全 文 ：马铃薯甲虫热激蛋白基因 蕴凿鄄澡泽责怨园的克隆
及温度胁迫下的表达
蒋摇 健 员袁 圆 摇 李祥瑞员 摇 张云慧员 摇 郭文超猿 摇 程登发员鄢摇 郭青云圆鄢
渊员援中国农业科学院植物保护研究所袁 植物病虫害生物学国家重点实验室袁 北京 员园园员怨猿曰 圆援青海省农林科学院
植物保护研究所袁 西宁 愿员园园员远曰 猿援新疆农业科学院植物保护研究所袁 乌鲁木齐 愿猿园园怨员冤
摘要院 马铃薯甲虫 蕴藻责贼蚤灶燥贼葬则泽葬 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬是一种抗逆性极强的世界性检疫害虫袁对温度胁迫具有
很强的适应性袁为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子生态机制袁采用 砸栽鄄孕悦砸 及 砸粤悦耘 技术克
隆得到了 员 个 澡泽责怨园 基因的 糟阅晕粤全长序列袁命名为 蕴凿鄄澡泽责怨园袁并利用实时荧光定量 孕悦砸技术检测
其在温度胁迫后相对表达量的变化遥 蕴凿鄄澡泽责怨园 全长为 圆 源愿怨 遭责袁开放阅读框渊韵砸云冤长度为 圆 员远园 遭责袁
编码 苑员怨 个氨基酸袁理论等电点为 源援 怨愿袁分子量约为 愿圆援 园怨 噪阅袁缘忆端与 猿忆端非编码区长度分别为
员员猿 遭责和 圆员远 遭责遥 氨基酸序列中含有 匀杂孕怨园 家族的 缘 个签名序列及胞质特征序列 酝耘耘灾阅遥 实时
荧光定量 孕悦砸检测结果显示院猿愿益和 源源益高温热激 员 澡袁马铃薯甲虫成虫体内的 蕴凿鄄澡泽责怨园 的表达量
均显著高于对照组袁而 园 益与 原 员园 益低温处理 员 澡 后的表达量与对照组均无显著差异遥 研究表明
蕴凿鄄澡泽责怨园 的上调表达在马铃薯甲虫抗高温中起着重要的作用遥
关键词院 马铃薯甲虫曰 热激蛋白 怨园曰 基因克隆曰 生物信息学分析曰 实时荧光定量 孕悦砸
糟阅晕粤 糟造燥灶蚤灶早 燥枣 澡藻葬贼 泽澡燥糟噪 责则燥贼藻蚤灶 怨园 渊蕴凿鄄澡泽责怨园冤 蚤灶 蕴藻责贼蚤灶燥贼葬则泽葬
凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬 渊悦燥造藻燥责贼藻则葬院 悦澡则赠泽燥皂藻造蚤凿葬藻冤 葬灶凿 蚤贼泽
藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 怎灶凿藻则 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 泽贼则藻泽泽
允蚤葬灶早 允蚤葬灶员袁 圆 摇 蕴蚤 载蚤葬灶早则怎蚤员 摇 在澡葬灶早 再怎灶澡怎蚤员 摇 郧怎燥 宰藻灶糟澡葬燥猿 摇 悦澡藻灶早 阅藻灶早枣葬员鄢摇 郧怎燥 匝蚤灶早赠怎灶圆鄢
渊员援 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 杂贼葬贼藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 枣燥则 月蚤燥造燥早赠 燥枣
孕造葬灶贼 阅蚤泽藻葬泽藻泽 葬灶凿 陨灶泽藻糟贼 孕藻泽贼泽袁 月藻蚤躁蚤灶早 员园园员怨猿袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 匝蚤灶早澡葬蚤
粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻 葬灶凿 云燥则藻泽贼则赠 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 载蚤灶蚤灶早 愿员园园员远袁 匝蚤灶早澡葬蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰
猿援 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 载蚤灶躁蚤葬灶早 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁
哉则怎皂择蚤 愿猿园园怨员袁 载蚤灶躁蚤葬灶早 哉赠早怎则 粤怎贼燥灶燥皂燥怎泽 砸藻早蚤燥灶袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 粤泽 燥灶藻 燥枣 贼澡藻 蚤灶贼藻则灶葬贼蚤燥灶葬造 皂葬躁燥则 择怎葬则葬灶贼蚤灶藻 责藻泽贼泽袁 贼澡藻 悦燥造燥则葬凿燥 责燥贼葬贼燥 遭藻藻贼造藻袁 蕴藻责贼蚤灶燥贼葬则泽葬
凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬袁 澡葬泽 泽贼则燥灶早 泽贼则藻泽泽 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻袁 藻泽责藻糟蚤葬造造赠 贼燥 贼澡藻 藻曾贼则藻皂藻 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 泽贼则藻泽泽援 栽澡藻 责葬责藻则 蚤泽
葬蚤皂藻凿 贼燥 遭藻贼贼藻则 怎灶凿藻则泽贼葬灶凿 贼澡藻 皂燥造藻糟怎造葬则 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 燥枣 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 泽贼则藻泽泽 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 蚤灶 蕴援 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬援
粤 枣怎造造鄄造藻灶早贼澡 糟阅晕粤 藻灶糟燥凿蚤灶早 贼澡藻 匀杂孕怨园 枣则燥皂 蕴援 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬 憎葬泽 糟造燥灶藻凿 怎泽蚤灶早 砸栽鄄孕悦砸 葬灶凿 砸粤悦耘 贼藻糟澡鄄
灶蚤择怎藻援 栽澡蚤泽 糟阅晕粤 憎葬泽 灶葬皂藻凿 葬泽 蕴凿鄄澡泽责怨园袁 葬灶凿 蚤贼泽 则藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造泽 蚤灶 蕴援 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬 葬凿怎造贼泽
怎灶凿藻则 葬 泽藻则蚤藻泽 燥枣 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻泽 憎藻则藻 凿藻贼藻糟贼藻凿 遭赠 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸援 栽澡藻 糟燥皂责造藻贼藻 糟阅晕粤 渊圆源愿怨 遭责冤 憎葬泽 糟燥皂鄄
责则蚤泽藻凿 燥枣 葬 员员猿 遭责 缘忆鄄怎灶贼则葬灶泽造葬贼藻凿 则藻早蚤燥灶 渊哉栽砸冤袁 葬 圆员远 遭责 猿忆鄄哉栽砸袁 葬灶凿 葬 圆 员远园 遭责 燥责藻灶 则藻葬凿蚤灶早 枣则葬皂藻
渊韵砸云冤援 栽澡藻 韵砸云 燥枣 蕴凿鄄澡泽责怨园 藻灶糟燥凿藻凿 葬 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 苑员怨 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿泽袁 憎蚤贼澡 葬 贼澡藻燥则藻贼蚤糟葬造 蚤泽燥藻造藻糟贼则蚤糟 责燥蚤灶贼
基金项目院 公益性行业渊农业冤科研专项渊圆园员员园猿园圆远鄄圆冤
作者简介院 蒋健袁男袁员怨愿愿年生袁硕士研究生袁研究方向为昆虫分子生物学袁 耘鄄皂葬蚤造院 躁蚤葬灶早躁蚤葬灶圆缘源岳 员远猿援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则泽 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 凿枣糟澡藻灶早岳 蚤责责糟葬葬泽援 糟灶袁 早怎燥择蚤灶早赠怎灶择澡岳 员远猿援 糟燥皂
收稿日期院 圆园员猿 原 园猿 原 圆圆
第 源园 卷摇 第 缘 期
圆园员猿 年摇 员园 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源园摇 晕燥援 缘
韵糟贼援 摇 圆园员猿
摇 摇 燥枣 源援 怨愿 葬灶凿 皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 燥枣 愿圆援 园怨 噪阅援 栽澡藻 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻 糟燥灶贼葬蚤灶藻凿 枣蚤增藻 泽蚤早灶葬贼怎则藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽
燥枣 匀杂孕怨园 枣葬皂蚤造赠 葬灶凿 葬 悦鄄贼藻则皂蚤灶葬造 糟赠贼燥责造葬泽皂蚤糟 糟澡葬则葬糟贼藻则 泽藻择怎藻灶糟藻 渊酝耘耘灾阅冤援 栽澡藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸 则藻泽怎造贼泽
蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造 燥枣 蕴凿鄄澡泽责怨园 憎葬泽 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠 蚤灶糟则藻葬泽藻凿 员 澡燥怎则 葬枣贼藻则 藻曾责燥泽藻凿 贼燥 猿愿 益
葬灶凿 源缘益袁 糟燥皂责葬则藻凿 贼燥 贼澡藻 糟燥灶贼则燥造袁 憎澡蚤造藻 贼澡藻则藻 憎葬泽 灶燥 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 遭藻贼憎藻藻灶 原 员园益 葬灶凿 园益 援
栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽怎早早藻泽贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 怎责鄄则藻早怎造葬贼藻凿 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 蕴凿鄄澡泽责怨园 皂蚤早澡贼 责造葬赠 葬灶 蚤皂责燥则贼葬灶贼 则燥造藻 蚤灶 澡蚤早澡
贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 贼燥造藻则葬灶糟藻 蚤灶 蕴援 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬援
运藻赠 憎燥则凿泽院 蕴藻责贼蚤灶燥贼葬则泽葬 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬曰 澡藻葬贼 泽澡燥糟噪 责则燥贼藻蚤灶 怨园曰 皂燥造藻糟怎造葬则 糟造燥灶蚤灶早曰 遭蚤燥蚤灶枣燥则皂葬贼蚤燥灶泽 葬灶葬造赠鄄
泽蚤泽曰 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸
摇 摇 马铃薯甲虫 蕴藻责贼蚤灶燥贼葬则泽葬 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬 渊杂葬赠冤是国
际公认的毁灭性检疫害虫袁也是我国农业和进境检
疫性有害生物及重要外来入侵种遥 该虫原产于墨西
哥咱员暂 袁自 员怨怨猿 年传入我国新疆后袁近 圆园 年来自西向
东传播袁发生面积已经扩大了数百倍袁目前在我国新
疆北部大部分区域均有分布咱圆 原 猿暂 遥 马铃薯甲虫具有
极强的生理尧生态适应能力袁猿 耀 缘 年内种群就能适
应新的环境袁并表现出与原始种群不同的生理生态
学特性遥 研究表明袁温度是影响物种分布扩散的主
要因素之一袁大量的研究已基本明确了马铃薯甲虫
生长发育与温度之间的关系咱源 原 缘暂 袁但从分子水平上
研究马铃薯甲虫对极端温度适应性的机制较少遥
热激蛋白渊澡藻葬贼 泽澡燥糟噪 责则燥贼藻蚤灶袁 匀杂孕冤的表达是生
物体适应极端温度的关键因素之一袁热激蛋白可以
与逆境下解析蛋白结合袁防止其自发折叠成不溶状
态咱远暂 曰也可以利用水解 粤栽孕的能量来帮助逆境下变
性蛋白重新折叠成正确的构象或使其降解袁从而使
昆虫获得耐热性咱苑暂 遥 匀杂孕苑园 的上调表达是昆虫滞
育越冬的必要条件袁如果缺乏 匀杂孕苑园袁昆虫蛹期的耐
低温能力会受到严重的影响咱愿 原 怨暂 遥 再燥糟怎皂咱员园暂研究证
实在滞育和不同温度处理条件下袁美国北达科他州
马铃薯甲虫滞育成虫的 蕴凿匀杂孕苑园粤尧蕴凿匀杂孕苑园月 基因
表达都存在显著差异遥
匀杂孕怨园 作为真核生物必不可少的一类分子伴
侣袁在极端温度适应中也发挥着重要作用咱员员暂 遥 国内
外已报道了多种昆虫的 澡泽责怨园 基因序列袁并对其在
胁迫条件下转录水平的表达量进行了一些研究遥 温
度胁迫条件下袁澡泽责怨园 的表达量存在明显的变化咱员圆暂 曰
高温刺激下袁甜菜夜蛾 杂责燥凿燥责贼藻则葬 藻曾蚤早怎葬幼虫体内的
澡泽责怨园 基因的表达显著升高咱员猿暂 曰高温胁迫对苹果蠹
蛾 悦赠凿蚤葬 责燥皂燥灶藻造造葬 缘 龄幼虫体内的 澡泽责怨园 基因具有
显著的诱导作用咱员源暂 遥 但是袁迄今为止袁国内外尚未
见关于马铃薯甲虫 澡泽责怨园 基因的克隆及表达分析的
报道遥 本研究通过生物信息学手段结合 砸栽鄄孕悦砸 及
砸粤悦耘技术克隆了马铃薯甲虫热激蛋白基因 澡泽责怨园袁
并利用实时荧光定量 孕悦砸 技术检测了高温和低温
胁迫条件下马铃薯甲虫成虫体内 澡泽责怨园 表达量的变
化袁以探讨马铃薯甲虫 澡泽责怨园 与其温度耐受性之间
的关系袁进而为了解马铃薯甲虫的扩张机制提供理
论依据遥
员 材料与方法
员援 员 材料
供试昆虫院马铃薯甲虫成虫采自新疆农业科学
院植物保护研究所安宁渠试验基地马铃薯试验田
渊愿苑毅圆愿忆圆愿义耘袁源猿毅缘苑忆苑义晕冤遥 在当地实验室自然环境
下袁用新鲜马铃薯叶片饲养于养虫盒内遥
供试植物院马铃薯品种为紫花白袁全生育期不施
用任何农药遥
主要试剂及仪器院总 砸晕粤 提取试剂 栽砸陨扎燥造尧反
转录酶 酝鄄酝蕴灾袁购自美国 陨灶增蚤贼则燥早藻灶公司曰阅晕粤凝胶
回收试剂盒袁购自美国 韵酝耘郧粤 公司曰克隆载体
责耘粤杂再鄄栽员尧感受态细胞 栽则葬灶泽员鄄栽员尧阅晕粤 皂葬则噪藻则袁购
自法国 栽则葬灶泽早藻灶藻公司曰猿忆鄄砸粤悦耘 试剂盒尧凿晕栽孕尧栽葬择
酶尧荧光定量 孕悦砸试剂盒 杂再月砸 郧则藻藻灶袁购自 栽葬运葬砸葬
公司遥 引物合成与测序由北京三博远志生物技术有
限责任公司完成遥 微量紫外分光光度仪 晕阅鄄员园园园袁
美国 栽澡藻则皂燥 杂糟蚤藻灶贼蚤枣蚤糟 公司曰实时荧光定量 孕悦砸 仪
苑缘园园 云葬泽贼袁美国 粤责责造蚤藻凿 月蚤燥泽赠泽贼藻皂泽公司遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 澡泽责怨园 全长 糟阅晕粤的克隆及序列分析
总 砸晕粤 的提取及第一链 糟阅晕粤 的合成院采用
栽则蚤扎燥造法咱员缘暂提取马铃薯甲虫成虫的总 砸晕粤袁结合微
量紫外分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳检测总 砸晕粤
的质量和浓度遥 取 员 滋早 总 砸晕粤 为模版袁以 韵造蚤早燥
渊凿栽冤员愿为反转录引物袁在反转录酶 酝鄄酝蕴灾的作用下
合成第一链 糟阅晕粤袁具体操作方法按照试剂盒说明
书进行遥
澡泽责怨园 片段的筛选及克隆验证院在 晕悦月陨 数据库
中搜索关键词蕴藻责贼蚤灶燥贼葬则泽葬 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬袁可以得到与
园园源 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
马铃薯甲虫相关的 耘杂栽序列 愿 缘怨远 个袁利用 月造葬泽贼圆早燥
对所有序列进行注释袁利用 悦粤孕猿 等软件拼接去冗袁
筛选出可能的 澡泽责怨园 序列遥 根据筛选得到的 澡泽责怨园
序列片段设计特异性引物 澡泽责怨园云员院缘忆鄄栽悦悦栽悦悦郧栽鄄
郧粤粤栽栽郧粤栽悦栽悦悦鄄猿忆袁 澡泽责怨园砸员院 缘忆鄄悦栽栽郧郧悦粤粤栽悦郧鄄
栽粤悦悦悦粤粤郧栽鄄猿忆袁 澡泽责怨园云圆院 缘忆鄄粤悦郧粤粤栽粤悦郧栽栽郧栽郧鄄
悦粤郧悦粤郧鄄猿忆袁澡泽责怨园砸圆院缘忆鄄悦粤栽郧粤栽粤悦郧悦栽悦悦粤栽郧栽栽鄄
郧郧鄄猿忆袁以反转录的第一链 糟阅晕粤 为模版进行扩增遥
反应条件院怨缘 益预变性 缘 皂蚤灶曰 怨缘 益 猿园 泽袁缘远 益退火
猿园 泽袁苑圆益延伸 猿园 泽袁共 猿缘 个循环曰最后 苑圆益延伸 员园
皂蚤灶遥 孕悦砸产物经 圆豫琼脂糖凝胶电泳检测后回收
目的片段袁连接到 责耘粤杂再鄄栽员 载体中袁转化至 栽则葬灶泽员鄄
栽员 感受态细胞袁挑选阳性克隆测序袁验证预测序列
的正确性遥
澡泽责怨园 全长序列的 砸粤悦耘扩增院根据上述已验证
的 澡泽责怨园 序列片段袁设计特异性引物院缘忆鄄粤悦郧粤粤栽鄄
粤悦郧栽栽郧栽郧悦粤郧悦粤郧鄄猿忆袁进行 猿忆鄄砸粤悦耘 孕悦砸袁具体步
骤按照试剂盒说明书进行遥 反应条件院怨缘 益预变性
缘 皂蚤灶曰怨缘 益变性 猿园 泽袁缘猿 益退火 猿园 泽袁苑圆 益延伸 员
皂蚤灶袁共 猿园 个循环曰最后 苑圆益延伸 员园皂蚤灶遥 扩增产物
克隆测序步骤同上遥
序列分析院利用 阅晕粤酝粤晕 软件对得到的 澡泽责怨园
糟阅晕粤片段进行拼接袁以获得 糟阅晕粤 全长序列遥 利
用在线工具 月蚤燥造燥早赠 宰燥则噪月藻灶糟澡 获得开放阅读框
渊韵砸云冤遥 应用 月蕴粤杂栽 工具对序列进行比对分析遥
用 悦燥皂责怎贼藻 责陨 辕 酝憎 贼燥燥造渊 澡贼贼责院 辕辕 憎藻遭援 藻曾责葬泽赠援 燥则早 辕 糟燥皂鄄
责怎贼藻赃责蚤 辕 冤预测相对分子量及理论等电点遥 采用分
子进化遗传分析软件 酝耘郧粤源 进行 运蚤皂怎则葬双参数遗
传距离分析袁构建 晕允 进化树袁分析马铃薯甲虫
匀杂孕怨园 的进化关系遥 以人类的 匀杂孕怨园 为模板渊孕阅月
登录号院猿择远皂袁 悦澡葬蚤灶院 月冤袁通过 杂宰陨杂杂 酝韵阅耘蕴工具
渊澡贼贼责院 辕辕 泽憎蚤泽泽皂燥凿藻造援 藻曾责葬泽赠援 燥则早 辕 冤在线比对建模袁预
测马铃薯甲虫 匀杂孕怨园 蛋白的三维结构袁孕赠酝韵蕴软件
对三维结构进行编辑与演示遥
员援 圆援 圆 澡泽责怨园 皂砸晕粤表达水平的相对定量
供试马铃薯甲虫的处理院将马铃薯甲虫成虫在
低温 原员园尧园 益及高温 猿愿尧源源尧源苑 和 缘园 益处理 员 澡袁每
处理 源 只成虫遥 之后迅速解剖成厚度不超过 园援 缘 糟皂
的小块浸入 砸晕粤 组织样品保护液中袁置于 原 愿园 益
中备用遥 以 圆缘 益室温下饲养的马铃薯甲虫作为对
照遥 每处理重复 猿 次遥
总 砸晕粤的提取及第一链 糟阅晕粤 的合成院用 栽则鄄
蚤扎燥造法提取不同温度处理后成虫的总 砸晕粤袁每处理 猿
次重复遥 选取 粤圆远园 辕 粤圆愿园值在 员援 怨园 耀 圆援 圆园 之间的总砸晕粤样品定量至 员 滋早袁在反转录酶 酝鄄酝蕴灾 的作用
下合成第一链 糟阅晕粤遥
内参基因的筛选及引物设计院选择 郧粤阅孕匀 和
琢鄄贼怎遭怎造蚤灶双内参校正定量结果遥 根据马铃薯甲虫
郧粤阅孕匀和 琢鄄贼怎遭怎造蚤灶 的 糟阅晕粤 序列设计并筛选特异
性引物 郧粤阅孕匀鄄云院缘忆鄄郧粤栽栽悦悦粤悦栽悦粤悦郧郧粤悦郧粤栽栽鄄
猿忆袁郧粤阅孕匀鄄砸院缘忆鄄悦粤栽粤栽栽栽郧悦悦悦悦粤粤郧郧粤粤栽郧鄄猿忆和
栽哉月鄄云院缘忆鄄悦栽郧悦悦栽悦栽栽栽郧粤郧郧栽栽悦郧粤悦鄄猿忆袁 栽哉月鄄砸院
缘忆鄄栽栽粤悦栽郧郧郧郧悦郧栽粤粤郧栽郧粤悦悦鄄猿忆袁根据克隆得到
的马铃薯甲虫 澡泽责怨园 糟阅晕粤序列袁用 孕则蚤皂藻则 猿 软件设
计引物袁筛选出定量片段的引物序列袁云匝院缘忆鄄悦栽栽鄄
郧郧郧栽粤悦郧粤栽栽郧悦悦粤粤郧栽鄄猿忆袁 砸匝院缘忆鄄栽郧郧粤悦粤悦悦粤悦鄄
悦郧栽郧粤悦栽栽栽粤鄄猿忆遥
实时荧光定量 孕悦砸标准曲线的制作院取 员 滋早总
砸晕粤样品反转录成 糟阅晕粤袁稀释成 员园 原员尧员园 原圆尧员园 原猿尧
员园 原 源和 员园 原缘倍遥 以这 缘 个浓度的 糟阅晕粤为模板进行
荧光定量 孕悦砸 扩增袁根据 悦贼 值与起始模板浓度对
数之间的关系制作标准曲线遥 实时荧光定量 孕悦砸
反应使用荧光染料 杂再月砸 郧则藻藻灶 陨遥 反应条件院怨缘 益
预变性 猿园 泽曰怨缘 益变性 猿 泽袁远园 益退火与延伸 猿园 泽袁共
源园 个循环曰最后在 远园 耀 怨缘益之间探测产物的溶解曲
线以保证反应的特异性遥
不同温度胁迫下马铃薯甲虫 澡泽责怨园 表达的定量
检测院将 糟阅晕粤稀释 员园 倍为模板进行实时荧光定量
孕悦砸扩增检测遥 每个样品重复 猿 次袁取平均值为该
处理的 悦贼 值遥 采用 圆 原吟吟悦贼法计算 澡泽责怨园 的相对表
达量遥
员援 猿 数据分析
用 杂粤杂 愿援 园 软件对不同处理样品中 澡泽责怨园 相对
表达量的差异进行分析袁显著性检测采用 蕴杂阅法遥
圆 结果与分析
圆援 员 马铃薯甲虫 澡泽责怨园 全长 糟阅晕粤序列的克隆
在 晕悦月陨数据库中筛选得到 圆 个马铃薯甲虫的
澡泽责怨园 片段袁分别为 圆园远 遭责的 澡泽责怨园鄄员渊图 员鄄葬冤与 圆远远
遭责的 澡泽责怨园鄄圆渊图 员鄄遭冤片段遥 以赤拟谷盗 栽则蚤遭燥造蚤怎皂
糟葬泽贼葬灶藻怎皂的 澡泽责怨园渊郧藻灶月葬灶噪登录号院晕酝赃园园员员园园缘怨苑冤
作为参照袁预测两段序列在全长序列中的位置遥 通过
第 圆轮 孕悦砸和 猿忆鄄砸粤悦耘 孕悦砸扩增袁分别获得长度为
员 远怨源 遭责 的 缘忆端全长序列片段 澡泽责怨园鄄猿 渊图 员鄄糟冤和
愿猿怨 遭责的 猿忆端全长序列片段 澡泽责怨园鄄源渊图 员鄄凿冤遥 最后袁
利用特异性引物扩增得到了 圆 员远园 遭责的全长 糟阅晕粤
员园源缘 期 蒋摇 健等院马铃薯甲虫热激蛋白基因 蕴凿鄄澡泽责怨园 的克隆及温度胁迫下的表达
图 员 马铃薯甲虫 澡泽责怨园 砸栽鄄孕悦砸和 猿忆鄄砸粤悦耘 孕悦砸扩增产物
云蚤早援 员 栽澡藻 砸栽鄄孕悦砸 葬灶凿 猿忆鄄砸粤悦耘 责则燥凿怎糟贼泽 燥枣 蕴凿鄄澡泽责怨园 蚤灶 蕴藻责贼蚤灶燥贼葬则泽葬 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬
摇 摇 葬院筛选片段 澡泽责怨园鄄员曰遭院筛选片段 澡泽责怨园鄄圆曰糟院缘忆端全长序列片段 澡泽责怨园鄄猿曰凿院猿忆端全长序列片段 澡泽责怨园鄄源曰藻院全长 澡泽责怨园的 韵砸云遥 酝院员园园
遭责 阅晕粤分子量标准渊葬尧遭尧凿冤袁圆 园园园 遭责 阅晕粤分子量标准渊糟尧藻冤曰员院孕悦砸扩增产物遥 葬院 孕悦砸 责则燥凿怎糟贼 燥枣 澡泽责怨园鄄员曰 遭院 孕悦砸 责则燥凿怎糟贼 燥枣 澡泽责怨园鄄圆曰
糟院 缘忆 藻灶凿 责则燥凿怎糟贼 燥枣 澡泽责怨园鄄猿曰 凿院 猿忆 藻灶凿 责则燥凿怎糟贼 燥枣 澡泽责怨园鄄源曰 藻院 孕悦砸 责则燥凿怎糟贼 燥枣 贼澡藻 枣怎造造鄄造藻灶早贼澡 澡泽责怨园援 酝院 员园园 遭责 造葬凿凿藻则 渊蚤灶 葬袁 遭袁 凿冤袁 圆 园园园
遭责 阅晕粤 皂葬则噪藻则 渊蚤灶 糟袁 藻冤曰 员院 孕悦砸 责则燥凿怎糟贼泽援
序列的 韵砸云渊图 员鄄藻冤遥 命名为 蕴凿鄄澡泽责怨园袁郧藻灶月葬灶噪登
录号为 运悦缘缘远愿园圆遥
圆援 圆 序列分析
蕴凿鄄澡泽责怨园 的全长 糟阅晕粤 序列为 圆 源愿怨 遭责袁缘忆和 猿忆
端非编码区长度分别为 员员猿 遭责 和 圆员远 遭责袁完整的
韵砸云编码 苑员怨 个氨基酸袁相对分子量为 愿圆援 园怨 噪阅袁等
电点为 源援 怨愿遥 推导的氨基酸序列中含有 匀杂孕怨园 家
族的 缘 段签名序列院晕运耘陨云蕴砸耘蕴陨杂晕渊杂 辕 粤冤 杂阅粤蕴阅鄄
运陨砸尧蕴郧栽陨粤渊运 辕 砸冤 杂郧栽尧陨郧匝云郧灾郧云再杂粤渊再 辕 云冤 蕴灾粤
渊耘 辕 阅冤尧陨运蕴再灾砸砸灾云陨尧郧灾灾阅杂渊耘 辕 阅冤 阅蕴孕蕴晕渊 陨 辕 灾冤
杂砸耘袁氨基酸的 悦 端为胞质蛋白标志序列 酝耘耘灾阅遥
此外氨基酸序列中含有在基因转录调控中发挥着重
要作用的一些基本结构单元袁如 蕴曾曾蕴蕴 模块和
郧曾曾郧曾郧模块渊图 圆冤遥
摇 摇 马铃薯甲虫 匀杂孕怨园 蛋白的三维模拟结构主要
由 猿 个结构域组成院靠近 晕 端的 蕴酝 结构域渊 造葬则早藻
皂蚤凿凿造藻 凿燥皂葬蚤灶冤袁紧邻一个 杂酝 结构域渊 泽皂葬造造 皂蚤凿凿造藻
凿燥皂葬蚤灶冤袁以及靠近 悦 端的 悦 结构域渊悦鄄贼藻则皂蚤灶葬造 凿燥鄄
皂葬蚤灶冤渊图 猿冤遥 蕴酝结构域包含 员 个三层的 琢鄄茁鄄琢三
明治结构和 员 个螺旋线圈袁外围围绕着 圆 个无序的
环遥 杂酝结构域也折叠成 员 个 琢鄄茁鄄琢三明治结构袁并
包含 员 个硫酸盐结合位点遥 悦 结构域由 员 个亲水 辕
脂两性环袁加 员 个弯曲的 琢 螺旋袁及 员 个三联的 茁
折叠和 员 个三联的 琢螺旋构成遥
圆援 猿 系统发育树的构建
序列相似性分析结果表明袁马铃薯甲虫的
匀杂孕怨园 与赤拟谷盗尧黄粉虫 栽藻灶藻遭则蚤燥 皂燥造蚤贼燥则 的氨基
酸序列一致性较高袁达 怨员豫 曰与二化螟 悦澡蚤造燥 泽怎责责藻则鄄
泽泽葬造蚤泽尧甜菜夜蛾 杂责燥凿燥责贼藻则葬 藻曾蚤早怎葬尧粘虫 酝赠贼澡蚤皂灶葬
泽藻责葬则葬贼葬等的 匀杂孕怨园 氨基酸序列一致性均为 愿苑豫 曰
与蟋蟀 郧则赠造造怎泽 枣蚤则皂怎泽尧印度跳蚁 匀葬则责藻早灶葬贼澡燥泽 泽葬造贼葬贼燥则
的氨基酸序列一致性分别为 愿远豫和 愿源豫 遥 系统发
育树显示袁马铃薯甲虫与鞘翅目昆虫异色瓢虫 匀葬则鄄
皂燥灶蚤葬 葬曾赠则蚤凿蚤泽 渊郧藻灶月葬灶噪 登录号院粤悦蕴缘园缘缘园援 员冤尧黄
粉虫渊粤云晕园圆源怨愿援 员冤尧赤拟谷盗渊晕孕赃园园员园怨源园远苑援 员冤
的 匀杂孕怨园 聚为一类袁此外直翅目昆虫中华稻蝗 韵曾赠葬
糟澡蚤灶藻灶泽蚤泽 渊粤云晕园愿远源源援 员冤尧东亚飞蝗 蕴燥糟怎泽贼葬 皂蚤早则葬贼燥鄄
则蚤葬 渊粤粤杂源缘圆源远援 圆冤尧蟋蟀渊粤阅运远源怨缘圆援 员冤袁同翅目褐
飞虱 晕蚤造葬责葬则增葬贼葬 造怎早藻灶泽 渊粤阅耘猿源员远怨援 员冤尧白背飞虱
杂燥早葬贼藻造造葬 枣怎则糟蚤枣藻则葬 渊粤云运远源愿圆园援 员冤袁半翅目草盲蝽 蕴赠鄄
早怎泽 澡藻泽责藻则怎泽 渊 粤云载愿源缘缘怨援 员 冤袁 膜翅目印度跳蚁
渊耘云晕愿愿猿苑源援 员冤尧刺桐釉小蜂 匝怎葬凿则葬泽贼蚤糟澡怎泽 藻则赠贼澡则蚤灶葬藻
渊粤云悦苑远员缘圆援 员冤尧中红侧沟茧蜂 酝蚤糟则燥责造蚤贼蚤泽 皂藻凿蚤葬贼燥则
渊粤月灾缘缘缘园远援 员冤尧腰带长体茧蜂 酝葬糟则燥糟藻灶贼则怎泽 糟蚤灶早怎鄄
造怎皂 渊粤悦耘苑苑苑愿园援 员冤袁鳞翅目小菜蛾 孕造怎贼藻造造葬 曾赠造燥泽贼藻造造葬
渊月粤耘源愿苑源圆援 员冤尧草地螟 蕴燥曾燥泽贼藻早藻 泽贼蚤糟贼蚤糟葬造蚤泽 渊粤月宰愿苑鄄
苑怨员援 员冤尧甜菜夜蛾渊粤悦蕴苑苑苑苑怨援 员冤尧粘虫渊粤阅酝圆远苑源园援
员冤尧棉铃虫 匀藻造蚤糟燥增藻则责葬 葬则皂蚤早藻则葬 渊粤阅酝圆远苑源猿援 员冤以及
双翅目白魔按蚊 粤灶燥责澡藻造藻泽 葬造遭蚤皂葬灶怎泽 渊粤粤月园缘远猿愿援
员冤尧桔小实蝇 月葬糟贼则燥糟藻则葬 凿燥则泽葬造蚤泽 渊粤耘允愿愿源远远援 员冤尧美
洲斑潜蝇 蕴蚤则蚤燥皂赠扎葬 泽葬贼蚤增葬藻 渊粤粤宰源怨圆缘猿援 圆冤尧南美斑
潜蝇 蕴蚤则蚤燥皂赠扎葬 澡怎蚤凿燥遭则藻灶泽蚤泽 渊 粤粤宰源怨圆缘圆援 圆 冤 的
匀杂孕怨园 分别各自聚类在一起袁该聚类结果可将昆虫
归类到各自的传统分类地位中渊图 源冤遥
圆园源 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
图 圆 马铃薯甲虫 蕴凿鄄澡泽责怨园 核苷酸序列及推导的氨基酸序列
云蚤早援 圆 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 蕴凿鄄澡泽责怨园 葬灶凿 蚤贼泽 凿藻凿怎糟藻凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 蕴藻责贼蚤灶燥贼葬则泽葬 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬
摇 摇 黑体 粤栽郧为起始密码子曰鄢表示终止密码子曰下划线处是匀杂孕怨园家族签名序列曰箭头表示胞质特征序列曰方框表示 郧曾曾郧曾郧模块与
蕴曾曾蕴蕴模块遥 栽澡藻 泽贼葬则贼 糟燥凿燥灶 粤栽郧 蚤泽 蚤灶 遭燥造凿曰 鄢院 贼澡藻 泽贼燥责 糟燥凿燥灶 栽粤郧曰 怎灶凿藻则造蚤灶藻院 枣蚤增藻 匀杂孕怨园 枣葬皂蚤造赠 泽蚤早灶葬贼怎则藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽曰 葬则则燥憎院 糟赠贼燥责造葬泽皂蚤糟
糟澡葬则葬糟贼藻则 泽藻择怎藻灶糟藻曰 郧曾曾郧曾郧 皂燥贼蚤枣 葬灶凿 蕴曾曾蕴蕴 皂燥贼蚤枣 葬则藻 泽澡燥憎灶 蚤灶 贼澡藻 遭燥曾援
圆援 源 马铃薯甲虫 澡泽责怨园 不同温度胁迫下的相对表达
马铃薯甲虫成虫经 源苑 益和 缘园 益处理 员 澡后袁死
亡率为 员园园豫 袁选择 原员园尧园尧圆缘尧猿愿 和 源源 益等 缘 个温
度处理 员 澡 检测 澡泽责怨园 的相对表达量遥 扩增的
澡泽责怨园尧郧粤阅孕匀 和 琢鄄贼怎遭怎造蚤灶 基因片段长度分别为
员源园尧员圆源 和 员员员 遭责遥 倍比稀释的 糟阅晕粤 模板实时荧
光定量 孕悦砸检测结果表明袁浓度每降低 员园 倍袁相应
的 悦贼 值就增加 猿 耀 源 次循环遥 起始模板浓度与可检
测到荧光信号的循环数呈线性关系袁其相关系数 砸圆
分别为 园援 怨怨怨尧园援 怨怨愿 和 园援 怨怨愿袁扩增效率分别为
员园猿豫 尧员园源豫和 员园源豫 袁表明该标准曲线可以在较宽
的范围内用于马铃薯甲虫 澡泽责怨园 相对定量检测遥
高温胁迫对马铃薯甲虫成虫 澡泽责怨园 的表达具有
明显的诱导作用遥 猿愿 益和 源源 益高温热激 员 澡袁马铃
薯甲虫的澡泽责怨园的表达量均显著高于对照组渊孕 约
园援 园缘冤袁约为对照组的 苑 耀 员员 倍袁其中袁猿愿 益处理组
马铃薯甲虫 澡泽责怨园 的表达量最高袁显著高于其它处
理组曰而 园 益与 原员园 益低温处理 员 澡 后袁马铃薯甲虫
澡泽责怨园 的表达量与对照组均无显著性差异渊图 缘冤遥
猿 讨论
本研究通过生物信息学手段结合砸栽鄄孕悦砸和
猿园源缘 期 蒋摇 健等院马铃薯甲虫热激蛋白基因 蕴凿鄄澡泽责怨园 的克隆及温度胁迫下的表达
图 猿 马铃薯甲虫 匀杂孕怨园 三维结构预测结果
云蚤早援 猿 孕则藻凿蚤糟贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 贼澡则藻藻鄄凿蚤皂藻灶泽蚤燥灶葬造 泽贼则怎糟贼怎则藻 燥枣 匀杂孕怨园 蚤灶 蕴藻责贼蚤灶燥贼葬则泽葬 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬
图 源 晕允法构建昆虫 匀杂孕怨园 序列的系统进化树
云蚤早援 源 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 贼则藻藻 燥枣 蚤灶泽藻糟贼 匀杂孕怨园 泽藻择怎藻灶糟藻泽 遭赠 晕允 皂藻贼澡燥凿
砸粤悦耘技术成功克隆得到一个马铃薯甲虫 澡泽责怨园 基
因 糟阅晕粤全长序列袁所推导的氨基酸序列含有缘段
匀杂孕怨园 家族的特征序列袁表明所克隆的基因属于
匀杂孕怨园 家族遥 氨基酸序列 悦 端最末端的定位基序
为 酝耘耘灾阅袁说明此 匀杂孕怨园 为细胞质蛋白咱员远暂 遥 郧怎责贼葬
等咱员苑暂 尧月燥燥则泽贼藻蚤灶等咱员愿暂研究发现袁相似的细胞质定位
源园源 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
图 缘 不同温度条件处理 员 澡后马铃薯甲虫成虫 澡泽责怨园 的相对表达量
云蚤早援 缘 栽澡藻 则藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造泽 燥枣 澡泽责怨园 蚤灶 蕴藻责贼蚤灶燥贼葬则泽葬 凿藻糟藻皂造蚤灶藻葬贼葬 葬凿怎造贼泽
葬枣贼藻则 藻曾责燥泽怎则藻 贼燥 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 泽贼则藻泽泽 枣燥则 员 澡燥怎则
摇 摇 图中数据为平均数 依标准误遥 不同小写字母表示经 蕴杂阅法检验差异显著渊孕臆园援 园缘冤遥 栽澡藻 凿葬贼葬 蚤灶 贼澡藻 枣蚤早怎则藻 葬则藻 皂藻葬灶 依 杂耘援 栽澡藻 凿蚤枣鄄
枣藻则藻灶贼 造燥憎藻则糟葬泽藻 造藻贼贼藻则泽 葬遭燥增藻 遭葬则泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 渊孕臆园援 园缘冤遭赠 蕴杂阅 皂藻贼澡燥凿援
基序 酝耘耘灾阅尧内质网定位基序 运阅耘蕴或 匀阅耘蕴也存
在于匀杂孕苑 园家族中 遥 郧曾曾郧曾郧模块是匀杂孕怨 园结合
粤栽孕所必须的结构基元咱员怨暂 袁在 匀杂孕怨园 正常发挥功
能的过程中起着至关重要的作用袁蕴曾曾蕴蕴 模块则在
匀杂孕怨园 转录调控中发挥着重要的作用咱圆园 原 圆员暂 遥 综上
所述袁推测所克隆的 澡泽责怨园 基因在马铃薯甲虫受到
温度胁迫时与其它生物体中的 澡泽责怨园 基因的作用
相似遥
马铃薯甲虫的 匀杂孕怨园 与鞘翅目昆虫的氨基酸
序列一致性较高袁达 怨员豫 袁与其它目昆虫的序列相
似性最低为 愿源豫 袁说明昆虫体内 匀杂孕怨园 在进化上具
有高度的保守性遥 孕葬造皂蚤泽葬灶燥 等咱圆圆暂提出通过比对
匀杂孕怨园 序列所构建的系统发育树可以解释物种间的
进化关系袁本研究的系统进化分析结果与此观点相
符袁进一步说明 澡泽责怨园 可以作为生物系统进化分析
的候选基因遥
马铃薯甲虫 匀杂孕怨园 蛋白主要由 猿 个结构域组
成袁这与已报道的其它生物体的热诱导型 匀杂孕怨园 的
三维结构基本一致咱圆猿暂 袁高度保守的三维结构与
匀杂孕怨园 正常行使功能密不可分遥 其中袁靠近 晕 端的
蕴酝结构域含有分子伴侣结合模块以及 员 个能与
粤栽孕和有害化学物质结合的位点袁而 杂酝 结构域负
责结合分子伴侣及下游蛋白袁悦 结构域含有 员 个参
与二聚化的模块和另一有害化学物质结合位点遥 热
刺激产生的毒害物质等均可结合在相应位置诱导
匀杂孕怨园 的合成袁而 粤栽孕 与格尔霉毒素可结合到 蕴酝
结构域上的相同位置抑制 匀杂孕怨园 的合成咱圆源暂 遥
匀杂孕怨园 在真核生物体中含量丰富袁在无压力的
正常状态下约占胞质蛋白的 员豫 耀 圆豫 袁在胁迫条件
下含量会更高咱圆缘暂 遥 本研究将马铃薯甲虫成虫在 猿愿
益和 源源 益热激处理 员 澡 后袁澡泽责怨园 的表达量比对照
组均显著上升袁表明 澡泽责怨园 的上调表达在马铃薯甲
虫抗高温中起着重要的作用袁也再次证明马铃薯甲
虫对高温胁迫具有很强的耐受力遥 热诱导型的
匀杂孕怨园 能够阻止多肽不可逆的聚合袁匀杂孕怨园 的分子
伴侣功能在保护细胞免受热损害中起着关键作
用咱圆远暂 遥 但 匀杂孕怨园 对机体的保护不是无休止的袁超
过一定范围后 澡泽责怨园 的表达量将会下降咱员猿暂 遥 马铃
薯甲虫 澡泽责怨园 表达量在 猿愿 益时达到最高袁源源 益时显
著下降袁很可能是由于 源源 益的高温对机体造成的伤
害已经超出了 匀杂孕怨园 对马铃薯甲虫成虫的保护作
用遥 同时袁本研究还发现袁低温渊园 益和 原员园 益冤胁迫
员 澡后袁澡泽责怨园 的表达量与对照组相比有少量增加袁
但均无显著差异遥 这可能是由于 匀杂孕怨园 在正常状
态下的含量就很高袁而在相对非极端的条件下诱导
其适量表达即可使生物体获得抗逆性遥 另外袁本研
究选择 郧粤阅孕匀 和 琢鄄贼怎遭怎造蚤灶 作为双内参袁取两者的
几何平均数对定量进行校正袁使得最终的定量结果
更加可靠咱圆愿暂 遥
下一步将在马铃薯甲虫体内筛选更多的 澡泽责 基
因袁检测它们在极端温度调节下的表达量变化袁并通
过 砸晕粤蚤技术诱导这些 澡泽责基因沉默袁从而进一步验
证它们在马铃薯甲虫抗高温过程中的功能遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 粤造赠燥噪澡蚤灶 粤援 悦燥造燥则葬凿燥 责燥贼葬贼燥 遭藻藻贼造藻 皂葬灶葬早藻皂藻灶贼 燥灶 责燥贼葬贼燥藻泽院
糟怎则则藻灶贼 糟澡葬造造藻灶早藻泽 葬灶凿 枣怎贼怎则藻 责则燥泽责藻糟贼泽援 云则怎蚤贼袁 灾藻早藻贼葬遭造藻袁 葬灶凿
悦藻则藻葬造 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园园怨袁 猿院 员园 原 员怨
缘园源缘 期 蒋摇 健等院马铃薯甲虫热激蛋白基因 蕴凿鄄澡泽责怨园 的克隆及温度胁迫下的表达
咱圆暂 郭文超袁吐尔逊袁许建军袁等援 马铃薯甲虫识别及其在新疆的
分布尧传播和危害援 新疆农业科学袁圆园员园渊缘冤院怨园远 原 怨园怨
咱猿暂 洪波袁张云慧袁李超袁等援 马铃薯甲虫空间分布型及序贯抽
样援 植物保护学报袁圆园员园袁猿苑渊猿冤院圆园远 原 圆员园
咱源暂 洪波袁程登发袁吐尔逊袁等援 新疆地区马铃薯甲虫发育与温度
关系的研究援 植物保护袁圆园园怨袁猿缘渊远冤院远园 原 远猿
咱缘暂 周昭旭袁罗进仓袁吕和平袁等援 温度对马铃薯甲虫生长发育的
影响援 昆虫学报袁圆园员园袁缘猿渊愿冤院怨圆远 原 怨猿员
咱远暂 阅葬怎早葬葬则凿 酝袁 砸燥澡凿藻 酝袁 允覿覿贼贼藻造覿 酝援 栽澡藻 澡藻葬贼 泽澡燥糟噪 责则燥贼藻蚤灶 苑园
枣葬皂蚤造赠院 澡蚤早澡造赠 澡燥皂燥造燥早燥怎泽 责则燥贼藻蚤灶泽 憎蚤贼澡 燥增藻则造葬责责蚤灶早 葬灶凿 凿蚤泽贼蚤灶糟贼
枣怎灶糟贼蚤燥灶泽援 云耘月杂 蕴藻贼贼藻则泽袁 圆园园苑袁 缘愿员院 猿苑园圆 原 猿苑员园
咱苑暂 阅葬澡造澡燥枣枣 耘 孕袁 砸葬灶噪 晕 耘援 栽澡藻 则燥造藻 燥枣 泽贼则藻泽泽 责则燥贼藻蚤灶泽 蚤灶 则藻泽责燥灶鄄
泽藻泽 燥枣 葬 皂燥灶贼葬灶藻 憎蚤造造燥憎 造藻葬枣 遭藻藻贼造藻 贼燥 藻灶增蚤则燥灶皂藻灶贼葬造 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻
增葬则蚤葬贼蚤燥灶援 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥泽糟蚤藻灶糟藻泽袁 圆园园苑袁 猿圆渊猿冤院 源苑苑 原 源愿愿
咱愿暂 砸蚤灶藻澡葬则贼 允 孕袁 蕴蚤 粤袁 再燥糟怎皂 郧 阅袁 藻贼 葬造援 哉责鄄则藻早怎造葬贼蚤燥灶 燥枣 澡藻葬贼
泽澡燥糟噪 责则燥贼藻蚤灶泽 蚤泽 藻泽泽藻灶贼蚤葬造 枣燥则 糟燥造凿 泽怎则增蚤增葬造 凿怎则蚤灶早 蚤灶泽藻糟贼 凿蚤葬鄄
责葬怎泽藻援 孕则燥糟藻藻凿蚤灶早泽 燥枣 贼澡藻 晕葬贼蚤燥灶葬造 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 杂糟蚤藻灶糟藻泽 燥枣 贼澡藻
哉灶蚤贼藻凿 杂贼葬贼藻泽 燥枣 粤皂藻则蚤糟葬袁 圆园园苑袁 员园源渊圆苑冤院 员员员猿园 原 员员员猿苑
咱怨暂 郑丹袁崔旭红袁李红亮袁等援 三叶草斑潜蝇 澡泽责苑园 的克隆及其
表达量在高低温胁迫下的变化援 植物保护学报袁圆园员园袁猿苑
渊圆冤院员缘怨 原 员远源
咱员园暂 再燥糟怎皂 郧 阅援 阅蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬造 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 贼憎燥 匀杂孕苑园 贼则葬灶泽糟则蚤责贼泽
蚤灶 则藻泽责燥灶泽藻 贼燥 糟燥造凿 泽澡燥糟噪袁 贼澡藻则皂燥责藻则蚤燥凿袁 葬灶凿 葬凿怎造贼 凿蚤葬责葬怎泽藻
蚤灶 贼澡藻 悦燥造燥则葬凿燥 责燥贼葬贼燥 遭藻藻贼造藻援 允燥怎则灶葬造 燥枣 陨灶泽藻糟贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁
圆园园员袁 源苑渊员园冤院 员员猿怨 原 员员源缘
咱员员暂 月燥则噪燥增蚤糟澡 运 粤袁 云葬则则藻造造赠 云 宰袁 云蚤灶噪藻造泽贼藻蚤灶 阅 月袁 藻贼 葬造援 澡泽责愿圆
蚤泽 葬灶 藻泽泽藻灶贼蚤葬造 责则燥贼藻蚤灶 贼澡葬贼 蚤泽 则藻择怎蚤则藻凿 蚤灶 澡蚤早澡藻则 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶泽
枣燥则 早则燥憎贼澡 燥枣 糟藻造造泽 葬贼 澡蚤早澡藻则 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻泽援 酝燥造藻糟怎造葬则 葬灶凿 悦藻造鄄
造怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 员怨愿怨袁 怨渊怨冤院 猿怨员怨 原 猿怨猿园
咱员圆暂 匀怎葬灶早 蕴 匀袁 宰葬灶早 悦 在袁 运葬灶早 蕴援 悦造燥灶蚤灶早 葬灶凿 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣
枣蚤增藻 澡藻葬贼 泽澡燥糟噪 责则燥贼藻蚤灶 早藻灶藻泽 蚤灶 则藻造葬贼蚤燥灶 贼燥 糟燥造凿 澡葬则凿藻灶蚤灶早 葬灶凿
凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 蚤灶 贼澡藻 造藻葬枣皂蚤灶藻则袁 蕴蚤则蚤燥皂赠扎葬 泽葬贼蚤增葬援 允燥怎则灶葬造 燥枣 陨灶鄄
泽藻糟贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 圆园园怨袁 缘缘渊猿冤院 圆苑怨 原 圆愿缘
咱员猿暂 翟会芳袁江幸福袁罗礼智援 甜菜夜蛾 匀杂孕怨园 基因克隆及高
温胁迫下其表达量的变化援 昆虫学报袁圆园员园袁缘猿渊员冤院圆园 原 圆愿
咱员源暂 申建茹袁李明福袁陈乃中袁等援 苹果蠹蛾热激蛋白 匀泽责怨园 基
因的克隆及热胁迫下的表达分析援 昆虫学报袁圆园员员袁缘源
渊员员冤院员圆猿远 原 员圆源愿
咱员缘暂 悦澡燥皂糟扎赠灶泽噪蚤 孕援 粤 则藻葬早藻灶贼 枣燥则 贼澡藻 泽蚤灶早造藻鄄泽贼藻责 泽蚤皂怎造贼葬灶藻燥怎泽 蚤泽燥鄄
造葬贼蚤燥灶 燥枣 砸晕粤袁 阅晕粤 葬灶凿 责则燥贼藻蚤灶泽 枣则燥皂 糟藻造造 葬灶凿 贼蚤泽泽怎藻 泽葬皂鄄
责造藻泽援 月蚤燥贼藻糟澡灶蚤择怎藻泽袁 员怨怨猿袁 员缘渊猿冤院 缘猿圆 原 缘猿苑
咱员远暂 郧怎责贼葬 砸 杂援 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 怨园 噪阅 澡藻葬贼 泽澡燥糟噪 枣葬皂鄄
蚤造赠 燥枣 责则燥贼藻蚤灶 泽藻择怎藻灶糟藻泽 葬灶凿 葬灶 藻曾葬皂蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责
葬皂燥灶早 葬灶蚤皂葬造泽袁 责造葬灶贼泽袁 葬灶凿 枣怎灶早蚤 泽责藻糟蚤藻泽援 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠
葬灶凿 耘增燥造怎贼蚤燥灶袁 员怨怨缘袁 员圆渊远冤院 员园远猿 原 员园苑猿
咱员苑暂 郧怎责贼葬 砸 杂袁 粤蚤贼噪藻灶 运袁 云葬造葬澡 运 酝袁 藻贼 葬造援 悦造燥灶蚤灶早 燥枣 郧蚤葬则凿蚤葬
造葬皂遭造蚤葬 澡藻葬贼 泽澡燥糟噪 责则燥贼藻蚤灶 匀杂孕苑园 澡燥皂燥造燥早泽院 蚤皂责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽 则藻鄄
早葬则凿蚤灶早 燥则蚤早蚤灶 燥枣 藻怎噪葬则赠燥贼蚤糟 糟藻造造泽 葬灶凿 燥枣 藻灶凿燥责造葬泽皂蚤糟 则藻贼蚤糟怎鄄
造怎皂援 孕则燥糟藻藻凿蚤灶早泽 燥枣 贼澡藻 晕葬贼蚤燥灶葬造 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 杂糟蚤藻灶糟藻泽 燥枣 贼澡藻
哉灶蚤贼藻凿 杂贼葬贼藻泽 燥枣 粤皂藻则蚤糟葬袁 员怨怨源袁 怨员渊愿冤院 圆愿怨缘 原 圆愿怨怨
咱员愿暂 月燥燥则泽贼藻蚤灶 宰 砸袁 在蚤藻早藻造澡燥枣枣藻则 栽袁 悦则葬蚤早 耘 粤援 酝燥造藻糟怎造葬则 藻增燥造怎鄄
贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 匀杂孕苑园 皂怎造贼蚤早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠援 允燥怎则灶葬造 燥枣 酝燥造藻糟怎造葬则 耘增燥鄄
造怎贼蚤燥灶袁 员怨怨源袁 猿愿渊员冤院 员 原 员苑
咱员怨暂 孕则燥凿则燥皂燥怎 悦袁 砸燥藻 杂 酝袁 韵忆月则蚤藻灶 砸袁 藻贼 葬造援 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿
泽贼则怎糟贼怎则葬造 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 粤栽孕 辕 粤阅孕鄄遭蚤灶凿蚤灶早 泽蚤贼藻 蚤灶 贼澡藻
匀泽责怨园 皂燥造藻糟怎造葬则 糟澡葬责藻则燥灶藻援 悦藻造造袁 员怨怨苑袁 怨园渊员冤院 远缘 原 苑缘
咱圆园暂 孕造藻增蚤灶 酝 允袁 酝蚤造造泽 酝 酝袁 陨噪怎则葬 酝援 栽澡藻 蕴曾曾蕴蕴 皂燥贼蚤枣院 葬 皂怎造贼蚤鄄
枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造 遭蚤灶凿蚤灶早 泽藻择怎藻灶糟藻 蚤灶 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶葬造 则藻早怎造葬贼蚤燥灶援
栽则藻灶凿泽 蚤灶 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 圆园园缘袁 猿园渊圆冤院 远远 原 远怨
咱圆员暂 允蚤葬灶早 杂 郧袁 匝蚤怎 蕴袁 在澡燥怎 云 蕴袁 藻贼 葬造援 酝燥造藻糟怎造葬则 糟造燥灶蚤灶早 葬灶凿 藻曾鄄
责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 葬 澡藻葬贼 泽澡燥糟噪 责则燥贼藻蚤灶 渊匀泽责怨园冤 早藻灶藻 枣则燥皂
遭造葬糟噪 贼蚤早藻则 泽澡则蚤皂责 渊 孕藻灶葬藻怎泽 皂燥灶燥凿燥灶冤援 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠
砸藻责燥则贼泽袁 圆园园怨袁 猿远渊员冤院 员圆苑 原 员猿源
咱圆圆暂 孕葬造皂蚤泽葬灶燥 粤 晕袁 宰蚤灶贼燥灶 允 砸袁 阅蚤糟噪澡燥枣枣 宰 宰援 杂藻择怎藻灶糟藻 枣藻葬鄄
贼怎则藻泽 葬灶凿 责澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 泽贼则藻泽泽 责则燥贼藻蚤灶 澡泽责怨园琢 蚤灶
悦澡蚤灶燥燥噪 泽葬造皂燥灶 渊韵灶糟燥则澡赠灶糟澡怎泽 贼泽澡葬憎赠贼泽糟澡葬冤袁 葬 责燥蚤噪蚤造燥贼澡藻则鄄
皂蚤糟 增藻则贼藻遭则葬贼藻援 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 葬灶凿 月蚤燥责澡赠泽蚤糟葬造 砸藻泽藻葬则糟澡 悦燥皂鄄
皂怎灶蚤糟葬贼蚤燥灶泽袁 员怨怨怨袁 圆缘愿渊猿冤院 苑愿源 原 苑怨员
咱圆猿暂 蕴藻藻 悦 悦袁 蕴蚤灶 栽 宰袁 运燥 栽 孕袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 澡藻曾葬皂藻则蚤糟 泽贼则怎糟贼怎则藻泽 燥枣
澡怎皂葬灶 澡藻葬贼 泽澡燥糟噪 责则燥贼藻蚤灶 怨园援 孕蕴韵杂 韵晕耘袁 圆园员员袁 远
渊缘冤院 藻员怨怨远员
咱圆源暂 酝燥怎造造蚤灶贼则葬枣枣燥则贼 蕴袁 月则怎灶藻葬怎曾 酝袁 晕葬扎葬遭葬造 粤袁 藻贼 葬造援 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造
葬灶凿 遭蚤燥责澡赠泽蚤糟葬造 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 酝早圆 垣 鄄蚤灶凿怎糟藻凿 怨园鄄噪阅葬
澡藻葬贼 泽澡燥糟噪 责则燥贼藻蚤灶 燥造蚤早燥皂藻则泽援 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁
圆园员园袁 圆愿缘渊圆园冤院 员缘员园园 原 员缘员员园
咱圆缘暂 杂覬则藻灶泽藻灶 允 郧袁 运则蚤泽贼藻灶泽藻灶 栽 晕袁 蕴燥藻泽糟澡糟噪 灾援 栽澡藻 藻增燥造怎贼蚤燥灶葬则赠
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