全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１５， ４２（３）： ３２１ － ３２６ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１５􀆰 ０３􀆰 ００６
基金项目： 中国博士后基金（１１２１２５），山西省科技攻关项目（２０１３０３１１０１１⁃５，２０１２０３１１０１３⁃４），山西省留学基金（２０１３⁃重点 ６）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｓｘａｕｌｉｓｃ＠ １２６． ｃｏｍ， ｈｊｐｓｘ＠ ｙａｈｏｏ． ｃｏｍ． ｃｎ
收稿日期： ２０１４ － １１ － １４
温度诱导对星豹蛛热激蛋白 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０
基因表达的影响
李　 锐１ 　 刘　 佳２ 　 李萨丽１ 　 李　 娜１ 　 李生才１∗　 洪坚平３∗
（１．山西农业大学农学院， 太谷 ０３０８０１； ２．山西省农业科学院经济作物研究所， 汾阳 ０３２２００；
３．山西农业大学资源环境学院， 太谷 ０３０８０１）
摘要： 为探讨温度诱导对星豹蛛的应激反应，运用实时定量 ＰＣＲ法测定了不同温度对星豹蛛热激
蛋白 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因表达量的影响。 结果表明：经过 １７、２０、２３、２６ ℃诱导后，星豹蛛 ｈｓｐ７０ 和
ｈｓｐ９０ 基因表达量与对照组差异不显著，当高于 ２６ ℃时，随着温度的升高表达量呈先升高后降低的
趋势，且在 ３８ ℃时最高，分别为对照组的 ７１６􀆰 ４６ 和 １０􀆰 ４４ 倍，差异显著；低于 １７ ℃时，表达量随着
温度的降低呈逐渐升高的趋势，其中 － １ ℃时最高，分别为对照组的 ３３４􀆰 ５３ 和 ９􀆰 ３８ 倍，差异显著；
－ １ ～ ４１ ℃范围内，在相同诱导温度处理下，星豹蛛 ｈｓｐ７０ 基因表达量显著高于 ｈｓｐ９０ 基因。 表明
当星豹蛛受到温度高于 ２６ ℃或低于 １７ ℃的刺激后，体内 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因表达量均增加，且
ｈｓｐ７０ 基因表达量高于 ｈｓｐ９０ 基因。 说明热激蛋白只有在极端高温和低温的条件下才充分表达，从
而对机体产生保护作用，且这种保护只在一定温度范围内起作用。
关键词： 星豹蛛； 热激蛋白 ７０； 热激蛋白 ９０； 温度诱导； 实时荧光定量 ＰＣＲ
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｈｓｐ７０ ａｎｄ ｈｓｐ９０
ｇｅｎｅ ｉｎ Ｐａｒｄｏｓａ ａｓｔｒｉｇｅｒａ Ｌ． Ｋｏｃｈ
Ｌｉ Ｒｕｉ１ 　 Ｌｉｕ Ｊｉａ２ 　 Ｌｉ Ｓａｌｉ１ 　 Ｌｉ Ｎａ１ 　 Ｌｉ Ｓｈｅｎｇｃａｉ１∗ 　 Ｈｏｎｇ Ｊｉａｎｐｉｎｇ３∗
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｔａｉｇｕ ０３０８０１， Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｒｏｐｓ， Ｓｈａｎｘｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｅｎｙａｎｇ ０３２２００， Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
３． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｔａｉｇｕ ０３０８０１， Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｄｏｓａ ａｓｔｒｉｇｅｒａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ， ｔｈｅ
ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｓｐ７０ ａｎｄ ｈｓｐ９０ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｐ． ａｓｔｒｉｇｅｒａ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ｈｓｐ７０ ａｎｄ ｈｓｐ９０ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｔ １７， ２０， ２３ ａｎｄ ２６ ℃ ． Ｗｈｅｎ
ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ｒａｉｓｅｄ ｆｒｏｍ ２６ ℃ ｔｏ ４１ ℃， ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｈｓｐ７０ ａｎｄ ｈｓｐ９０ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ
ｔｈｅｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｔ ３８ ℃， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ７１６􀆰 ４６ ａｎｄ
１０􀆰 ４４ ｔｉｍｅｓ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ １６ ℃ ｔｏ
－ １ ℃， ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｈｓｐ７０ ａｎｄ ｈｓｐ９０ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ａｎｄ
ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｔ － １ ℃， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ３３４􀆰 ５３ ａｎｄ ９􀆰 ３８ ｔｉｍｅｓ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｈｓｐ７０ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｈｓｐ９０ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈｉｎ
ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒａｎｇｅ ｆｒｏｍ － １ ℃ ｔｏ ４１ ℃ ． Ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｓｐ７０ ａｎｄ ｈｓｐ９０ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｐ． ａｓｔｒｉｇｅｒａ
ｗｅｒｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ２６ ℃ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ １７ ℃， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｈｓｐ７０ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｈｓｐ９０ ｇｅｎｅ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｈｓｐ７０ ａｎｄ
ｈｓｐ９０ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｆｕｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎｌｙ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｅｘｔｒｅｍｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｏｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ
ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ ｂｏｄｙ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｃｏｕｌｄ ｏｎｌｙ ｗｏｒｋ ｗｉｔｈｉｎ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｃｏｐｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐａｒｄｏｓａ ａｓｔｒｉｇｅｒａ； ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０； ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０； ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；
ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ
　 　 星豹蛛 Ｐａｒｄｏｓａ ａｓｔｒｉｇｅｒａ Ｌ． Ｋｏｃｈ属蛛形纲蜘蛛
目狼蛛科豹蛛属，是农田捕食性天敌中的优势种，其
种群数量的变化直接影响到害虫的发生数量和为害
程度（上官小霞等，２００２；李生才等，２００６；李锐等，
２０１４）。 温度是影响生物体生存的重要环境因子，
生物体只有在一定的温度范围内才能正常进行物质
能量代谢以维持生命活动，超出这一范围，过高或过
低都会使生物的生长发育停滞甚至死亡。
热激蛋白（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈｓｐ）是指细胞或
生物体受到外界环境的刺激，例如生物、物理（机械
损伤）、化学（紫外线、射线、酸碱、氧化剂）、精神等
刺激后迅速在体内新合成或含量增加的一种保守性
非常高的蛋白质，在生物体内广泛存在（王海鸿和
雷仲仁，２００５）。 当生物体受到外界刺激后，生物体
内氧化 ／抗氧化平衡失调而新合成或合成增加的一
些特异的应答蛋白诱发机体热激应答，热激蛋白的
热激应答能抵御刺激对机体造成的损伤。 根据分子
量不同，可将热激蛋白分为热激蛋白 ９０（ｈｓｐ９０）、热
激蛋白 ７０（ｈｓｐ７０）、热激蛋白 ６０（ｈｓｐ６０）和小分子热
激蛋白（ｓｈｓｐ）等多个家族，ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 是最普遍
的热激蛋白（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，１９９３）。 目前对于昆虫 ｈｓｐ７０
和 ｈｓｐ９０ 的研究最为广泛，如烟粉虱 Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ
（Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ）（韦姣等，２０１４）、莲草直胸跳甲 Ａｇａｓｉ⁃
ｃｌｅｓ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ Ｓｅｌｍａ ＆ Ｖｏｇｔ（贾栋等，２０１４）、白纹伊
蚊 Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ （Ｓｋｕｓｅ） （李玉伟等，２０１４）、小胸
鳖甲 Ｍｉｃｒｏｄｅｒａ ｐｕｎｃｔｉｐｅｎｎｉｓ Ｋａｓｚａｂ（石萌等，２０１４）、
大豆蚜 Ａｐｈｉｓ ｇｌｙｃｉｎｅｓ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ（韩岚岚等，２０１４）等
ｈｓｐ７０ 基因的克隆与表达；桉树枝瘿姬小蜂 Ｌｅｐｔｏｃｙｂｅ
ｉｎｖａｓａ Ｆｉｓｈｅｒ ＆ Ｌａ Ｓａｌｌｅ（卢添财等，２０１４）、灰飞虱
Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ （Ｆａｌｌéｎ） （张青等，２０１４）、苹果
蠹蛾 Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ （Ｌ． ） （申建茹等，２０１１）、马铃
薯甲虫 Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ （ Ｓａｙ） （蒋健等，
２０１３）、三叶斑潜蝇 Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ ｔｒｉｆｏｌｉｉ （Ｂｕｒｇｅｓｓ）（吉青
战等，２０１３）等 ｈｓｐ９０ 基因的克隆与表达。 为明确捕
食性天敌星豹蛛对极端温度的热激应答，本试验通
过温度诱导星豹蛛成蛛，研究热激蛋白 ｈｓｐ７０ 和
ｈｓｐ９０ 基因的表达情况，分析星豹蛛抗高、低温能力
以及 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因的表达在抵御极端温度中
发挥的作用，以期为星豹蛛的适生环境及保护利用
研究提供一定的理论依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试蜘蛛：星豹蛛采自山西省太谷县山西农业
大学果园试验田（３７􀆰 ４３°Ｎ，１１２􀆰 ５８°Ｅ），将采集的星
豹蛛成蛛雌雄分开，单头装入指形管中（内直径 １􀆰 ８
ｃｍ、高 ８ ｃｍ），放入人工气候箱内饲养（Ｌ ∶ Ｄ ＝ １６ ∶
８、ＲＨ ７０％ ），湿棉球保湿，每次喂果蝇 ６ 头，每 ２ ｄ
喂 １ 次，试验前饥饿处理 ２４ ｈ待用。
主要试剂及仪器：动物组织 ＲＮＡ 提取试剂盒、
ＰＣＲ产物纯化试剂、琼脂糖凝胶回收试剂盒、ＴＡ 克
隆试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；
ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、Ｔｒｉｚｏｌ提取试
剂盒、ｃＤＮＡ反转录试剂盒购自日本 ＴａＫａＲａ 公司。
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３０００Ｐ 荧光定量 ＰＣＲ 仪，美国安捷伦
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司，ＰＣＲ 引物由生工生物工程（上海）
股份有限公司合成。 ＬＲＨ⁃１００ＣＢ 低温培养箱，上海
一恒科学仪器有限公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 星豹蛛温度处理及其总 ＲＮＡ的提取
在低温培养箱进行温度诱导处理，设置 ４１、３８、
３５、３２、２９、２６、２３、２０、１７、１４、１１、８、５、２、０、 － １ ℃共
１６ 个温度处理，每个温度处理雌雄星豹蛛各 ３０ 头，
诱导 ２ ｈ。 取出室温恢复 １ ｈ（贾栋等，２０１４），立即
放入液氮中保存，用于 ＲＮＡ 的提取和 ＰＣＲ 扩增。
以 ２０ ℃恒温饲养的星豹蛛作为对照组，每处理重复
３ 次。 将处理过的星豹蛛随机取 ３ 头迅速倒入一盛
有液氮的离心管中，用一次性研磨棒充分研成粉末，
参照 Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｋｉｔ 超纯 ＲＮＡ 提取试剂盒说明
书提取星豹蛛总 ＲＮＡ。
１􀆰 ２􀆰 ２ 单链 ｃＤＮＡ的合成
取 ２ μＬ总 ＲＮＡ，加入 ５ × ｇ ＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ ２
μＬ、ＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ １ μＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ至 １０ μＬ，４２
℃保温 ２ ｍｉｎ。 加入 １ μＬ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ
２２３ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
Ｍｉｘ Ｉ、１ μＬ ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ、４􀆰 ０ μＬ ５ × Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ
Ｂｕｆｆｅｒ ２、４􀆰 ０ μＬ ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ。 混匀，３７ ℃保温
１５ ｍｉｎ，８５ ℃ ５ ｓ，终止反应。
１􀆰 ２􀆰 ３ ＰＣＲ扩增 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因 ｃＤＮＡ片段
利用 ＢＬＡＳＴ分析 ＮＣＢＩ已经登录的其它节肢动
物门的 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 氨基酸序列的保守区域设计
引物（表 １），用于扩增 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因中间片
段。 反应条件：９５ ℃预变性 １０ ｍｉｎ，９５ ℃变性 ３０ ｓ，
５１􀆰 ２ ℃退火 ４０ ｓ（ｈｓｐ７０），４４ ℃退火 １ ｍｉｎ（ｈｓｐ９０），
７２ ℃延伸 ３０ ｓ，３０ 个循环后再 ７２ ℃延伸 ５ ｍｉｎ。 反
应结束后用 １􀆰 ０％的琼脂糖凝胶电泳检查 ＰＣＲ 产
物，回收目的片段进行克隆测序。
表 １ 星豹蛛 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因扩增所用引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｎｄ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ ｏｆ ｈｓｐ７０ ａｎｄ ｈｓｐ９０ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｐａｒｄｏｓａ ａｓｔｒｉｇｅｒａ
名称 Ｎａｍｅ
ＰＣＲ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ
引物序列
产物长度
引物序列
产物长度
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′→３′）
Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓｉｚｅ （ｂｐ） Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ （５′→３′）
Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓｉｚｅ （ｂｐ）
β⁃ａｃｔｉｎ⁃Ｆ ＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＴＣＧＣＧ ２５２ ＧＣＡＡＴＣＣＴＴＣＧＴＴＴＧＧＡＣＴＴ １０２
β⁃ａｃｔｉｎ⁃Ｒ ＡＴＧＴＡＣＧＴＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧ ＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡ
ｈｓｐ７０⁃Ｆ ＧＧＣＡＲＧＣＮＡＣＮＡＡＲＧＡＴＧＣ ６３０ ＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＴＡＣＴＣＡＴＴ １５９
ｈｓｐ７０⁃Ｒ ＧＣＮＡＣＮＧＣＹＴＣＡＴＣＮＧＧＧＴＴ ＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＴＣＡＣＡＡＧ
ｈｓｐ９０⁃Ｆ ＴＧＡＴＨＡＴＨＡＡＣＡＣＮＴＴＣＴＡＹＴＣＮＡＡＹ １ ５００ ＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＧＴＴ １６７
ｈｓｐ９０⁃Ｒ ＴＣＴＴＣＲＣＡＧＴＴＲＴＣＣＡＴＤＡＴＲＡＡ ＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡＴＡ
１􀆰 ２􀆰 ４ 荧光定量 ＰＣＲ反应体系和条件
利用 Ｐｒｉｍｅｒ ５􀆰 ０ 软件分别设计特异引物（表
１），荧光定量 ＰＣＲ 检测使用 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ
ＴＭⅡ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）试剂盒进行。 反应体系为
２５ μＬ： ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＴＭ Ⅱ １２􀆰 ５ μＬ、 １０
μｍｏｌ ／ Ｌ ＰＣＲ上下游引物各 ２ μＬ、ｃＤＮＡ 模板 ２ μＬ、
ｄｄＨ２Ｏ ６􀆰 ５ μＬ。 反应条件：９５ ℃ ３０ ｓ，９５ ℃ ３０ ｓ，５５
℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ３０ ｓ，４０ 个循环；溶解曲线为 ９５ ℃ １
ｍｉｎ，５５ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ３０ ｓ，４０ 个循环。
１􀆰 ３ 数据分析
当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采
用 ２ － ΔΔＣＴ法计算不同处理组中星豹蛛 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０
ｍＲＮＡ相对于对照组的表达量，用 ＳＰＳＳ １９􀆰 ０ 软件
进行单因素方差分析，Ｄｕｎｃａｎ 氏新复极差法检验不
同处理间差异显著性，用 Ｏｒｉｇｉｎ Ｐｒｏ ９􀆰 ０ 软件绘图。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 星豹蛛 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因的扩增结果
星豹蛛 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因扩增片段大小为
６３０ ｂｐ和 １ ５００ ｂｐ，且星豹蛛雌蛛 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基
因扩增产物大于雄蛛（图 １）。
２􀆰 ２ 荧光定量 ＰＣＲ标准曲线的建立
将反转录得到的 ｃＤＮＡ 对内参基因 β⁃ａｃｔｉｎ 进
行 ＰＣＲ扩增，所得标准曲线检测灵敏度为 １０ － ２个模
板，相关系数 Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９６，回归方程 Ｙ ＝ － ３􀆰 ００７ｌｏｇ
（ｘ） ＋ １６􀆰 ８２０，扩增效率为 １１５􀆰 １％ 。 标准曲线相关
性好，与 Ｃｔ值之间呈良好的线性关系（图 ２），且扩
图 １ 星豹蛛 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因电泳图
Ｆｉｇ． １ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｈｓｐ７０ ａｎｄ
ｈｓｐ９０ ｉｎ Ｐａｒｄｏｓａ ａｓｔｒｉｇｅｒａ
Ｍ： 蛋白质分子质量标准； １： 雄蛛 ｈｓｐ７０ 基因； ２：
雌蛛 ｈｓｐ７０ 基因； ３： 雄蛛 ｈｓｐ９０ 基因； ４： 雌蛛 ｈｓｐ９０ 基
因。 Ｍ： Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒ； １： ｈｓｐ７０ ｇｅｎｅ
（♂）； ２： ｈｓｐ７０ ｇｅｎｅ （♀）； ３： ｈｓｐ９０ ｇｅｎｅ （♂）； ４：
ｈｓｐ９０ ｇｅｎｅ （♀）．
　
增效率在 ８０％ ～１２０％之间，可用于定量研究。
２􀆰 ３ 温度对星豹蛛 ｈｓｐ７０和 ｈｓｐ９０表达量的影响
当处理温度在 １７、２０、２３、２６ ℃时，星豹蛛 ｈｓｐ７０
和 ｈｓｐ９０ 基因表达量较低，与对照组差异不显著；随
着温度的升高，在 ２９ ～ ４１ ℃的高温范围内，ｈｓｐ７０ 和
ｈｓｐ９０ 基因相对表达量与对照组差异极显著（Ｐ ＜
０􀆰 ０１），且随着温度的升高表达量出现先上升后下
降的变化趋势，在 ３８ ℃时最高，是对照组的 ７１６􀆰 ４６
和 １０􀆰 ４４ 倍；随着温度的降低，在 １４ ～ － １ ℃的低温
范围内，ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因相对表达量与对照组差
３２３３ 期 李　 锐等： 温度诱导对星豹蛛热激蛋白 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因表达的影响
　 　 　
图 ２ 星豹蛛荧光定量 β⁃ａｃｔｉｎ标准曲线及扩增曲线
Ｆｉｇ． ２ Ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｌｏｔ ｏｆ
β⁃ａｃｔｉｎ ｉｎ Ｐａｒｄｏｓａ ａｓｔｒｉｇｅｒａ
Ａ ～ Ｅ： β⁃ａｃｔｉｎ的 ｃＤＮＡ稀释倍数为 １０２、１０３、１０４、１０５、
１０６。 Ａ － Ｅ： Ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ β⁃ａｃｔｉｎ ｃＤＮＡ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ
ｔｉｍｅｓ （１０２， １０３， １０４， １０５， ａｎｄ １０６， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．
　
图 ３ 温度对星豹蛛 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因表达量的影响
Ｆｉｇ． ３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｓｐ７０ ａｎｄ ｈｓｐ９０ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｐａｒｄｏｓａ ａｓｔｒｉｇｅｒａ
图中数据为平均数 ±标准误。 同色柱上不同小写字母表示经 Ｄｕｎｃａｎ 氏新复极差法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０１ 水平差异显著。
Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＥ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｏｒ ｂａｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０１ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ
ｎｅｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ． 　
异极显著（Ｐ ＜ ０􀆰 ０１），且随着温度的降低表达量逐
渐升高，在 － １ ℃时最高，为对照组的 ３３４􀆰 ５３ 和
９􀆰 ３８ 倍（图 ３）。
３ 讨论
生物体抗逆性的强弱跟热激蛋白的多少密切相
关。 当生物体用亚致死高温预处理后可以在一定程
度上抵抗致死高温对生物体的影响，这种称为耐热
性，而且耐热性的速度与热激蛋白积累的速度成正
比，随着热激蛋白的大量积累，耐热性增强，反之耐
热性降低（刘佳等，２０１４）。 本研究结果表明，星豹
蛛在 １７ ～ ２６ ℃温度作用下，经 ２ ｈ 诱导后，与未经
处理的 ２０ ℃常温饲养的星豹蛛相比，热激蛋白
ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因表达量相对较少；当超出这一温
度范围后，ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 表达量均逐渐增加，在 ３８
℃时最高，分别为对照组的 ７１６􀆰 ４６ 和 １０􀆰 ４４ 倍；且
ｈｓｐ７０ 的表达量远高于 ｈｓｐ９０。 这与其它生物中的研
究结果相似，如杨丽红等（２０１１）研究的柑橘全爪螨
Ｐａｎｏｎｃｈｕｓ ｃｉｔｒｉ Ｍｃ Ｇｒｅｇｏｒ在 ４１ ℃时 ｈｓｐ７０ 表达量为
对照的 ２８􀆰 ３７ 倍，ｈｓｐ９０ 表达量为对照的 ６􀆰 ７５ 倍；翟
会芳（２０１０）发现同龄甜菜夜蛾 Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ
Ｈüｂｎｅｒ在相同温度诱导下 ｈｓｐ７０ 表达量为对照组的
２ ０００ 倍，ｈｓｐ９０ 表达量是对照组的 ６ ～ ８ 倍；郑国湾
（２０１２）研究的福寿螺 Ｐｏｍａｃｅａ ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔａ （Ｌａｍａ⁃
ｒｃｋ）在３９ ℃诱导后 ｈｓｐ７０ 表达量增加了 ８ ０００ 多
倍，ｈｓｐ９０ 表达量增加了 ９ 倍多。
本试验研究了 － １ ～ ４１ ℃范围内的温度对星豹
蛛 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因表达量的影响，把 － １ ～ １４ ℃
设为低适温区，１７ ～ ２６ ℃设为最适温区，２９ ～ ４１ ℃
设为高适温区，在最适温区星豹蛛热激蛋白 ｈｓｐ７０
和 ｈｓｐ９０ 基因表达量较低，当超出这一温度范围后，
ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因随着温度的升高和降低表达量
逐渐增大，且在 ３８ ℃和 － １ ℃达到最高。 这说明热
激蛋白基因表达量不仅在高温区随温度升高而表达
增加，且在低温区随温度降低表达量也增加；表明高
４２３ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
温诱导可增加热激蛋白基因表达量，从而提高星豹
蛛的耐热性；低温诱导可增加热激蛋白基因表达量，
从而提高星豹蛛的耐寒性。 分析原因可能与不同的
热激蛋白功能有一定的关系。 热激蛋白分为组成型
和诱导型热激蛋白，一般组成型热激蛋白在没有外
界诱导时就能够有一定量的表达，而诱导型热激蛋
白只有受到诱导后才会非常快速地大量增加
（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６）。 星豹蛛的 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因属
于诱导型热激蛋白，通过温度诱导热激蛋白在星豹
蛛体内大量积累，可以使其迅速适应外界环境的变
化，避免受到胁迫因子对自身的伤害。
星豹蛛是一种农林害虫重要的捕食性天敌，具
有较强的生态适应性，对高、低温等不良环境具有较
强的耐受性。 本试验克隆了星豹蛛 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０
基因序列，构建了实时荧光定量 ＰＣＲ 体系，检测了
－ １ ～ ４１ ℃温度下 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因的表达水平，
阐明了 ｈｓｐ７０ 和 ｈｓｐ９０ 基因的表达与其对极端温度
的耐受能力之间的关系。 而关于热激蛋白基因表达
与星豹蛛抗逆、耐逆能力之间的关系，及其对星豹蛛
生长发育及生殖的影响尚需进一步深入研究。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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（责任编辑：李美娟）
６２３ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷