全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ ２０１５ꎬ ４２(５): ７９５ － ８００ ＤＯＩ: １０􀆰 １３８０２ / ｊ. ｃｎｋｉ. ｚｗｂｈｘｂ. ２０１５􀆰 ０５􀆰 ０１４
基金项目:国家质检总局科研项目(２０１４ＩＫ０２０)ꎬ浙江省博士后择优资助项目(ＢＳＨ１４０２０１１)ꎬ宁波市社会发展科研项目(２０１４Ｃ５００８２)
∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ)ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｅｉｊｕｎｄｕａｎ＠ ｔｏｍ. ｃｏｍꎬ Ｔｅｌ: ０５７４ － ８７０２２９５１
收稿日期: ２０１４ － ０８ － １５
进境哈萨克斯坦向日葵种子中向日葵黑茎病菌的鉴定
段维军１ꎬ２∗　 李　 兰３ 　 莫善明３ 　 段丽君１ 　 蔡　 磊２
(１.宁波检验检疫科学技术研究院ꎬ 浙江 宁波 ３１５０１２ꎻ ２.中国科学院微生物研究所ꎬ 北京 １００１０１ꎻ
３.阿拉山口出入境检验检疫局ꎬ 新疆 阿拉山口 ８３３４１８)
摘要: 自进境哈萨克斯坦向日葵种子中ꎬ采用常规平板分离法获得 １ 株疑似向日葵黑茎病菌
Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ菌株 ＬＬ４ꎬ通过生物学性状、ＩＴＳ序列测定和比对分析及致病性测定等方法对
其进行了鉴定ꎮ 结果表明ꎬ该病菌在 ＰＤＡ平板上培养初期菌丝无色ꎬ分隔分枝多ꎬ后期菌丝褐色或
深褐色ꎬ常膨大ꎻ分生孢子器暗褐色ꎬ分散或聚集ꎬ球形、近球形或不规则形ꎬ大小为 ７１􀆰 ２ ~ ３６１􀆰 ８
μｍꎻ分生孢子形态变化较大ꎬ无色ꎬ单孢ꎬ肾形至椭圆形ꎬ大小为 ３􀆰 ６ ~ ８􀆰 ２ μｍ ×２􀆰 ２ ~ ３􀆰 ７ μｍꎬ常含
有 ２ 个油球ꎻ培养期间未见有性阶段ꎮ 基于 ＩＴＳ序列分析比对发现ꎬ菌株 ＬＬ４ 与 ＧｅｎＢａｎｋ中多个向
日葵黑茎病菌分离物序列同源性达 ９９％以上ꎬ系统进化树显示其与其它向日葵黑茎病菌分离物聚
在同一个分支ꎮ 菌株 ＬＬ４ 可侵染向日葵根茎部ꎬ造成典型黑茎病症状ꎮ 表明分离获得的菌株 ＬＬ４
为向日葵黑茎病菌 Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉꎮ
关键词: 向日葵黑茎病菌ꎻ 形态学特征ꎻ 序列分析ꎻ 致病性测定ꎻ 检测鉴定
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄｓ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｋａｚａｋｈｓｔａｎ
Ｄｕａｎ Ｗｅｉｊｕｎ１ꎬ２∗ 　 Ｌｉ Ｌａｎ３ 　 Ｍｏ Ｓｈａｎｍｉｎｇ３ 　 Ｄｕａｎ Ｌｉｊｕｎ１ 　 Ｃａｉ Ｌｅｉ２
(１. Ｎｉｎｇｂｏ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅꎬ Ｎｉｎｇｂｏ ３１５０１２ꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３. Ａｌａｔａｗ Ｅｎｔｒｙ￣ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ａｌａｔａｗ ８３３４１８ꎬ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｙｇｕｒ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｓｔｒａｉｎ ＬＬ４ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄｓ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｋａｚａｋｈｓｔａｎ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ
ＰＤＡ ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ. Ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｓｔｒａｉｎ ＬＬ４ꎬ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｉｔｓꎬ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＬＬ４ ｇｒｅｗ ｗｅｌｌ ｏｎ ＰＤＡ ｍｅｄｉｕｍꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｗａｓ
ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ａｔ ｅａｒｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｔａｇｅ ｗｉｔｈ ｓｅｐａｒａｔｅ ｂｒａｎｃｈｅｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｕｒｎｅｄ ｂｒｏｗｎ ｏｒ ｄａｒｋ ｂｒｏｗｎ ａｔ ｌａｔｅ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｔａｇｅꎬ ｏｆｔｅｎ ｉｎｆｌａｔｅｄ. Ｔｈｅ ｐｙｃｎｉｄｉａ ｗｅｒｅ ｄａｒｋ ｂｒｏｗｎꎬ ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｏｒ ａｇｇｒｅｇａｔｅｄꎬ ｓｐｈｅｒｉｃａｌꎬ ｎｅａｒｌｙ
ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｏｒ ｉｒｒｅｇｕｌａｒ ｉｎ ｓｈａｐｅꎬ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｚｅ ｏｆ ７１􀆰 ２ － ３６１􀆰 ８ μｍꎻ ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａ ｆｏｒｍ ｖａｒｉｅｄ ｗｉｄｅｌｙꎬ
ｃｏｌｏｒｌｅｓｓꎬ ｓｉｎｇｌｅ￣ｓｐｏｒｅｄꎬ ｋｉｄｎｅｙ￣ｓｈａｐｅｄ ｏｒ ｏｖａｌꎬ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｚｅ ｏｆ ３􀆰 ６ － ８􀆰 ２ μｍ × ２􀆰 ２ － ３􀆰 ７ μｍꎬ ｗｈｉｃｈ
ｏｆｔｅｎ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｗｏ ｏｉｌ ｂａｌｌｓꎻ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｅｘｕａｌ ｓｔａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｅｒｉｏｄ. Ｔｈｅ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ
ＬＬ４ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅꎬ ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｈａｒｅｄ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ９９％
ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ ( Ｆｒｅｚｚｉ) ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ. Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＬＬ４ ｇａｔｈｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ ａ ｂｒａｎｃｈ. Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＬＬ４ ｃｏｕｌｄ
ｉｎｆｅｃｔ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｔｅｍꎬ ｆｏｒｍｅｄ ｔｙｐｉｃａｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｂｌａｃｋ ｓｔｅｍ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓꎬ
ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓꎬ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＬＬ４ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉꎻ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓꎻ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎻ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙꎻ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　 　 向日葵是全球 ４ 大油料作物之一ꎬ在我国油料
作物中向日葵的种植面积仅次于大豆和油菜ꎬ且近
年来呈逐年增大的趋势ꎬ向日葵病害也随之日益严
重(宋娜等ꎬ２０１２ꎻ卜浩宇等ꎬ２０１４)ꎮ 向日葵黑茎病
于 ２０ 世纪 ５０ 年代被首次发现(Ｓａｃｋｓｔｏｎꎬ１９９２)ꎬ至
７０—８０ 年代相继扩展到欧美地区 ( Ｍｉｒｉｃ ｅｔ ａｌ. ꎬ
１９９９ꎻＢｏｅｒｅｍａ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００４)ꎬ目前在世界多个向日葵
生产国家和地区均有发生(Ｒｏｕｓｔａｅｅ ｅｔ ａｌ. ꎬ２０００ꎻ
Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ. ꎬ２０１１ꎻｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ. ꎬ２０１２)ꎬ我国新疆
等地也有发生危害的报道(张祥林等ꎬ２０１１ꎻＷｕ ｅｔ
ａｌ. ꎬ２０１２)ꎮ 向日葵黑茎病导致向日葵籽小、空、瘪ꎬ
种子产量和产油量严重降低ꎻ发病早者致植株枯死ꎬ
发病晚者可致植株矮化、瘦弱甚至倒伏ꎬ在重病田发
病率达 １００％ ꎬ死亡率达 ５０％以上(陈卫民等ꎬ２００８ꎻ
魏良民ꎬ２００８)ꎮ 鉴于其严重危害性ꎬ２０１０ 年 １０ 月
农业部和国家质量监督检验检疫总局联合发布了第
１４７２ 号公告ꎬ将向日葵黑茎病列入«中华人民共和
国进境植物检疫性有害生物名录»ꎮ
向日葵黑茎病菌 Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ (Ｆｒｅｚｚｉ)
于 １９６４ 年首次被分离和鉴定(ＭｃＤｏｎａｌｄꎬ１９６４)ꎬ其
无性阶段为 Ｐｈｏｍａ ｍａｃｄｏｎａｌｄｉｉ Ｂｏｅｒｅｍａꎬ是一种土
壤习居菌ꎬ能够在侵染残存组织上以菌丝体、假囊壳
和分生孢子器等形态越冬并侵染向日葵(Ｇｕｌｙａ ｅｔ
ａｌ. ꎬ１９９７ꎻＳｅａｓｓａｕ ｅｔ ａｌ. ꎬ２０１０)ꎮ 目前ꎬ生产上尚未
见抗黑茎病的向日葵品种面世 ( Ｑｕｉｒｏｚ ｅｔ ａｌ. ꎬ
２０１４)ꎬ化学防治等传统方法难以进行有效防治ꎬ因
此开展口岸检疫鉴定工作对于有效防范该病菌传人
和扩散危害具有重大意义ꎮ
对于向日葵黑茎病菌的检测和鉴定ꎬ单纯依靠
形态学方法进行鉴定存在一定困难ꎮ 茎点霉属
Ｐｈｏｍａ已报道的种类超过 ３ ０００ 种ꎬ大部分种类是
腐生或非专性寄生菌(Ｃｒｏｕｓ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００４)ꎮ 其外部
形态十分相像ꎬ主要根据其在寄主以及活体培养时
分生孢子器、分生孢子以及菌落形态的不同进行区
分ꎬ但这些特征受外部环境影响很大ꎬ存在较大变异
性(Ｍｉｒｉｃ ｅｔ ａｌ. ꎬ１９９９ꎻＢｏｅｒｅｍａ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００４)ꎮ 且该
属真菌能够产生多种类型孢子ꎬ容易与近似种类相
混淆ꎬ利用 ＤＮＡ分子序列分析进行该属种类鉴定具
有一定优越性ꎬ但关键是获得合适的能够有效区分
不同种类的分子标记ꎮ 研究表明ꎬ采用 ＩＴＳ 序列能
够有效区分向日葵黑茎病菌(Ｍｉｒｉｃ ｅｔ ａｌ. ꎬ１９９９ꎻＬｕｏ
ｅｔ ａｌ. ꎬ２０１１)ꎬ且 ＩＴＳ序列中多个位点的差异也为建
立在此基础上的向日葵黑茎病菌快速检测方法提供
了可能(张祥林等ꎬ２０１１ꎻ宋娜等ꎬ２０１２)ꎮ ２０１４ 年 ６
月ꎬ本课题组自进境哈萨克斯坦向日葵种子上分离
培养获得了 １ 株疑似向日葵黑茎病菌菌株 ＬＬ４ꎬ对
其进行了生物学性状研究、ＩＴＳ 序列测定分析和致
病性测定ꎬ以期准确鉴定该菌株ꎬ为口岸检疫、疫情
防控及后续相关研究工作提供参考依据ꎮ
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株及向日葵:采用常规平板分离法从进
境哈萨克斯坦向日葵种子上分离获得 １ 株疑似向日
葵黑茎病菌分离物ꎬ进行单孢分离后得到分离株
ＬＬ４ꎬ４℃下保存在 ＰＤＡ斜面备用ꎮ 选用市售向日葵
种子进行接种试验ꎮ
培养基:马铃薯葡萄糖琼脂 ( ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ
ａｇａｒꎬＰＤＡ)培养基:马铃薯 ２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ、琼脂
２０ ｇ、水 １ ０００ ｍＬꎬ１２１℃下灭菌 １５ ｍｉｎꎮ
试剂:Ｌａｂｓｅｒｖ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｋｉｔ 核酸提取试剂盒ꎬ
美国 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ 公司ꎻＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶、ＭｇＣｌ２、
１０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ、ＤＮＡ片段纯化试剂
盒ꎬ宝生物工程(大连)有限公司ꎻ其它试剂均为分
析纯ꎻ引物均由上海英俊生物技术有限公司合成ꎮ
仪器: ＢＸ￣５１ 显微镜ꎬ奥林巴斯有限公司ꎻ
Ｉｍａｇｅｒ Ｚ１ 显微镜数码成像系统、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ１２ 解剖
镜及其成像系统ꎬ德国 ＺＥＩＳＳ公司ꎻＦｒｉｏｃｅｌｌ ２２２ 培养
箱ꎬ德国 ＭＭＭ 公司ꎻＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ 核酸自动化提取仪、
Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ 生物分光光度计ꎬ美
国 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ 公司ꎻＴＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｂａｓｉｃ ＰＣＲ 仪ꎬ
德国 Ｂｉｏｍｅｔｒａ 公司ꎻＰｏｗｅｒＰａｃ Ｂａｓｉｃ 电泳设备、Ｇｅｌ￣
ＤｏｃＥＱ型凝胶成像系统ꎬ美国伯乐生命医学产品有
限公司ꎮ
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 菌株 ＬＬ４ 的生物学性状观察
将供试菌株 ＬＬ４ 接种于 ＰＤＡ 平板上ꎬ在 ２５℃
条件下连续暗培养 ７ ｄ 后ꎬ观察记录菌落正反面的
颜色和气生菌丝的疏密程度ꎮ 再用黑光灯 １２ ｈ /黑
暗 １２ ｈ交替培养 ７ ｄ后ꎬ用解剖针自 ＰＤＡ平板上挑
取供试菌ꎬ置于加有水滴的玻片上ꎬ盖上盖玻片后ꎬ
在显微镜下观察分生孢子器、分生孢子的形态特征ꎬ
６９７ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
并利用显微数码测量系统进行测量并记录ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２ 菌株 ＬＬ４ 的 ＤＮＡ提取及 ＩＴＳ序列测定
用灭菌枪头刮取 ＰＤＡ 平板上培养 ７ ｄ 的菌株
ＬＬ４ 菌丝体ꎬ根据 Ｌａｂｓｅｒｖ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｋｉｔ核酸提取试
剂盒使用说明书ꎬ在核酸自动化提取仪上进行 ＤＮＡ
提取ꎮ 提取后 ＤＮＡ 经分光光度计检测 ＤＮＡ 浓度
后ꎬ冻存于 － ２０℃ 冰箱备用ꎮ 采用 Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ.
(１９９０)设计的引物 ＩＴＳ１ 和 ＩＴＳ４ 进行 ＩＴＳ 片段扩
增ꎮ 反应程序为:９５℃ ３ ｍｉｎꎻ９５℃ ４０ ｓꎬ５３℃ ４０ ｓꎬ
７２℃ ６０ ｓꎬ３５ 个循环ꎻ７２℃ １０ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ 扩增产物
经 ２％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ确认扩增成功后ꎬ使用
凝胶成像系统进行拍照ꎬ根据 ＤＮＡ片段纯化试剂盒
说明书进行纯化ꎮ 纯化产物送上海英俊生物技术有
限公司进行双向测序ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３ 菌株 ＬＬ４ 的 ＩＴＳ序列比对分析
利用 ＮＣＢＩ网站上的 ＢＬＡＳＴ 程序对测得的 ＩＴＳ
序列进行比对分析ꎬ确认序列的可靠性ꎮ 将测得的
序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中下载的向日葵黑茎病菌及其近
似种的 ＩＴＳ 序列用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ 程序进行分析ꎬ使用
Ｍｅｇａ ５􀆰 ０ 程序进行比对ꎬ以 ＧｅｎＢａｎｋ 上下载的草茎
点霉 Ｐｈｏｍａ ｈｅｒｂａｒｕｍ 的 ＩＴＳ 序列 ( ＡＹ２９３７９１ 和
ＪＱ７５４７０７)为外群ꎬ采用邻接法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇꎬＮ￣
Ｊ)构建系统进化发育树ꎬ进行 １ ０００ 次重抽样计算
系统树中节点的置信度ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４ 菌株 ＬＬ４ 的致病性测定
选用成熟饱满的向日葵种子ꎬ均匀种植于灭菌
后土壤中ꎬ室温下培养ꎬ直径为 ３０ ｃｍ的花盆每盆种
植 ５ 粒种子ꎬ幼苗长出后每盆保留 ２ 株幼苗ꎮ 在苗
龄 ２ 周的向日葵根茎部用灭菌锋利小刀切割表皮
后ꎬ将在 ＰＤＡ平板上培养 １０ ｄ 的菌落用直径 ４ ｍｍ
打孔器在菌落边缘打出菌饼后ꎬ小心放置在切割处ꎬ
用蘸有无菌水的湿润灭菌脱脂棉覆盖伤口ꎬ接种 ６
株ꎬ置于温室 ２５℃条件下进行培养ꎬ并逐日观察记
录发病情况ꎮ 以未接种菌饼 ＰＤＡ 作为对照ꎬ每处理
３ 次重复ꎮ
２ 结果与分析
２􀆰 １ 菌株 ＬＬ４ 的菌落性状及形态特征
在 ２５℃下ꎬ菌株 ＬＬ４ 在 ＰＤＡ 平板上生长 ７ ｄ
后ꎬ菌落直径可达 ６􀆰 ３ ｃｍꎻ气生菌丝棉絮状ꎬ灰白
色ꎬ多丛生于培养基中央ꎬ边缘气生菌丝稀疏少见ꎮ
培养基正面菌落浅灰白色或橄榄色ꎬ培养后期为黑
褐色ꎬ培养基反面橄榄色(图 １)ꎮ 显微镜检发现菌
株 ＬＬ４ 菌丝膨大现象明显(图 ２￣ａ)ꎮ 培养 １ 周后产
生黑色或深褐色分生孢子器(图 ２￣ｂ、ｃ)ꎬ半埋生ꎬ分
散或聚生ꎬ球形或扁球形ꎬ具乳头状突起ꎬ直径大小
为 ７１􀆰 ２ ~ ３６１􀆰 ８ μｍꎬ挤压后释放大量分生孢子ꎮ 分
生孢子无色ꎬ形态差异大ꎬ单孢ꎬ肾形至椭圆形ꎬ两端
有油球ꎬ大小为 ３􀆰 ６ ~ ８􀆰 ２ μｍ × ２􀆰 ２ ~ ３􀆰 ７ μｍ(图 ２￣
ｄ)ꎮ 菌株 ＬＬ４ 的菌落性状和显微形态特征与向日
葵黑茎病菌 Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ相符ꎬ可初步鉴定
其为向日葵黑茎病菌ꎮ
图 １ 供试菌株 ＬＬ４ 正反面宏观形态特征图
Ｆｉｇ. １ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ
ＬＬ４ ｏｎ ＰＤＡ ｐｌａｔｅ
　
图 ２ 菌株 ＬＬ４ 的微观形态图
Ｆｉｇ. ２ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＬＬ４
ａ: 膨大菌丝ꎻ ｂ ~ ｃ: 分生孢子器ꎻ ｄ: 分生孢子ꎮ ａ:
Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｏｌｌｅｎ ａｅｒｉａｌ ｍｙｃｅｌｉａꎻ ｂ － ｃ: ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ
ｃｏｎｉｄｉａꎻ ｄ: ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｃｎｉｄｉａ.
　
２􀆰 ２ 菌株 ＬＬ４ 的 ＩＴＳ序列分析
菌丝 ＤＮＡ用真菌通用引物 ＩＴＳ１ / ＩＴＳ４ 扩增后获
得的片段长度约为 ５８１ ｂｐꎬ所获得序列在 ＧｅｎＢａｎｋ中
通过 ＢＬＡＳＴ 比对分析表明ꎬ与登录号为 ＪＮ２２７０８７、
ＨＭ００３２０６、ＨＱ７００３１３、ＡＢ６９０４６３ 和 ＪＱ９７９４８８ 等向日
葵黑茎病菌分离物的 ＩＴＳ 序列同源性达 ９９％以上ꎮ
系统发育分析结果显示ꎬ供试菌株 ＬＬ４ 的 ＩＴＳ 序列
与 ＧｅｎＢａｎｋ中下载的向日葵黑茎病菌 ＩＴＳ序列聚在
７９７５ 期 段维军等: 进境哈萨克斯坦向日葵种子中向日葵黑茎病菌的鉴定
同一个分支(ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值为 １００ꎬ图 ３)ꎮ 从分子水平
进一步证明疑似菌株 ＬＬ４ 为向日葵黑茎病菌 Ｐ.
ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉꎮ
图 ３ 基于向日葵黑茎病菌 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列采用邻接法构建的系统进化树
Ｆｉｇ. ３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ (ＮＪ) ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｓｏａｌ ＩＴＳ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＩＴＳ１ꎬ
５􀆰 ８Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ＩＴＳ２ ｏｆ Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ　
２􀆰 ３ 菌株 ＬＬ４ 的致病性测定
在 ６ 株健康向日葵幼苗上接种 ７ ｄ 后ꎬ供试向
日葵根茎部均出现典型黑茎病症状ꎬ伤口黑色ꎬ迅速
向茎秆扩展ꎬ形成黑色病斑ꎮ 未接种菌饼的对照未
发现上述症状ꎮ 致病性测定中接种植株表现出的症
状与向日葵黑茎病症状相同ꎬ病菌再分离培养产生
的菌落性状及病原菌形态特征与向日葵黑茎病菌
一致ꎮ
３ 讨论
向日葵黑茎病菌易受 ｐＨ 值、温度等多种环境
因素影响发生形态变异(Ｒｏｕｓｔａｅｅ ｅｔ ａｌ. ꎬ２０００)ꎬ这
对于单纯依赖形态特征进行向日葵黑茎病菌的准确
鉴定带来了一定困难ꎮ 目前ꎬ真菌 ＩＴＳ 片段已被广
泛用于构建系统发育树、评估种群进化过程以及确
定物种分类地位等(Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００６ꎻＰａｎｎｅｃｏｕｃｑｕｅ
＆ Ｈöｆｔｅꎬ２００９ꎻ段维军等ꎬ２０１３)ꎬ也已被推荐作为真
菌的 ＤＮＡ 条形码(Ｓｃｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ. ꎬ２０１２)ꎮ 在形态学
鉴定基础上ꎬ结合合适的分子标记序列测定分析和
致病性测定ꎬ能够应用于口岸检疫性真菌的截获鉴
定工作中(段维军等ꎬ２０１４ａꎻｂ)ꎮ 本研究采用形态
学特征结合 ＩＴＳ 序列分析和致病性测定的方法ꎬ鉴
定了来自进境哈萨克斯坦向日葵种子上的疑似向日
葵黑茎病菌菌株 ＬＬ４ꎬ该菌能够产生膨大的气生菌
丝ꎬ具球形或近球形的分生孢子器ꎬ内生大量具两端
油球的形态变化较大的分生孢子ꎻ该菌株与 Ｇｅｎ￣
Ｂａｎｋ中多株向日葵黑茎病菌分离物 ＩＴＳ 序列聚在
一个分支上ꎬ且致病性测定结果表明该菌株能够侵
染向日葵茎秆ꎬ形成黑色病斑ꎬ以上结果均表明自进
８９７ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
境哈萨克斯坦向日葵种子中所截获的疑似病菌为向
日葵黑茎病菌 Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉꎮ
现有检疫性真菌检测过程中ꎬ分离培养是一个
重要环节ꎮ 尽管目前已有一些关于向日葵黑茎病菌
快速检测技术的报道ꎬ如张祥林等(２０１１)利用向日
葵黑茎病菌 ＩＴＳ区的 ＰＣＲ￣ＲＦＬＰ分析技术进行该病
菌的种类鉴定ꎻ张伟宏等(２０１３)报道了能够同时区
分向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重
ＰＣＲ扩增方法ꎻ宋娜等(２０１２)针对向日葵黑茎病菌
ＩＴＳ区一致性较高的特点ꎬ在其 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 的多态性
丰富区域设计了一对特异性引物 ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＥＶꎬ
建立了该病菌的快速分子检测方法ꎮ 但是这些技术
和方法如果不能和分离培养相结合ꎬ往往难以准确
鉴定并检测出向日葵黑茎病菌ꎮ 本研究曾经尝试使
用 ＰＣＲ方法初筛获得可疑样品后再进行分离培养
以获得向日葵黑茎病菌ꎬ但是初筛条带普遍较弱ꎬ难
以准确判断是否有可疑样品ꎬ这可能与普通 ＰＣＲ 检
测灵敏度较低有关ꎮ 因此对于分离培养工作应该引
起足够重视ꎬ切实做到有效分离ꎬ在此基础上对可疑
菌株进行进一步的鉴定ꎮ 在病菌分离培养过程中ꎬ
由于向日葵种子混杂各种茎秆、花盘、叶片等多种杂
质ꎬ分离培养时极易生长多种杂菌ꎬ如向日葵菌核病
菌 Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、富克葡萄孢盘菌 Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎ￣
ｉａ ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ、镰刀菌属 Ｆｕｓａｒｉｕｍ、根霉属 Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、
青霉属 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、链格孢属 Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ菌株等ꎬ且这
些病菌普遍生长速度较快ꎬ造成待分离致病菌难以
获得ꎬ可在分离时适当延长灭菌时间以提高分离成
功率ꎮ
向日葵黑茎病菌可通过田间昆虫活动等进行短
距离传播ꎬ然而其长距离传播多通过受侵染寄主组
织传播ꎬ例如向日葵种子ꎮ Ｓｔａｊｉｃ′ ｅｔ ａｌ. (２００１)自受
侵染向日葵种皮部观察到了向日葵黑茎病菌分生孢
子器ꎻ轩娅萍等(２０１１)研究证实向日葵黑茎病菌可
以通过侵染造成种子带菌ꎬ感染部位包括种壳、种皮
及胚乳ꎻＭｉｒｉｃ ｅｔ ａｌ. (１９９９)发现在澳大利亚ꎬ向日葵
黑茎病的发生发展与受侵染向日葵种子具有很大关
系ꎻ我国自 ２００５ 年以来向日葵黑茎病在新疆伊犁河
谷 ５ 县 １ 市普遍发生ꎬ危害严重ꎬ且为从国外引种带
病向日葵种子所致(陈卫民等ꎬ２００８)ꎬ有报道发现
从进境阿根廷和法国向日葵种子中检出了向日葵黑
茎病菌(Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ. ꎬ２０１１ꎻ罗加凤等ꎬ２０１２)ꎮ 上述研
究均表明ꎬ该病可以侵染种子造成种子带菌ꎬ并成为
该病传播扩散的重要途径ꎮ 本研究中所截获菌株的
鉴定结果表明ꎬ从哈萨克斯坦进口向日葵种子具有
很大风险ꎬ今后应继续加强对该类进境植物产品上
检疫性有害生物的检测工作ꎬ防范其进一步扩散和
危害ꎮ
参 考 文 献 (Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ)
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ｓｐｈａｅｒｉａ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ ａｎｄ Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｈｅｌｉａｎｔｈｉ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ￣
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(责任编辑:李美娟)
００８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷