲ 扩增，同
时用上述建立的荧光定量 ＰＣＲ 体系对所有菌株的
ＤＮＡ进行扩增，以检测该引物的特异性。 普通 ＰＣＲ
扩增体系为：Ｐｒｅｍｉｘ １２􀆰 ５ μＬ、１０ μｍｏｌ ／ Ｌ 正反引物
各 １ μＬ、模板 ＤＮＡ １ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ９􀆰 ５ μＬ。 ＰＣＲ反应
条件：９４℃预变性 ５ ｍｉｎ；９４℃变性 ３０ ｓ，５７℃退火 １
ｍｉｎ，７２℃延伸 １ ｍｉｎ，共 ２５ 个循环；７２℃延伸 ７ ｍｉｎ。
扩增完成后取 ４ μＬ ＰＣＲ 扩增产物在 ２􀆰 ０％琼脂糖
凝胶上电泳检测；荧光定量 ＰＣＲ 循环结束后，采用
仪器自带的软件分析扩增结果。
进行批内重复和批间重复试验，验证该检测技
术的重复性，质粒标准品 ＤＮＡ 初始浓度为 ２􀆰 ８ ｍｇ ／
ｍＬ，依次 １０ 倍梯度稀释，以此稀释液为反应模板。
批内重复试验采用同一模板，同时进行 ５ 次重复测
定；批间重复试验是以不同批次对同一模板进行 ５
次重复。
１􀆰 ２􀆰 ４ 灭菌土壤中棘孢木霉定殖量的检测
在 ＰＤＡ平板上活化尖镰孢菌和棘孢木霉，２５℃
下培养 ３ ｄ，再转入 ＰＤ液体培养基中培养 ５ ｄ，菌液
过滤，除去菌丝，滤液经 ５ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，取
沉淀用无菌蒸馏水稀释，用血球计数板将尖镰孢菌
调成浓度为 １ × １０７ＣＦＵ ／ ｍＬ 的孢子悬浮液，棘孢木
霉调成浓度为 １ × １０９ ＣＦＵ ／ ｍＬ 的孢子悬浮液，
备用。
在培养 ３ ｄ的棘孢木霉菌落上用直径 ５ ｍｍ 的
打孔器打取菌落圆片，然后接种于 ＰＤＡ 平板上，待
分生孢子长满平板后，用灭菌毛刷刷下分生孢子，按
照比例加无菌蒸馏水与灭菌土混合均匀，制成
１􀆰 ０ × １０９、１􀆰 ０ × １０８、１􀆰 ０ × １０７、１􀆰 ０ × １０６、１􀆰 ０ × １０５、
１􀆰 ０ × １０４、１􀆰 ０ × １０３、５􀆰 ０ × １０２、１０、０ ＣＦＵ ／ ｇ 土共 １０
种不同浓度的木霉土样，备用。 采用胚芽接种法接
种黄瓜尖镰孢菌，出苗后调查病情指数，计算防治效
果。 病情指数 ＝ ∑［（各级病株数 ×相对级数量） ／
（调查总株数 ×最大病级数）］ × １００；防治效果 ＝
（对照病情指数 －处理病情指数） ／对照病情指数 ×
１００％ 。 同时取上述接种木霉菌浓度不同的土样快
速冷冻，取每个浓度的冻干土壤样本 ０􀆰 ２ ｇ，采用
ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ® ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ试剂盒提取土壤 ＤＮＡ。
采用已建立的实时荧光定量 ＰＣＲ体系进行检测。
１􀆰 ２􀆰 ５ 温室田间土壤中棘孢木霉定殖量的检测
黄瓜种子经温汤浸种催芽后，播种于直径 １０
ｃｍ的营养钵中，每钵 ２ 粒种子，待第 １ 片真叶长出
时，移栽到温室小区中，小区面积 ８ ｍ２（８ ｍ ×１ ｍ），
每个小区 ５０ 株，３ 次重复，小区随机分布，接种棘孢
木霉和尖镰孢菌，并设接尖镰孢菌对照和不接菌空
白对照。 当黄瓜苗长出 ２ ～ ３ 片真叶时，向每株瓜苗
根际土中注射 １０９ ＣＦＵ ／ ｍＬ 棘孢木霉孢子悬浮液 ５
ｍＬ，上面用无菌土覆盖 ２ ～ ３ ｃｍ。 ３ ｄ后用小刀破坏
根系，每株接入 １０７ ＣＦＵ ／ ｍＬ尖镰孢菌孢子悬浮液 ３
ｍＬ。 从接种后第 ７ 天开始，每隔 ７ ｄ 用专用铲子采
４５５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
集黄瓜植株根际土壤 １ 次，每次取 ３ 株，３ 次重复，
按四分法混匀后装入密封袋内，立即进行抽真空冷
冻干燥，加入液氮研磨。 等对照植株发病后调查病
情指数，计算防治效果。 采用强 ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ® ＤＮＡ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ试剂盒方法提取土壤 ＤＮＡ。 采用已建
立的实时荧光定量 ＰＣＲ体系进行检测。
１􀆰 ３ 数据分析
采用 Ｅｘｃｅｌ ２００３ 和 ＳＡＳ ９􀆰 １􀆰 ３ 软件对试验数据
进行统计分析，采用单因素方差分析，ＬＳＤ 法进行差
异显著性检验。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 棘孢木霉质粒荧光定量 ＰＣＲ检测体系的建立
棘孢木霉 ＤＮＡ 阳性质粒拷贝数在标准品模板
浓度为 ２􀆰 ８ × １０３ ～ ２􀆰 ８ × １０ － ２ ｎｇ ／ μＬ 范围内有良好
的线性关系（ｙ ＝ － ３􀆰 ６２ｘ － ３􀆰 ２６），Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９８，扩增
效率为 ９３􀆰 ２％ 。 扩增后进行熔解曲线分析可知，在
５５ ～ ９５℃范围内，仅在 ８２℃时有一特异性峰，引物
特异性良好，表明建立的棘孢木霉荧光定量 ＰＣＲ 检
测体系符合要求（图 １）。
图 １ 棘孢木霉荧光定量 ＰＣＲ扩增熔解曲线
Ｆｉｇ． １ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ ｂｙ ＲＴ⁃ＰＣＲ
Ａ０３、Ｂ０３、Ｃ０３、Ｄ０３、Ｅ０３、Ｆ０３、Ｇ０３、Ｈ０３ 依次表示棘
孢木霉质粒稀释 １０ － ９、１０ － ８、１０ － ７、１０ － ６、１０ － ５、１０ － ４、１０ － ３
和 １０ － ２倍。 Ａ０３， Ｂ０３， Ｃ０３， Ｄ０３， Ｅ０３， Ｆ０３， Ｇ０３， ａｎｄ
Ｈ０３ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｏｆ Ｔ． ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ
ｗｉｔｈ １０ － ９， １０ － ８， １０ － ７， １０ － ６， １０ － ５， １０ － ４， １０ － ３， ａｎｄ
１０ － ２， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
　
２􀆰 ２ 引物的特异性
使用引物 ＩＴＳ１Ｓ 和 ＩＴＳ１Ｒ 对棘孢木霉、哈茨木
霉、绿色木霉、长枝木霉、粘绿木霉、尖镰孢菌、腐皮
镰孢菌、辣椒疫霉、立枯丝核菌和瓜果腐霉菌 ＤＮＡ
进行普通 ＰＣＲ扩增后，只有棘孢木霉能扩增出 １２６
ｂｐ的产物（图 ３），其它均无扩增条带，说明设计的
引物对棘孢木霉特异区 ＤＮＡ具有专一性，而且具有
高度的准确性。 同样对 １０ 种真菌 ＤＮＡ 荧光定量
ＰＣＲ扩增后，只有棘孢木霉在 ８２℃有扩增信号，而
其它木霉及病原真菌则没有（图 ２）。
图 ２ ＩＴＳ１Ｓ ／ ＩＴＳ１Ｒ对棘孢木霉 ＤＮＡ特异性扩增图谱
Ｆｉｇ． ２ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ
ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇｉ ｂｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ＩＴＳ１Ｓ ／ ＩＴＳ１Ｒ
１： 棘孢木霉； ２： 哈茨木霉； ３： 绿色木霉； ４： 长枝
木霉； ５： 粘绿木霉； ６： 尖镰孢菌； ７： 辣椒疫霉； ８： 瓜
果腐霉菌； ９： 腐皮镰孢菌； １０： 立枯丝核菌。 １： Ｔ． ａｓ⁃
ｐｅｒｅｌｌｕｍ； ２： Ｔ． ｈａｒｚｉａｎｕｍ； ３： Ｔ． ｖｉｒｉｄｅ； ４： Ｔ． ｌｏｎｇｉｂｒａ⁃
ｃｈｉａｔｕｍ； ５： Ｔ． ｖｉｒｅｎｓ； ６： Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ； ７： Ｐ． ｃａｐｓｉｃｉ； ８：
Ｐ． ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ； ９： Ｆ． ｓｏｌａｎｉ； １０： Ｒ． ｓｏｌａｎｉ．
　
２􀆰 ３ 灭菌土壤中棘孢木霉定殖量的检测效果
采用人工接种的土壤样本对已建立的荧光定量
ＰＣＲ 体系进行有效性验证，所得标准曲线为
ｙ ＝ － ３􀆰 ０２７ｘ ＋ ７􀆰 ４５２４，Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９８７９。 表明本研究建
立的棘孢木霉荧光定量 ＰＣＲ 检测体系具有很高的
灵敏性及可靠性。 当土壤中接入 １０ ＣＦＵ ／ ｇ 棘孢木
霉孢子时，用该体系没有检测到 ＤＮＡ 拷贝数；当土
壤中接入 ５００ ＣＦＵ ／ ｇ棘孢木霉孢子时，ＤＮＡ 拷贝数
为 １５ ｆｇ ／ μＬ， 对黄瓜枯萎病的防治效果仅为
１􀆰 ２５％ ；当孢子浓度高于 １􀆰 ０ × １０７ ＣＦＵ ／ ｇ 时，ＤＮＡ
拷贝数大于 １ ８６６ ｆｇ ／ μＬ，防治效果则高于 ６４􀆰 ２９％
（表 １）。 说明用荧光定量 ＰＣＲ 测定棘孢木霉 ＤＮＡ
质粒拷贝数后，就可以准确计算棘孢木霉定殖量，再
预测棘孢木霉对黄瓜枯萎病的防治效果。
２􀆰 ４ 温室土壤中棘孢木霉定殖量的检测效果
用棘孢木霉防治黄瓜枯萎病后，在黄瓜根际土
壤中，第 ７ 天时棘孢木霉 ＤＮＡ 的初始拷贝数为 ３２０
ｎｇ ／ μＬ，之后拷贝数急剧下降，黄瓜枯萎病尚未发
病；而 １４ ｄ后棘孢木霉 ＤＮＡ拷贝数开始上升，到 ５６
ｄ 急剧上升到 １３ ２００ ｎｇ ／ μＬ，此时黄瓜处于旺盛生
５５５４ 期 贺字典等： 棘孢木霉 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ在土壤中定殖量的荧光定量 ＰＣＲ检测
　 　 　 　表 １ 不同孢子浓度棘孢木霉的荧光定量 ＰＣＲ的拷贝数
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ⁃ＰＣＲ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（ＣＦＵ ／ ｇ ｓｏｉｌ）
ＤＮＡ拷贝数
ＤＮＡ ｃｏｐｙ
（ｆｇ ／ μＬ）
防治效果
Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｅｆｆｅｃｔ （％ ）
１􀆰 ０ × １０９ ６７ ３０２ ± １２５􀆰 ４ ａ ８６． ８５ ± ５． ８７ ａ
１． ０ × １０８ ４３ ２０９ ± ５３􀆰 ６ ｂ ８０． ５８ ± ４． ６２ ａ
１． ０ × １０７ １ ８６６ ± １２􀆰 ３ ｃ ６４． ２９ ± ２． ４５ ａｂ
１． ０ × １０６ ５０１ ± ５． ７ ｄ ３７． ６７ ± ２． ０４ ｃ
１． ０ × １０５ １８６ ± ３􀆰 ２ ｅ １６． ８３ ± ３． ３３ ｃｄ
１． ０ × １０４ ９０ ± ０􀆰 ７ ｆ ８． ６９ ± ３． １２ ｄ
１． ０ × １０３ ４３ ± １􀆰 ２ ｇ ５． ４７ ± １． ０２ ｅ
５． ０ × １０２ １５ ± ０􀆰 ３ ｈ １． ２５ ± ０． １６ ｆ
１􀆰 ０ × １０１ — ０􀆰 ００ ± ０􀆰 ００ ｇ
０ — ０􀆰 ００ ± ０􀆰 ００ ｇ
　 　 表中数据为平均数 ± 标准差。 同列不同字母表示经
ＬＳＤ法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平差异显著。 Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＤ．
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒ⁃
ｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ＬＳＤ ｔｅｓｔ．
长期，棘孢木霉对黄瓜枯萎病的防治效果为
７０􀆰 ２４％ ；到 ７０ ｄ 时棘孢木霉 ＤＮＡ 拷贝数为 ５１ ６００
ｎｇ ／ μＬ，对黄瓜枯萎病的防治效果为 ７６􀆰 ８１％ ；到 １００
ｄ 时，棘孢木霉 ＤＮＡ 拷贝数急剧下降，仅为 ２２０ ｎｇ ／
μＬ，对黄瓜枯萎病的防治效果为 ５０􀆰 ００％ （表 ２）。
说明通过采用荧光定量 ＰＣＲ 技术体系检测田间棘
孢木霉的定殖量，从而评价其对黄瓜枯萎病的防治
效果是可靠的。
表 ２ 防治黄瓜枯萎病后黄瓜根际土壤中棘孢木霉
的荧光定量 ＰＣＲ的拷贝数
Ｔａｂｌｅ ２ ＣＴ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ
ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ⁃ＰＣＲ
接种处理
Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ＤＮＡ拷贝数
ＤＮＡ ｃｏｐｙ （ｎｇ ／ μＬ）
防治效果
Ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ （％）
７ ｄ ３２０ ± １０． ３ ｄ １００􀆰 ００ ±１００􀆰 ００ ａ
１４ ｄ １２９ ± ３． ０ ｆ １００􀆰 ００ ±１００􀆰 ００ ａ
２８ ｄ ４２６ ± ５． ６ ｃ ６５􀆰 ３３ ± １􀆰 ２８ ｃ
４２ ｄ ３４５ ± ２０． ７ ｃ ５６􀆰 ５５ ± ２􀆰 ０３ ｄ
５６ ｄ １３ ２００ ± ３８． ５ ｂ ７０􀆰 ２４ ± ２􀆰 ４５ ｂ
７０ ｄ ５１ ６００ ± ２０． ６ ａ ７６􀆰 ８１ ± ３􀆰 ０２ ｂ
８４ ｄ １５ ４００ ± ３０． ２ ｂ ６４􀆰 ２９ ± ２􀆰 ８７ ｃ
１００ ｄ ２２０ ± ４． ５ ｅ ５０􀆰 ００ ± ２􀆰 ５４ ｅ
空白对照
Ｂｌａｎｋ ＣＫ
０ ± ０􀆰 ０ ｈ －　
只接病菌对照
Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＣＫ
９． １３ ± ０． １ ｇ －　
　 　 表中数据为平均数 ± 标准差。 同列不同字母表示经
ＬＳＤ法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平差异显著。 Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＤ．
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒ⁃
ｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ＬＳＤ ｔｅｓｔ．
３ 讨论
实时荧光定量 ＰＣＲ 以操作简便、高效快速、敏
感性强、重复性好和特异性高等优点，已被作为一种
成熟的技术手段用于微生物生态学研究（Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ． ，２００５）。 Ｈａｇｎ ｅｔ ａｌ． （２００７）建立了自然环境中
生防木霉的荧光定量 ＰＣＲ 体系，能够高效稳定地扩
增含有木霉的土壤样品总 ＤＮＡ，推动了荧光定量
ＰＣＲ在生物防治中的发展。 本研究建立的棘孢木
霉荧光定量 ＰＣＲ扩增方法具有良好的线性关系，Ｒ２
为 ０􀆰 ９９８；熔解曲线只在 ８２℃处有单一峰值，说明对
棘孢木霉 ＰＣＲ扩增特异性强；能够准确单一地检测
出棘孢木霉的数量，在每个质量浓度下都有相对应
的 ＣＴ值，采用该对引物对棘孢木霉 ＤＮＡ 扩增后，
只有棘孢木霉出现 １２６ ｂｐ大小的特征条带。
作为生防菌，木霉拮抗菌株对植物土传病害的
防治效果与其在植物根际土壤中的定殖情况密切相
关（Ａｈａｍｄ ＆ Ｂａｋｅｒ， １９８７）。 同样，在作物根际的定
殖能力也是检测棘孢木霉生防效果高低的重要指
标。 陶萌（２００８）建立了粉红粘帚霉 Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏ⁃
ｓｅｕｍ实时荧光定量 ＰＣＲ 定量检测体系，明确了该
菌与水稻纹枯病菌在 ７５ ｄ 内互作菌株间种群数量
的变化趋势，为生物防治因子的防治效果评价提供
了方法依据。 Ｌａｇｏｐｏｄｉ ｅｔ ａｌ． （２００２）和 Ｈｏｈｍａｎｎ ｅｔ
ａｌ． （２０１２）将 ＧＵＳ或 ＧＦＰ基因引入尖镰孢菌和木霉
菌中作为报告基因，来监测番茄根际镰孢菌和松苗
根际木霉菌的定殖情况，但没有测定二者的数量。
Ｂａｅａｕｌｉｅｕ ｅｔ ａｌ． （２０１１）采用 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ和平板计数法
监测泥炭和康乃馨腐生基质中哈茨木霉的数量时，
认为 ２ 种方法所测定的数据无差异。 Ｃｏｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．
（２００７）和 Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１１）分别用 ｑＰＣＲ技术和平
板稀释记数法测定了绿色木霉、多孢木霉 Ｔ． ｐｏｌｙｓｐｏ⁃
ｒｕｍ在土壤中的定殖情况，但没有测定 ２ 种生防菌
对病害的防治效果。 在本研究中，当土壤中接种
５００ ＣＦＵ ／ ｍＬ棘孢木霉孢子时，用荧光定量 ＰＣＲ 检
测到的 ＤＮＡ拷贝数为 １５ ｆｇ ／ μＬ，对黄瓜枯萎病的防
治效果为 １􀆰 ２５％ ；而当孢子浓度高于 １０７ ＣＦＵ ／ ｇ 土
时，ＤＮＡ拷贝数大于 １ ８６６ ｆｇ ／ μＬ，防治效果则高于
６４􀆰 ２９％ ，因此可以用该技术测定土壤中棘孢木霉的
ＤＮＡ拷贝数后，推测其对黄瓜枯萎病的防治效果。
在研究木霉菌与尖镰孢菌互作过程中的生物量
变化时，多数选用选择性培养基平板计数（Ｃｈｅｅｔｈａｍ
ｅｔ ａｌ． ，１９９７），但该方法只是单独检测生防菌或病原
菌数量，不能反映出生防菌和病原菌间同期数量变
６５５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
化情况。 荧光定量 ＰＣＲ 技术已广泛应用于生防菌
和病原菌的动态定量检测如哈茨木霉（Ｂｅａｕｌｉｅｕａ ｅｔ
ａｌ． ，２０１１）、深绿木霉 Ｔ． ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ （ Ｌｏｎｇａ ｅｔ ａｌ． ，
２００９）和大丽花轮枝孢菌 Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ（Ａｔａｌｌａｈ
ｅｔ ａｌ． ，２００７）、尖镰孢菌（ Ｊｉｍéｎｅｚ⁃Ｆｅｒｎáｎｄｅｚａ ｅｔ ａｌ． ，
２０１０）。 而本研究用棘孢木霉防治黄瓜枯萎病后，
通过荧光定量 ＰＣＲ 检测体系不仅能够测定黄瓜根
际棘孢木霉的数量，而且还测定了棘孢木霉对黄瓜
枯萎病的生防效果。 棘孢木霉在黄瓜根际的数量经
历了低 －高 －低的动态变化，说明棘孢木霉施入土
壤后有一个适应过程，一旦适应后，其定殖数量能够
迅速上升，与黄瓜尖镰孢菌互作起到防病作用。 此
外，在测定黄瓜根际棘孢木霉数量的同时，还应该测
定尖镰孢菌的数量。 用该检测体系可进一步监测棘
孢木霉与尖镰孢菌的动态变化，以便快速检测二者
在土壤中的实时数量，一方面为研究棘孢木霉与植
物、病原菌的互作提供参考，另一方面为棘孢木霉田
间生防效果的测定奠定基础。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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ｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ ｌｉｎｅｓ ｔｈａｔ ｄｉｆｆｅｒ ｉｎ ｒｅ⁃
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（责任编辑：高　 峰）
８５５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷