全 文 ：水稻茄丝核菌 杂砸粤孕引物筛选与体系优化
刘志恒员 摇 胡积祥员 摇 侯摇 悦员 摇 黄欣阳圆 摇 魏松红员
渊员援沈阳农业大学袁 沈阳 员员园愿远远曰 圆援沈阳市农业技术推广站袁 沈阳 员员园园猿源冤
摘要院 为了应用新型的 杂砸粤孕分子标记技术分析水稻茄丝核菌基因多态性和探究基因多态性与采
集来源及水稻品种之间的关系袁以吉林省不同地理位置的 猿 株水稻丝核菌为材料袁从 员园园 对 杂砸粤孕
引物中筛出较理想的引物 员远 对袁并对影响 杂砸粤孕反应的 酝早圆 垣 尧凿晕栽孕泽尧引物尧栽葬择 阅晕粤聚合酶尧模板
阅晕粤浓度及两次退火温度等条件进行了优化袁建立了适宜于该菌的 杂砸粤孕 反应体系袁圆缘 滋蕴 的反应
体系包含 圆援 缘 皂皂燥造 辕 蕴 酝早圆 垣 尧园援 员缘 皂皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕泽尧园援 愿 滋皂燥造 辕 蕴 引物尧员援 缘 哉 栽葬择 阅晕粤 聚合酶和 愿园 灶早
模板 阅晕粤遥 利用 圆源 株水稻丝核菌对优化后的 杂砸粤孕反应体系进行了验证袁结果表明该反应体系稳
定可靠袁能够有效地用于水稻茄丝核菌的遗传多样性分析遥
关键词院 水稻曰茄丝核菌曰 杂砸粤孕曰 引物筛选曰 体系优化
韵责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 杂砸粤孕 泽赠泽贼藻皂 葬灶凿 责则蚤皂藻则 泽糟则藻藻灶蚤灶早
燥枣 砸澡蚤扎燥糟贼燥灶蚤葬 泽燥造葬灶蚤 蚤灶 则蚤糟藻
蕴蚤怎 在澡蚤澡藻灶早员 摇 匀怎 允蚤曾蚤葬灶早员 摇 匀燥怎 再怎藻员 摇 匀怎葬灶早 载蚤灶赠葬灶早圆 摇 宰藻蚤 杂燥灶早澡燥灶早员
渊员援 杂澡藻灶赠葬灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 杂澡藻灶赠葬灶早 员员园愿远远袁 蕴蚤葬燥灶蚤灶早 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 杂澡藻灶赠葬灶早
粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 栽藻糟澡灶燥造燥早赠 孕则燥皂燥贼蚤燥灶 杂贼葬贼蚤燥灶袁 杂澡藻灶赠葬灶早 员员园园猿源袁 蕴蚤葬燥灶蚤灶早 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 陨灶 燥则凿藻则 贼燥 葬责责造赠 贼澡藻 泽藻择怎藻灶糟藻鄄则藻造葬贼藻凿 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂 渊杂砸粤孕冤 贼燥 葬灶葬造赠扎藻 早藻灶藻 责燥造赠鄄
皂燥则责澡蚤泽皂 燥枣 砸澡蚤扎燥糟贼燥灶蚤葬 泽燥造葬灶蚤 蚤灶 则蚤糟藻 葬灶凿 泽贼怎凿赠 贼澡藻 则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责 葬皂燥灶早 贼澡藻 早藻灶藻 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂袁 糟燥造造藻糟贼藻凿
泽蚤贼藻 葬灶凿 则蚤糟藻 增葬则蚤藻贼蚤藻泽袁 员园园 责葬蚤则泽 燥枣 杂砸粤孕 责则蚤皂藻则泽 憎藻则藻 泽糟则藻藻灶藻凿 遭赠 怎泽蚤灶早 猿 蚤泽燥造葬贼藻泽 枣则燥皂 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 则藻早蚤燥灶泽
蚤灶 允蚤造蚤灶 孕则燥增蚤灶糟藻 葬泽 皂葬贼藻则蚤葬造泽援 粤灶凿 员远 责葬蚤则泽 憎藻则藻 泽藻造藻糟贼藻凿 葬灶凿 贼澡藻 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶泽 燥枣 酝早圆 垣 袁 凿晕栽孕泽袁 责则蚤皂鄄
藻则泽袁 栽葬择 阅晕粤 责燥造赠皂藻则葬泽藻袁 贼藻皂责造葬贼藻 阅晕粤 葬灶凿 贼澡藻 贼憎燥 葬灶灶藻葬造蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻泽 憎澡蚤糟澡 葬枣枣藻糟贼 贼澡藻 杂砸粤孕 则藻鄄
葬糟贼蚤燥灶泽 燥枣 砸援 泽燥造葬灶蚤 憎藻则藻 燥责贼蚤皂蚤扎藻凿援 粤糟糟燥则凿蚤灶早造赠袁 葬 杂砸粤孕 泽赠泽贼藻皂 泽怎蚤贼葬遭造藻 枣燥则 砸援 泽燥造葬灶蚤 憎葬泽 藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿援
栽澡藻 燥责贼蚤皂怎皂 圆缘 滋蕴 则藻葬糟贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 糟燥灶贼葬蚤灶藻凿 圆援 缘 皂皂燥造 辕 蕴 酝早圆 垣 袁 园援 员缘 皂皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕泽袁 园援 愿 滋皂燥造 辕 蕴 燥枣
藻葬糟澡 责则蚤皂藻则袁 员援 缘 哉 栽葬择 阅晕粤 责燥造赠皂藻则葬泽藻 葬灶凿 愿园 灶早 贼藻皂责造葬贼藻 阅晕粤援 栽澡藻 燥责贼蚤皂怎皂 泽赠泽贼藻皂 憎葬泽 贼藻泽贼蚤枣蚤藻凿
怎泽蚤灶早 圆源 蚤泽燥造葬贼藻泽 燥枣 砸援 泽燥造葬灶蚤援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 杂砸粤孕 责则蚤皂藻则泽 葬灶凿 贼澡藻 泽赠泽贼藻皂 憎藻则藻 泽贼藻葬凿赠 葬灶凿
则藻造蚤葬遭造藻袁 憎澡蚤糟澡 糟燥怎造凿 遭藻 葬责责造蚤藻凿 贼燥 早藻灶藻贼蚤糟 凿蚤增藻则泽蚤贼赠 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 砸援 泽燥造葬灶蚤 蚤灶 则蚤糟藻援
运藻赠 憎燥则凿泽院 则蚤糟藻曰 砸澡蚤扎燥糟贼燥灶蚤葬 泽燥造葬灶蚤曰 杂砸粤孕曰 责则蚤皂藻则 泽糟则藻藻灶蚤灶早曰 泽赠泽贼藻皂 燥责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶
摇 摇 水稻纹枯病是一种世界性病害袁在我国各水稻
产区均有发生袁发病面积已占水稻种植总面积的
源园豫 袁成为限制水稻高产和稳产的主要障碍之一遥
该病病原菌为茄丝核菌 砸澡蚤扎燥糟贼燥灶蚤葬 泽燥造葬灶蚤袁因其寄主
范围广尧致病性复杂及形态特征等方面存在差异袁通
常采用菌丝融合群分类法进行分类遥 据报道袁湖北
省咱员暂 尧华南 猿 省咱圆暂 尧四川省咱猿暂水稻纹枯病菌属于
粤郧员鄄玉粤群曰而云南咱源暂 尧广西咱缘暂 尧辽宁咱远暂 猿 省水稻纹
枯病菌除存在 粤郧员鄄玉粤 群外袁还存在 粤郧员鄄玉月尧
粤郧员鄄玉悦尧粤郧源鄄匀郧玉尧粤郧源鄄匀郧域尧粤郧远鄄郧宰 融合群遥
因此袁该病原菌菌群的构成具有复杂性和遗传多样
性遥 但是菌丝融合群分类法不能提供茄丝核菌不同
基金项目院 国家水稻产业技术体系渊悦粤砸杂鄄园员鄄园圆粤冤
作者简介院 刘志恒袁男袁员怨缘源年生袁教授袁研究方向为植物病原真菌学袁 耘鄄皂葬蚤造院 造扎澡澡员怨缘源岳 员远猿援 糟燥皂
收稿日期院 圆园员猿 原 园猿 原 圆圆
第 源园 卷摇 第 缘 期
圆园员猿 年摇 员园 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源园摇 晕燥援 缘
韵糟贼援 摇 圆园员猿
融合群间或同一融合群内各亚群间以及同一融合群
内或亚群内比较全面的遗传多样性和种群系统演化
信息袁而且桥梁菌株的存在干扰菌丝融合群的测定遥
分子标记技术的发展为解决上述难题提供了有效手
段袁国内外学者利用扩增片段长度多态性 阅晕粤渊葬皂鄄
责造蚤枣蚤藻凿 枣则葬早皂藻灶贼 造藻灶早贼澡 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂袁 粤云蕴孕冤尧随机扩
增多态性 阅晕粤渊则葬灶凿燥皂 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 责燥造赠皂燥则责澡蚤糟 阅晕粤袁
砸粤孕阅冤尧简单重复序列 渊 泽蚤皂责造藻 泽藻择怎藻灶糟藻 则藻责藻葬贼袁
杂杂砸冤 和简单重复序列间扩增 渊蚤灶贼藻则鄄泽蚤皂责造藻 泽藻择怎藻灶糟藻
则藻责藻葬贼袁陨杂杂砸冤标记技术揭示其基因组中的多态性袁但
尚未见利用基于序列扩增多态性渊 泽藻择怎藻灶糟藻鄄则藻造葬贼藻凿
葬皂责造蚤枣蚤藻凿 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂袁 杂砸粤孕冤标记技术研究水稻
纹枯病菌遗传多样性的报道遥
杂砸粤孕标记技术由美国加州大学 蕴蚤 驭 匝怎蚤则燥泽咱苑暂
于 圆园园员 年提出袁利用独特的引物设计对开放读码框
渊韵砸云泽冤进行扩增袁上游引物长 员苑 遭责袁对外显子进行
特异扩增袁下游引物长 员愿 遭责袁对内含子区域尧启动子
区域进行特异扩增袁因个体不同及其物种的内含子尧
启动子与间隔长度不等而产生多态性遥 该技术在揭
示 阅晕粤序列多态性方面袁具有简便尧稳定尧中等产率
和容易得到选择条带序列的特点遥 目前袁杂砸粤孕 技
术已广泛用于植物遗传多样性的分析咱愿暂 袁但对植物
病原菌反应体系建立的研究报道较少袁而且引物应
用于不同的物种反应条件也不同袁因此对引物的筛
选和反应条件的优化尤为重要遥 本研究以吉林省不
同地理位置的 猿 株水稻丝核菌为材料袁探讨水稻丝
核菌 杂砸粤孕分析技术的最佳方案袁以期为病原菌遗
传多样性的分析提供科学依据遥
员 材料与方法
员援 员 材料
供试菌株院选用 圆园员员 年于吉林省不同稻区尧不
同水稻品种上采集的 员园 个代表菌株和国际通用的
员源 个标准菌株院粤郧员鄄玉粤尧粤郧员鄄玉月尧粤郧员鄄玉悦尧粤郧圆鄄
玉尧粤郧圆鄄郁尧粤郧猿尧粤郧源鄄匀郧玉尧粤郧源鄄匀郧域尧粤郧缘尧粤郧远鄄
匀郧玉尧粤郧远鄄匀郧吁尧粤郧愿尧粤郧怨尧粤郧鄄月陨 渊桥梁菌株冤遥
其中 员园 个代表菌株均为 粤郧员鄄玉粤 融合群袁其采集
稻区和采集水稻品种分别为院匀园园源袁舒兰市小城镇
开荒屯袁通粘 员 号曰匀园员源袁舒兰市小城镇下营屯袁九
稻 缘愿曰 匀园员愿袁蛟河市天北镇高台沟村袁九稻 缘愿曰
蕴园员源袁吉林市磐石市郊区袁长白 怨 号曰蕴园猿员袁吉林市永
吉县万昌镇袁农大 猿怨曰蕴园源缘袁公主岭市南崴子镇袁通
猿缘曰蕴园远缘袁吉林农业大学袁吉玉粳曰蕴园愿苑袁通化市辉南
县抚民镇袁吉粳 愿愿曰宰园园怨袁昌邑区孤店子镇永丰村袁
秋田小町曰杂园员袁梅河口市曙光镇曙光村袁秋田小町遥
试剂院酝早圆 垣 尧凿晕栽孕泽尧员园 伊 孕悦砸 遭怎枣枣藻则渊酝早圆 垣 枣则藻藻冤
购自宝生物工程渊大连冤有限公司曰栽葬择 酶尧阅蕴圆园园园
阅晕粤 造葬凿凿藻则 皂葬则噪藻则尧阅晕粤 提取试剂盒购自天根生化
科技渊北京冤有限公司遥 采用上海生工生物工程技
术服务有限公司合成的 员园 条上游引物和 员园 条下游
随机引物袁相互间搭配共形成 员园园 对引物咱苑袁 怨暂 遥 上
游引物序列渊缘忆 耀 猿忆冤院酝藻员院栽郧粤郧栽悦悦粤粤粤悦悦郧郧粤鄄
栽粤曰 酝藻圆院 栽郧粤郧栽悦悦粤粤粤悦悦郧郧粤郧悦曰 酝藻猿院 栽郧粤郧栽悦鄄
悦粤粤粤悦悦郧郧粤粤栽曰酝藻源院栽郧粤郧栽悦悦粤粤粤悦悦郧郧粤悦悦曰酝藻缘院
栽郧粤郧栽悦悦粤粤粤悦悦郧郧粤粤郧曰酝藻远院栽郧粤郧栽悦悦粤粤粤悦悦郧郧粤鄄
悦粤曰酝藻苑院栽郧粤郧栽悦悦粤粤粤悦悦郧郧粤悦郧曰酝藻愿院栽郧粤郧栽悦悦粤粤鄄
粤悦悦郧郧粤悦栽曰 酝藻怨院 栽郧粤郧栽悦悦粤粤粤悦悦郧郧粤郧郧曰 酝藻员园院
栽郧粤郧栽悦悦粤粤粤悦悦郧郧粤粤粤遥 下游引物序列渊缘忆 耀 猿忆冤院
耘皂员院 郧粤悦栽郧悦郧栽粤悦郧粤粤栽栽粤粤栽曰 耘皂圆院 郧粤悦栽郧悦郧鄄
栽粤悦郧粤粤栽栽栽郧悦曰 耘皂猿院 郧粤悦栽郧悦郧栽粤悦郧粤粤栽栽郧粤悦曰
耘皂源院 郧粤悦栽郧悦郧栽粤悦郧粤粤栽栽栽郧粤曰 耘皂缘院 郧粤悦栽郧悦郧鄄
栽粤悦郧粤粤栽栽粤粤悦曰 耘皂远院 郧粤悦栽郧悦郧栽粤悦郧粤粤栽栽郧悦粤曰
耘皂苑院 郧粤悦栽郧悦郧栽粤悦郧粤粤栽栽悦粤粤曰 耘皂愿院 郧粤悦栽郧悦郧鄄
栽粤悦郧粤粤栽栽悦粤悦曰 耘皂怨院 郧粤悦栽郧悦郧栽粤悦郧粤粤栽栽悦粤栽曰
耘皂员园院郧粤悦栽郧悦郧栽粤悦郧粤粤栽栽郧栽悦遥
仪器院垂直电泳槽 阅再悦在鄄圆源粤尧电泳仪 阅再再鄄
员园悦袁北京市六一仪器厂曰高速冷冻离心机 栽澡藻则皂燥
杂糟蚤藻灶贼蚤枣蚤糟 蕴藻早藻灶燥 酝蚤糟则燥 员苑砸 悦藻灶贼则蚤枣怎早藻尧微型核酸蛋
白检测仪 晕葬灶燥阅则燥责 晕阅鄄员园园园 杂责藻糟贼则燥责澡燥贼燥皂藻贼藻则袁赛默
飞世尔科技公司曰凝胶成像分析系统 郧月韵载鄄云猿 郧藻造
阅燥糟怎皂藻灶贼葬贼蚤燥灶 杂赠泽贼藻皂袁英国 杂赠灶早藻灶藻 公司曰孕悦砸 扩增
仪 灾藻则蚤贼蚤 怨远鄄宰藻造造 栽澡藻则皂葬造 悦赠糟造藻则袁美国应用生物系统
公司遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 菌丝 阅晕粤提取与检测
将 圆源 个供试菌株在 孕阅粤上 圆缘益培养 圆 凿袁打取
缘 耀 远 个直径 缘 皂皂菌片分别放入装有 员缘园 皂蕴 孕阅 培
养液渊马铃薯 圆园园 早尧葡萄糖 圆园 早尧水 员园园园 皂蕴冤的三角
瓶内袁于 圆缘 益尧员圆园 则 辕 皂蚤灶 振荡培养 源 耀 缘 凿遥 收集菌
丝袁放入 缘园 益温箱中完全烘干曰将干菌丝放入无菌
研钵中袁加入适量液氮进行研磨遥 磨好的样品保存
于 原圆园 益冰箱中备用遥 采用新型植物基因组 阅晕粤
提取试剂盒提取 圆源 个菌株的 阅晕粤袁将提取产物经
员援 园豫琼脂糖凝胶 员园园 灾 稳压电泳 源园 皂蚤灶 和微型核
酸蛋白检测仪检测其浓度和纯度袁 原 圆园 益 保存
备用遥
愿园源 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
员援 圆援 圆 基准 杂砸粤孕反应体系与程序
杂砸粤孕的反应体系参考 蕴蚤 驭 匝怎蚤则燥泽咱苑暂的方法袁
并加以改进遥 基准 孕悦砸 反应体系含 圆援 缘 哉 辕 滋蕴 栽葬择
酶 园援 缘 滋蕴尧缘园 灶早 辕 滋蕴 模板 阅晕粤 员援 园 滋蕴尧员园 伊 孕悦砸
遭怎枣枣藻则 渊酝早圆 垣 枣则藻藻冤 圆援 缘 滋蕴尧 圆援 缘 皂皂燥造 辕 蕴 耘葬糟澡 凿晕栽孕泽
圆援 园 滋蕴尧员园 滋皂燥造 辕 蕴上游引物 员援 园 滋蕴尧员园 滋皂燥造 辕 蕴下游
引物 员援 园 滋蕴尧圆缘 皂皂燥造 辕 蕴 酝早圆 垣 圆援 园 滋蕴尧凿凿匀圆韵 员远援 缘滋蕴遥 孕悦砸反应程序院怨缘 益预变性 缘 皂蚤灶曰怨缘 益变性 员
皂蚤灶袁猿缘 益复性 源缘 泽袁苑圆 益延伸 员 皂蚤灶袁源 个循环曰怨缘 益
变性 员 皂蚤灶袁缘远益复性 员 皂蚤灶袁苑圆益延伸 员 皂蚤灶袁猿源 个循
环曰最后 苑圆 益延伸 员园 皂蚤灶袁源 益保存遥
员援 圆援 猿 杂砸粤孕随机引物筛选
琼脂糖凝胶电泳筛选院选取地理位置差异大的
猿 株代表性水稻丝核菌 匀园员源尧匀园员愿 和 蕴园源缘 为 阅晕粤
模板袁利用基准 杂砸粤孕进行扩增袁产物用 圆豫琼脂糖
凝胶进行电泳袁从 员园园 对引物中筛选出条带较多的
引物遥 具体操作为院取 苑援 缘 滋蕴扩增产物和 猿 滋蕴 远 伊
造燥葬凿蚤灶早 遭怎枣枣藻则袁混合后加于 圆援 园豫琼脂糖凝胶点样
孔袁在 园援 缘 伊 栽月耘 电泳缓冲液中以恒定电压 员园园 灾
电泳约 圆 耀 圆援 缘 澡遥
非聚丙烯酰胺电泳筛选院将上步筛出引物的扩
增产物进行非聚丙烯酰胺电泳袁以筛选出条带清晰尧
多态性丰富且稳定的引物遥 具体操作为院取 猿援 缘 滋蕴
扩增产物和 圆 滋蕴 造燥葬凿蚤灶早 遭怎枣枣藻则袁混合后加入 远豫非聚
丙烯酰胺胶板的加样孔中袁圆圆园 灾恒压电泳圆 援 园 耀
圆援 缘 澡遥 结束后袁卸下胶板袁蒸馏水洗板 圆 次袁每次 圆
皂蚤灶遥 洗好的胶板放入 园援 圆豫硝酸银溶液中染色 员缘
皂蚤灶遥 然后迅速用蒸馏水洗板 圆 次袁每次 圆 皂蚤灶遥 洗
好的胶板放入 员 蕴 的显色液渊猿园 早 晕葬韵匀 垣 愿 皂蕴 甲
醛冤中显色袁时间约 缘 皂蚤灶至胶板上显现清晰条带为
止遥 然后放入 园援 苑缘豫 晕葬圆悦韵猿 终止液中处理遥 显色
结束后的胶板放到灯箱内拍照袁统计条带遥
员援 圆援 源 杂砸粤孕反应体系中单因素优化
对 杂砸粤孕反应体系中各组分的浓度分别进行单
因素分析袁确定水稻茄丝核菌 杂砸粤孕 反应中各组分
的适宜浓度遥 其中模板 阅晕粤 用量梯度设为 缘尧员园尧
圆 园尧源园尧愿园尧员远园尧圆缘园 灶早曰栽葬择酶用量梯度设为园 援 缘尧
员援 园尧员援 圆缘尧员援 缘尧员援 苑缘尧圆援 园 哉曰引物梯度设为 园援 员尧园援 圆尧
园援 源尧园援 远尧园援 愿尧员援 园尧员援 圆 滋皂燥造 辕 蕴曰酝早圆 垣用量梯度设为
园援 缘尧员援 园尧员援 缘尧圆援 园尧圆援 缘尧猿援 缘尧缘援 园 皂皂燥造 辕 蕴曰凿晕栽孕泽 用
量梯度设为 园援 园缘尧园援 员尧园援 圆尧园援 源尧园援 愿尧员援 圆 皂皂燥造 辕 蕴遥
其它参数严格控制袁确保试验的准确性遥
员援 圆援 缘 杂砸粤孕优化体系的确立和验证
根据单因子和正交组合实验结果选取 粤尧月尧悦尧
阅尧耘尧云尧郧 苑 个反应体系进行比较袁确立水稻茄丝核
菌 杂砸粤孕反应体系中试剂的用量遥 苑 个 圆缘 滋蕴 杂砸粤孕
反应体系中 栽葬择 酶尧 阅晕粤 模板尧 员园 伊 孕悦砸 遭怎枣枣藻则
渊酝早圆 垣 枣则藻藻冤在用量上相同袁 分别为 园援 远 滋蕴尧 愿园 灶早尧
圆援 缘 滋蕴曰在体系 粤尧月尧耘尧云 中 凿晕栽孕泽 用量为 圆援 园 滋蕴袁
悦尧阅中为 圆援 缘 滋蕴袁郧中为 员援 缘 滋蕴曰在体系 粤尧郧中上尧
下游引物用量为 圆援 园 滋蕴袁月尧悦尧耘 中为 员援 缘 滋蕴袁阅 中
为 圆援 缘 滋蕴袁云 中为 员援 园 滋蕴曰在体系 粤尧月尧悦尧阅尧云 中
酝早圆 垣用量为 圆援 园 滋蕴袁 耘尧 郧 中为 圆援 缘 滋蕴曰余下用
凿凿匀圆韵补齐遥
再用菌株 匀园员源 阅晕粤模板对体系的 圆 次退火温
度进行筛选袁选取最优退火温度组合袁确立水稻丝核
菌 杂砸粤孕最优反应体系遥 第 员 次退火温度梯度设为
猿猿尧猿源尧猿缘尧猿远尧猿苑 益曰第 圆 次退火温度设为 缘源尧缘缘尧
缘远尧缘苑尧缘愿益遥 利用 员园 株水稻茄丝核菌和 员源 个标准
菌株的 阅晕粤对 杂砸粤孕最优反应体系进一步确证遥
圆 结果与分析
圆援 员 菌丝 阅晕粤提取与检测
采用新型植物基因组提取试剂盒可有效提取
到质量较高的 阅晕粤袁韵阅圆远园 辕 韵阅圆愿园比值在 员援 苑 耀 圆援 园
之间 袁员 豫 琼脂糖电泳检测能出现较清晰的谱
带渊图 员冤遥
图 员 部分供试菌株基因组 阅晕粤电泳图
云蚤早援 员 耘造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽 责葬贼贼藻则灶 燥枣 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤
枣则燥皂 泽燥皂藻 贼藻泽贼蚤灶早 蚤泽燥造葬贼藻泽
摇 摇 酝院阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴 圆园园园曰员 原 远院匀园员源袁匀园员愿袁 蕴园源缘袁 蕴园远缘袁
蕴园猿员袁宰园园怨援
圆援 圆 杂砸粤孕引物筛选
利用琼脂糖凝胶电泳从 员园园 对引物组合中筛选
出能产生清晰扩增产物尧多态性较好的引物 缘源 对遥
通过 远豫非聚丙烯酰胺电泳从 缘源 对较好引物中筛
选出 员远 对条带清晰尧 多态性好且特异性强的引物袁
怨园源缘 期 刘志恒等院水稻茄丝核菌 杂砸粤孕引物筛选与体系优化
分别为 酝藻愿 辕 耘皂员尧酝藻圆 辕 耘皂员尧酝藻猿 辕 耘皂圆尧酝藻源 辕 耘皂缘尧
酝藻远 辕 耘皂圆尧 酝藻员 辕 耘皂猿尧 酝藻缘 辕 耘皂源尧 酝藻苑 辕 耘皂源尧 酝藻远 辕
耘皂苑尧 酝藻愿 辕 耘皂苑尧 酝藻怨 辕 耘皂苑尧 酝藻圆 辕 耘皂苑尧 酝藻愿 辕 耘皂员园尧
酝藻圆 辕 耘皂员园尧酝藻员 辕 耘皂怨尧酝藻愿 辕 耘皂怨遥
圆援 猿 杂砸粤孕反应体系中单因素优化
模板 阅晕粤 用量院在水稻茄丝核菌 杂砸粤孕 体系
中袁模板 阅晕粤 有一个较宽的浓度适宜范围袁浓度越
低扩增条带越少袁以至无条带曰浓度太高条带特异
性下降 遥模板阅晕粤用量在圆园 耀 员 远 园 灶早时较为适
宜渊图 圆冤遥
摇 摇 栽葬择 阅晕粤 聚合酶用量院栽葬择 阅晕粤 聚合酶浓度并
非越高越好袁增加酶浓度会降低 杂砸粤孕 专一性袁过高
浓度反而无扩增条带遥 水稻丝核菌 杂砸粤孕 适宜酶用
量为 园援 缘 耀 员援 园 哉遥
图 圆 模板 阅晕粤用量对引物为酝藻员 辕 耘皂猿 时 杂砸粤孕的影响
云蚤早援 圆 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 贼藻皂责造葬贼藻 阅晕粤 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥灶 杂砸粤孕 憎蚤贼澡 责则蚤皂藻则 酝藻员 辕 耘皂猿
摇 摇 酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴 圆园园园曰 葬院 匀园员源曰 遭院 匀园员愿曰 糟院 蕴园源缘曰 员 原 苑院 缘袁 员园袁 圆园袁 源园袁 愿园袁 员远园袁 圆缘园 灶早援
摇 摇 引物用量院不同引物浓度对水稻丝核菌 杂砸粤孕
扩增结果有影响遥 引物浓度加大袁条带多且清晰袁但
超出适宜浓度后扩增产物的特异性下降袁当引物浓
度为 园援 源 耀 园援 愿 滋皂燥造 辕 蕴时扩增效果较好遥
凿晕栽孕泽用量院当 凿晕栽孕泽 浓度加大时条带增多而
清晰袁超过 园援 愿 滋皂燥造 辕 蕴时反而无条带遥 在水稻茄丝
核菌 杂砸粤孕 扩增体系中添加 园援 员园 耀 园援 圆园 皂皂燥造 辕 蕴
凿晕栽孕泽即可遥
酝早圆 垣用量院酝早圆 垣浓度对扩增结果的影响明显袁
浓度低时袁条带少且弱曰随着 酝早圆 垣浓度增加袁条带的
丰度和亮度均有所提高渊图 猿冤遥 但 酝早圆 垣是酶的激
活剂袁浓度太高易产生非特异性扩增袁因而水稻
丝核菌杂砸粤孕扩增体系中酝早圆 垣的适宜浓度为员援 缘 耀
圆援 缘 皂皂燥造 辕 蕴遥
图 猿 酝早圆 垣用量对引物为酝藻源 辕 耘皂缘 时 杂砸粤孕的影响
云蚤早援 猿 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 酝早圆 垣 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥灶 杂砸粤孕 憎蚤贼澡 责则蚤皂藻则 酝藻源 辕 耘皂缘
摇 摇 酝院阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴 圆园园园曰 葬院 匀园员源曰 遭院匀园员愿曰 糟院蕴园源缘曰 员 原 苑院 园援 缘袁 员援 园尧 员援 缘袁 圆援 园袁 圆援 缘袁 猿援 缘袁 缘援 园 皂皂燥造 辕 蕴援
圆援 源 杂砸粤孕优化体系的确立和验证
苑个 杂砸粤孕扩增体系中 郧 组合电泳效果最好袁
因此 郧中各组分的用量为 杂砸粤孕扩增体系优化后的
用量遥 通过 圆 次退火温度的 圆缘 个组合比较得出第
员 次退火降低袁第 圆 次升高袁其扩增效果增加遥 第 员
次 猿源 益退火袁第 圆 次 缘愿 益退火袁扩增产物电泳条带
最多尧清晰遥 因此袁确立的 杂砸粤孕 优化体系包含 圆援 缘
皂皂燥造 辕 蕴 酝早圆 垣 尧园援 员缘 皂皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕泽尧园援 愿 滋皂燥造 辕 蕴 引
物尧员援 缘 哉 栽葬择 阅晕粤聚合酶和 愿园 灶早模板 阅晕粤遥 反应
程序为院怨缘 益预变性 缘 皂蚤灶曰 怨缘 益变性 员 皂蚤灶袁猿源 益复
园员源 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
性 源缘 泽袁苑圆 益延伸 员 皂蚤灶袁源 个循环曰怨缘 益变性 员 皂蚤灶袁
缘愿 益复性 员 皂蚤灶袁苑圆 益延伸 员 皂蚤灶袁猿源 个循环曰最后 苑圆
益延伸 员园 皂蚤灶袁源 益保存遥
用 圆源 个水稻茄丝核菌的 阅晕粤为模板验证该优
化体系袁扩增出的条带丰富清晰尧差异明显袁满足水
稻丝核菌的遗传差异研究渊图 源冤遥
图 源 优化的 杂砸粤孕体系对 圆源 个菌株的扩增
云蚤早援 源 栽澡藻 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 圆源 蚤泽燥造葬贼藻泽 憎蚤贼澡 燥责贼蚤皂蚤扎藻凿 杂砸粤孕 泽赠泽贼藻皂
摇 摇 酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴 圆园园园曰 员院 粤郧缘曰 圆院 粤郧源鄄匀郧域曰 猿院 粤郧远鄄匀郧玉曰 源院 粤郧愿曰 缘院 粤郧员鄄玉粤曰 远院 粤郧圆鄄郁曰 苑院 粤郧猿曰 愿院 粤郧怨曰 怨院 粤郧远鄄
匀郧吁曰 员园院 粤郧圆鄄玉曰 员员院 粤郧员鄄玉悦曰 员圆院 粤郧源鄄匀郧玉曰 员猿院 粤郧员鄄玉月曰 员源院 粤郧鄄月陨曰 员缘院 匀园园源曰 员远院 蕴园猿员曰 员苑院 蕴园源缘曰 员愿院 蕴园远缘曰 员怨院 蕴园愿苑曰
圆园院 匀园员源曰 圆员院 蕴园员源曰 圆圆院 宰园园怨曰 圆猿院 杂园员曰 圆源院 匀园员愿援
猿 讨论
杂砸粤孕是一种新型的分子标记技术袁弥补了
砸粤孕阅尧粤云蕴孕等常用的分子标记的不足遥 使用较高
的退火温度和较长的引物袁不但保证了扩增的稳定
性袁而且产物易测序袁进而可以提供更多的遗传信
息遥 目前 杂砸粤孕已广泛应用于蔬菜作物尧果树尧真菌
等的遗传多样性分析尧遗传图谱的构建尧重要性状的
标记以及相关基因的克隆等方面遥 但 杂砸粤孕 涉及到
一个多组分的 孕悦砸反应体系袁适宜反应体系的建立
对试验成功与否非常重要遥 在本试验中袁使用不同
厂家的 栽葬择酶即使在用量上有所调整也难以达到同
样的效果曰杂砸粤孕 虽对模板 阅晕粤 浓度的要求不高袁
但在 阅晕粤浓度过低时袁会出现某一泳道上没有条带
而其它泳道的条带丰富清晰的现象袁而加大浓度后
该现象即消失曰当 凿晕栽孕泽 浓度加大时条带增多而清
晰袁但超过 园援 愿 滋皂燥造 辕 蕴 时反而无条带遥 因此袁应用
杂砸粤孕技术时体系的优化是非常必要的遥
杂砸粤孕 体系优化的方法有单因素尧均匀和正交
设计等多种方法袁单一采用正交设计方法获得的
杂砸粤孕扩增体系不一定完全可靠袁结合 圆 种方法优
化出来的体系更能准确地揭示研究对象的信息遥 李
颖等咱员园暂 尧陈莉娉等咱员员暂认为正交设计和均匀设计 圆
种方法均可用于 杂砸粤孕 体系的优化袁但均匀设计得
到的条带更清晰尧稳定性更好遥 本试验利用单因素
设计和正交设计相结合的方法建立了满足水稻茄丝
员员源缘 期 刘志恒等院水稻茄丝核菌 杂砸粤孕引物筛选与体系优化
核菌遗传多样性研究的 杂砸粤孕 优化体系遥 而对于已
普遍应用于植物病原真菌的 陨杂杂砸而言袁单一采用正
交设计方法完全可以获得较好的分子检测
效果咱员圆 原 员猿暂 遥
杂砸粤孕 标记引物通用性强袁不需要预知物种的
序列信息就可应用遥 但不同研究对象的 杂砸粤孕 标记
对引物具有选择性袁如炭疽菌 杂砸粤孕 筛选出的适宜
引物咱员源暂不适用于水稻茄丝核菌的 杂砸粤孕 标记遥 另
外袁在试验过程中发现袁优化 杂砸粤孕 反应的退火温度
是决定试验成败的关键因素之一遥 降低 杂砸粤孕 第 员
次退火温度袁 提高第 圆 次退火温度袁有利于获得较
好的 杂砸粤孕 扩增效果遥 这与刘立军等咱员缘暂观点一致遥
但王学军等咱员远暂优化 缘 种温带果树 杂砸粤孕 退火温度
时发现 圆 次退火温度均提高的情况下 杂砸粤孕 效果较
好遥 这可能与引物及研究对象有关遥
目前袁杂砸粤孕标记已在植物遗传多样性检测尧遗
传图谱构建尧重要基因定位尧品种鉴定和种子纯度检
测上得到了广泛应用袁而在真菌界的应用相对较少遥
国内学者利用该技术对疫霉菌 孕澡赠贼燥责澡贼澡燥则葬 蚤灶枣藻泽鄄
贼葬灶泽咱员苑暂 尧炭疽菌 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽咱员源暂 尧锈
菌 孕怎糟糟蚤灶蚤葬 泽贼则蚤蚤枣燥则皂蚤泽咱员愿暂 尧紫杉内生真菌咱员怨暂等进行了
遗传多样性分析袁获得了理想的结果遥 杂怎灶 等咱圆园暂和
云藻则灶葬灶凿燥等咱圆员暂认为 杂砸粤孕 标记比 砸粤孕阅 标记稳定袁
且其多态性可与 粤云蕴孕 标记相媲美遥 云怎 等咱圆圆暂认为
在研究香菇多样性时 杂砸粤孕 比 陨杂杂砸 获得的信息更
全面遥 由于真菌基因组比植物的小袁扩增出来的条
带相对少些袁减少了统计工作量袁并降低了 杂砸粤孕 标
记的统计难度遥 因此袁杂砸粤孕 分子标记技术在真菌
的遗传研究中有着广阔的应用前景遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 李祥袁侯明生袁胡汉桥援 湖北省水稻纹枯病菌菌丝融合群鉴
定援 华中农业大学学报袁 员怨怨猿袁员圆渊员冤院 员源 原 员苑
咱圆暂 邹成佳袁唐芳袁杨媚袁等援 华南 猿 省渊区冤水稻纹枯病菌的生
物学性状与致病力分化研究援 中国水稻科学袁圆园员员袁圆缘渊圆冤院
圆园远 原 圆员圆
咱猿暂 肖勇袁刘明伟袁李刚袁等援 四川省水稻立枯丝核菌渊砸澡蚤扎燥糟贼燥鄄
灶蚤葬泽燥造葬灶蚤冤的遗传分化与致病力援中国水稻科学袁圆园园愿袁圆圆渊员冤院
愿苑 原 怨圆
咱源暂 杨根华袁董文汉袁李梅袁等援 云南省水稻纹枯病菌系研究援 菌
物系统袁圆园园圆袁圆员渊圆冤院 圆苑源 原 圆苑怨
咱缘暂 蒙姣荣袁张超冲袁李界秋袁等援 广西水稻纹枯病菌菌丝融合群
鉴定初报援 中国农学通报袁圆园园远袁圆圆渊远冤院 猿圆苑 原 猿圆怨
咱远暂 刘志恒袁韩翔宇袁杨红袁等援 辽宁省水稻纹枯病菌菌丝融合群
鉴定初报援 沈阳农业大学学报袁 圆园员园袁源员渊员冤院愿圆 原 愿缘
咱苑暂 蕴蚤 郧袁 匝怎蚤则燥泽 悦 云援 杂藻择怎藻灶糟藻鄄则藻造葬贼藻凿 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂
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猿园渊源冤院 员远猿缘 原 员远源愿
咱怨暂 王瑜袁袁庆华袁李向林袁等 援 与苜蓿褐斑病渊 悦蕴杂冤抗性基
因连锁的杂砸粤孕标记研究 援 中国农业科学袁圆园员园袁源猿渊圆 冤 院
源猿愿 原 源源圆
咱员园暂 李颖袁 金海林袁 金东淳袁 等援 苍耳 杂砸粤孕鄄孕悦砸 体系优化设
计方案比较援 延边大学农学学报袁 圆园员园 渊员冤院 员缘 原 圆员
咱员员暂 陈莉娉袁 张小平袁 李晓红援 青檀 杂砸粤孕鄄孕悦砸 体系优化设计
方案援 生物学杂志袁 圆园员圆袁 圆怨渊缘冤院 愿苑 原 怨员
咱员圆暂谷守芹袁范永山袁李坡袁等 援 玉米大斑病菌 陨杂杂砸反应体系
的优化和遗传多样性分析援植物保护学报袁圆园园愿袁猿缘渊缘冤院
源圆苑 原 源猿圆
咱员猿暂刘燕霞袁侯丽娟袁李卫袁等 援 棉花黄萎病菌 陨杂杂砸反应体系
优化及其遗传多样性分析援植物保护学报袁圆园员园袁猿苑渊缘冤院
源圆缘 原 源猿园
咱员源暂 李利霞袁赵奎华袁刘长远袁等援 葡萄炭疽病菌 杂砸粤孕 遗传多
样性分析援 中国农学通报袁圆园员圆袁圆愿渊员圆冤院圆猿园 原 圆猿缘
咱员缘暂 刘立军袁蒙祖庆袁邢秀龙袁等援 苎麻基因组 杂砸粤孕扩增体系
的优化研究援 分子植物育种袁 圆园园远袁 源渊缘冤院 苑圆远 原 苑猿园
咱员远暂王学军袁刘国俭 袁常瑞峰 袁等 援 缘种温带果树 杂砸粤孕 鄄孕悦砸
退火温度的优化援基因组学与应用生物学袁圆园园怨袁圆愿渊猿冤院
缘圆缘 原 缘圆愿
咱员苑暂 兰成忠袁李本金袁陈庆河袁等援 福建省致病疫霉菌 杂砸粤孕 遗
传多样性分析援 中国农学通报袁圆园员员袁圆苑渊怨冤院 猿怨缘 原 猿怨怨
咱员愿暂 孕葬泽择怎葬造蚤 酝袁 运燥皂躁葬贼蚤 匀袁 蕴藻藻 阅袁 藻贼 葬造援 杂砸粤孕 贼藻糟澡灶蚤择怎藻 藻枣枣蚤鄄
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咱圆圆暂 云怎 蕴 在袁 在澡葬灶早 匀 再袁 宰怎 载 匝袁 藻贼 葬造援 耘增葬造怎葬贼蚤燥灶 燥枣 早藻灶藻贼蚤糟 凿蚤鄄
增藻则泽蚤贼赠 蚤灶 蕴藻灶贼蚤灶怎造葬 藻凿燥凿藻泽 泽贼则葬蚤灶泽 怎泽蚤灶早 砸粤孕阅袁 陨杂杂砸 葬灶凿
杂砸粤孕 皂葬则噪藻则泽援 宰燥则造凿 允燥怎则灶葬造 燥枣 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠 葬灶凿 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造鄄
燥早赠袁 圆园员园袁 圆远渊源冤院 苑园怨 原 苑员远
渊责任编辑院高峰冤
圆员源 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷