全 文 ：草莓镶脉病毒 韵砸云 遇基因的原核
表达与抗血清制备
江摇 彤员 摇 谢朝阳员 摇 丁摇 菲圆 摇 李祥宇员 摇 贾摇 琳圆
渊员援安徽农业大学植物保护学院袁 合肥 圆猿园园猿远曰 圆援山东德州经济开发区东艺园林有限公司袁 德州 圆缘猿园园园冤
摘要院 为了分析草莓镶脉病毒渊杂贼则葬憎遭藻则则赠 增藻蚤灶 遭葬灶凿蚤灶早 增蚤则怎泽袁 杂灾月灾冤韵砸云 遇基因的功能袁采用原核
表达技术获得该基因表达的重组蛋白并制备其抗血清遥 利用 孕悦砸 技术扩增得到 杂灾月灾 中国分离
物的 韵砸云 遇基因袁将此基因克隆到原核表达载体 责耘栽鄄杂哉酝韵 上袁获得重组质粒 责耘栽鄄杂哉酝韵鄄韵砸云
遇遥 转化大肠杆菌 月蕴圆员渊阅耘猿冤后袁经 陨孕栽郧诱导与 晕蚤圆 垣 鄄晕栽粤亲和柱纯化袁获得分子质量约为 怨园 噪阅
的重组蛋白遥 以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清袁采用间接 耘蕴陨杂粤和宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼方法
测定抗血清的效价尧反应灵敏度以及 韵砸云 遇基因在本氏烟中的瞬时表达遥 结果显示袁间接 耘蕴陨杂粤
法测定抗血清对重组蛋白的效价达 员 颐 圆缘远 园园园袁宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 法能够检测到稀释 远源 园园园 倍的重组蛋
白遥 利用稀释 圆 园园园 倍的抗血清袁仍能够检测出 杂灾月灾 中国分离物和美国分离物 韵砸云 遇基因在本
氏烟中瞬时表达的蛋白遥
关键词院 草莓镶脉病毒曰 韵砸云 遇基因曰 原核表达曰 抗血清
孕则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶凿 葬灶贼蚤泽藻则怎皂 责则藻责葬则葬贼蚤燥灶 燥枣 韵砸云 遇
藻灶糟燥凿藻凿 遭赠 杂贼则葬憎遭藻则则赠 增藻蚤灶 遭葬灶凿蚤灶早 增蚤则怎泽
允蚤葬灶早 栽燥灶早员 摇 载蚤藻 在澡葬燥赠葬灶早员 摇 阅蚤灶早 云藻蚤圆 摇 蕴蚤 载蚤葬灶早赠怎员 摇 允蚤葬 蕴蚤灶圆
渊员援 悦燥造造藻早藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 粤灶澡怎蚤 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀藻枣藻蚤 圆猿园园猿远袁 粤灶澡怎蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 阅燥灶早赠蚤
蕴葬灶凿泽糟葬责藻 悦燥援 袁 蕴贼凿援 袁 阅藻扎澡燥怎 耘糟燥灶燥皂蚤糟 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 在燥灶藻袁 阅藻扎澡燥怎 圆缘猿园园园袁 杂澡葬灶凿燥灶早 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 陨灶 燥则凿藻则 贼燥 葬灶葬造赠扎藻 贼澡藻 枣怎灶糟贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 早藻灶藻 韵砸云 遇 燥枣 杂贼则葬憎遭藻则则赠 增藻蚤灶 遭葬灶凿蚤灶早 增蚤则怎泽 渊杂灾月灾冤袁
则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶 藻曾责则藻泽泽藻凿 遭赠 贼澡藻 早藻灶藻 憎葬泽 燥遭贼葬蚤灶藻凿 怎泽蚤灶早 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 贼藻糟澡灶蚤择怎藻援 郧藻灶藻
韵砸云 遇 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻 蚤泽燥造葬贼藻 燥枣 杂灾月灾 憎葬泽 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 遭赠 孕悦砸援 栽澡蚤泽 早藻灶藻 憎葬泽 糟造燥灶藻凿 蚤灶贼燥 责则燥噪葬则赠燥贼藻 藻曾责则藻泽鄄
泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 责耘栽鄄杂哉酝韵援 粤枣贼藻则 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责耘栽鄄杂哉酝韵鄄韵砸云 遇 憎葬泽 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 蚤灶贼燥 耘泽糟澡藻鄄
则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 月蕴圆员 渊阅耘猿冤袁 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶 憎蚤贼澡 葬灶 葬责责则燥曾蚤皂葬贼藻 皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 燥枣 怨园 噪阅 憎葬泽 燥遭鄄
贼葬蚤灶藻凿 憎蚤贼澡 陨孕栽郧 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 葬灶凿 晕蚤圆 垣 鄄晕栽粤 葬枣枣蚤灶蚤贼赠 糟燥造怎皂灶 责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶援 粤灶贼蚤泽藻则怎皂 憎葬泽 责则藻责葬则藻凿 怎泽蚤灶早
责怎则藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶 葬泽 葬灶贼蚤早藻灶 贼燥 蚤皂皂怎灶蚤扎藻 则葬遭遭蚤贼泽援 栽蚤贼藻则 葬灶凿 则藻葬糟贼蚤燥灶 泽藻灶泽蚤贼蚤增蚤贼赠 燥枣 贼澡藻 葬灶贼蚤泽藻则怎皂袁
葬灶凿 贼澡藻 贼则葬灶泽蚤藻灶贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 早藻灶藻 韵砸云 遇 蚤灶 晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬 憎葬泽 葬泽泽葬赠藻凿 遭赠 蚤灶凿蚤则藻糟贼鄄耘蕴陨杂粤
葬灶凿 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 皂藻贼澡燥凿援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 贼蚤贼藻则 燥枣 葬灶贼蚤泽藻则怎皂 贼燥 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶 则藻葬糟澡藻凿
员 颐 圆缘远 园园园 遭赠 蚤灶凿蚤则藻糟贼鄄耘蕴陨杂粤 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶袁 葬灶凿 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶 葬贼 葬 凿蚤造怎贼蚤燥灶 燥枣 员 颐 远源 园园园 糟燥怎造凿 遭藻
凿藻贼藻糟贼藻凿 憎蚤贼澡 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 皂藻贼澡燥凿援 酝燥则藻燥增藻则袁 贼澡藻 贼则葬灶泽蚤藻灶贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 早藻灶藻 韵砸云 遇 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻
蚤泽燥造葬贼藻 葬灶凿 粤皂藻则蚤糟葬灶 蚤泽燥造葬贼藻 燥枣 杂灾月灾 蚤灶 晕援 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬 糟燥怎造凿 遭藻 凿藻贼藻糟贼藻凿 憎蚤贼澡 蚤灶凿蚤则藻糟贼鄄耘蕴陨杂粤 怎泽蚤灶早
圆 园园园 贼蚤皂藻泽 凿蚤造怎贼藻凿 葬灶贼蚤泽藻则怎皂援
运藻赠 憎燥则凿泽院 杂贼则葬憎遭藻则则赠 增藻蚤灶 遭葬灶凿蚤灶早 增蚤则怎泽曰 早藻灶藻 韵砸云 遇曰 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶曰 葬灶贼蚤泽藻则怎皂
基金项目院 国家自然科学基金 渊猿员猿苑员怨员缘冤袁安徽省科技厅自然科学基金渊员员园源园远园远酝远愿冤袁安徽省教育厅自然科学基金重点项目渊运允圆园员圆粤员员猿冤
作者简介院 江彤袁男袁员怨苑园年生袁副教授袁研究方向为植物病毒学袁 耘鄄皂葬蚤造院 躁蚤葬灶早贼燥灶早源远缘园岳 泽蚤灶葬援 糟燥皂
收稿日期院 圆园员猿 原 园源 原 园源
第 源园 卷摇 第 远 期
圆园员猿 年摇 员圆 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源园摇 晕燥援 远
阅藻糟援 摇 圆园员猿
摇 摇 草莓镶脉病毒 渊 杂贼则葬憎遭藻则则赠 增藻蚤灶 遭葬灶凿蚤灶早 增蚤则怎泽袁
杂灾月灾冤属于花椰菜花叶病毒科 悦葬怎造蚤皂燥增蚤凿葬藻花椰菜
花叶病毒属 悦葬怎造蚤皂燥增蚤则怎泽咱员暂 袁是危害草莓的一种潜隐
性病毒袁该病毒可以通过嫁接传染或通过蚜虫以非
持久性方式传播咱圆暂 遥 杂灾月灾侵染草莓后削弱植株生
长势尧降低草莓的产量和品质袁给草莓生产造成严重
损失咱猿暂 遥 杂灾月灾分布广泛袁欧美尧澳大利亚尧日本等
国家和地区相继开展 杂灾月灾 研究工作咱源 原 缘暂 袁我国河
北尧河南尧吉林尧辽宁等省也都有关于 杂灾月灾 危害的
报道咱远 原 愿暂 遥
杂灾月灾病毒粒子球状袁直径 源缘 耀 缘园 灶皂袁基因组
为环状 凿泽阅晕粤咱员暂 遥 迄今为止袁国内尚未见 杂灾月灾 中
国分离物全序列报道咱怨暂 遥 全世界只测定了一个来
自美国加州的 杂灾月灾 分离物全长序列袁该基因组全
长 苑 愿苑远 遭责袁 包含 苑 个开放阅读框 渊 燥责藻灶 则藻葬凿蚤灶早
枣则葬皂藻袁 韵砸云冤袁分别编码不同的功能蛋白咱员园暂 遥 有关
杂灾月灾各个 韵砸云 的功能研究尚未见报道袁其功能只
能根据花椰菜花叶病毒属其它成员相应 韵砸云 的功
能进行推测遥 韵砸云玉编码病毒的移动蛋白袁与病毒
在寄主细胞间的移动有关曰韵砸云 域编码蚜传蛋白曰
韵砸云 芋编码一个非特异性的 阅晕粤 结合蛋白曰韵砸云
郁编码外壳蛋白渊糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶袁 悦孕冤袁参与病毒的组
装和包裹曰韵砸云吁编码逆转录酶蛋白与核糖核酸酶
匀袁参与病毒的复制和基因组的扩增曰韵砸云 遇编码病
毒粒子包涵体基质蛋白袁可能与病毒的致病性有关曰
而 韵砸云 喻编码蛋白的功能尚不清楚咱员员 原 员圆暂 遥
杂灾月灾侵染植物后出现其特有的发病症状袁这
是由于该病毒的基因组结构中袁存在决定侵染后病
毒症状的基因袁即症状决定子咱员猿暂 遥 阅侏葬扎鄄孕藻灶凿佼灶 驭
阅蚤灶早咱员源暂研究发现袁马铃薯 再 病毒渊孕燥贼葬贼燥 增蚤则怎泽 再袁
孕灾再冤的 匀悦鄄孕则燥尧黄瓜花叶病毒渊悦怎糟怎皂遭藻则 皂燥泽葬蚤糟 增蚤鄄
则怎泽袁 悦酝灾冤的 圆遭 和番茄丛矮病毒 渊 栽燥皂葬贼燥 遭怎泽澡赠
泽贼怎灶贼 增蚤则怎泽袁 栽月杂灾冤的 孕员怨尧双生病毒的 茁悦员 蛋白等
均是症状决定子遥 月葬怎早澡皂葬灶 等咱员缘暂 研究认为袁与
杂灾月灾同属的花椰菜花叶病毒渊悦葬酝灾冤 韵砸云 遇编码
的 孕远 蛋白也是症状决定子袁将来源于 悦葬酝灾不同株
系的 孕远 分别转入烟草袁分别表现花叶和均匀白化症
状袁而且转基因植株症状严重度和 孕远 表达水平密切
相关袁孕远 表达水平越高袁症状表型越重遥 因此袁推测
杂灾月灾的 韵砸云 遇也编码 员 个多功能蛋白袁该蛋白极
可能扮演同样的角色袁在 杂灾月灾 侵染及增殖过程中
必不可少袁且与病毒的致病性密切相关遥 因此袁深入
研究 杂灾月灾 韵砸云 遇编码的 孕远 蛋白功能袁对阐明病
毒在寄主体内的致病机制具有重要意义遥 本研究拟
克隆 杂灾月灾 中国分离物的 韵砸云 遇基因袁再以 韵砸云
遇基因的原核表达产物为抗原制备抗血清袁为深入
研究该基因的编码蛋白功能奠定基础遥
员 材料与方法
员援 员 材料
酶及生化试剂院限制性内切酶尧栽源鄄阅晕粤 连接
酶尧蕴粤 栽葬择 阅晕粤 聚合酶购自 栽葬运葬砸葬 公司曰晕蚤圆 垣 鄄
晕栽粤亲和层析柱购自 匝蚤葬郧藻灶 公司曰硝酸纤维素膜
购自 粤皂藻则泽澡葬皂 孕澡葬则皂葬糟蚤葬 公司曰碱性磷酸酶标记的
抗鼠 陨早郧二抗尧远 伊 匀蚤泽单克隆抗体尧碱性磷酸酯酶标
记的羊抗兔 陨早郧和 陨孕栽郧均购自 杂蚤早皂葬 公司曰孕悦砸凝
胶回收试剂盒尧质粒提取试剂盒购自天根生化科技
公司曰其余试剂均为分析纯遥
质粒尧菌株尧毒源和供试植物院克隆载体 责酝阅员愿鄄
栽 泽蚤皂责造藻 增藻糟贼燥则购自大连宝生物公司曰原核表达载体
责耘栽鄄杂哉酝韵由安徽农业大学生命科学院范军教授惠
赠曰双元表达载体 责悦粤酝圆猿园园尧分别含有 杂灾月灾 中国
分离物和美国分离物 韵砸云 遇基因插入 责悦粤酝圆猿园园
构建的重组表达载体 责悦粤酝 悦匀鄄韵砸云 遇和 责悦粤酝
哉杂鄄韵砸云 遇的农杆菌尧大肠杆菌 阅匀 缘琢尧大肠杆菌
月蕴圆员渊阅耘猿冤尧感染 杂灾月灾 的草莓叶片和本氏烟 晕蚤糟鄄
燥贼蚤葬灶葬 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬 均由安徽农业大学病毒实验室
保存遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 杂灾月灾 韵砸云 遇基因的克隆及表达载体的构建
根据本实验室已报道的 杂灾月灾中国分离物 韵砸云
遇基因序列渊登录号院云酝怨怨怨苑圆远冤设计引物遥 为了便
于表达载体的构建袁上游引物 缘忆端引入 月葬皂匀玉位
点袁 悦匀鄄孕远鄄云院 缘忆鄄郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧粤郧悦粤粤郧悦悦悦栽郧粤鄄
猿忆曰下游引物 缘忆端引入 杂葬造玉位点袁悦匀鄄孕远鄄砸院 缘忆鄄
郧栽悦郧粤悦悦栽粤悦粤栽栽粤栽栽栽悦栽栽悦粤栽粤郧悦栽鄄猿忆遥 引 物 由
上海英潍捷基生物技术有限公司合成遥
以提取的感染 杂灾月灾的草莓总 阅晕粤为模板袁利
用引物 悦匀鄄孕远鄄云尧悦匀鄄孕远鄄砸 进行 孕悦砸 扩增遥 孕悦砸 反
应条件院怨源 益 源 皂蚤灶袁怨源 益 源缘 泽袁缘缘 益 源缘 泽袁苑圆 益 怨园
泽袁 猿园个循环 曰 苑圆 益延伸员 园 皂蚤灶 遥孕悦砸产物进行
园援 愿豫琼脂糖凝胶电泳袁割胶纯化回收目的 阅晕粤 片
段遥 纯化产物与 责酝阅员愿鄄栽 连接袁转化大肠杆菌
阅匀缘琢袁菌落 孕悦砸筛选阳性克隆袁由上海英潍捷基生
物公司测序遥
月葬皂匀玉和 杂葬造玉双酶切重组质粒袁回收的 韵砸云
猿员缘远 期 江摇 彤等院草莓镶脉病毒 韵砸云 遇基因的原核表达与抗血清制备
遇基因片段与同样双酶切的责耘栽鄄杂哉酝韵表达载体
连接袁转化大肠杆菌阅匀缘琢遥孕悦砸筛选阳性克隆袁第
圆 次测序验证重组原核表达载体 责耘栽鄄韵砸云 遇携带
的 韵砸云 遇基因序列是否发生突变遥
员援 圆援 圆 重组蛋白的表达尧纯化与检测
重组质粒 责耘栽鄄韵砸云 遇转化大肠杆菌 月蕴圆员
渊阅耘猿冤袁筛选阳性克隆遥 挑取单菌落接种于含有
员园园 滋早 辕 皂蕴 氨苄青霉素的 蕴月液体培养基袁猿苑益培养
员圆 澡袁再转接至新鲜的 蕴月液体培养基袁培养至 韵阅值
达到 园援 远 左右遥 以 园援 缘 皂燥蕴 辕 蕴的 陨孕栽郧 诱导培养 源愿
澡袁集菌并超声破碎 缘 皂蚤灶袁缘园园园 则 辕 皂蚤灶离心 员园 皂蚤灶袁取
上清加入 园援 缘 皂蕴的 晕蚤圆 垣 鄄晕栽粤 琼脂糖袁经 晕蚤圆 垣 鄄晕栽粤
亲和层析柱纯化得到重组蛋白遥
收集未诱导的含空载体 责耘栽鄄杂哉酝韵 和诱导的
含空载体 责耘栽鄄杂哉酝韵 的大肠杆菌袁以及未诱导的含
重组质粒 责耘栽鄄韵砸云 遇和诱导的含重组质粒 责耘栽鄄
韵砸云 遇的大肠杆菌菌体袁分别加入 愿园 滋蕴 孕月杂 缓冲
液重悬浮袁再加入 圆园 滋蕴 缘 伊上样缓冲液袁煮沸后置
冰上 员园 皂蚤灶袁员圆园园园 则 辕 皂蚤灶离心 员园 皂蚤灶袁取上清液作为
电泳上样样品遥 纯化的重组蛋白同样经重悬浮尧煮
沸尧冰浴制备上样样品遥 制备两块 员圆援 缘豫 杂阅杂鄄
孕粤郧耘凝胶袁一块凝胶电泳后直接染色并观察结果袁
另一块电泳后转印硝酸纤维素膜进行 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼
分析遥 转印后的硝酸纤维素膜用 缘豫脱脂奶粉液 圆缘
益封闭 圆 澡袁远 伊 匀蚤泽 单克隆抗体作为一抗渊员 颐 圆 园园园
稀释冤袁圆缘益孵育 员 澡袁孕月杂栽缓冲液洗涤 缘 次后袁用碱
性磷酸酶标记的羊抗鼠 陨早郧 作为二抗渊员 颐 圆 园园园 稀
释冤袁圆缘 益孵育 圆 澡袁孕月杂栽洗涤 缘 次后袁用 晕月栽 辕 月悦陨孕
充分显色袁终止反应后拍片保存遥
员援 圆援 猿 重组蛋白抗血清的制备
用纯化的重组蛋白免疫雄性新西兰大白兔袁共
免疫 缘 次袁每次免疫的蛋白量为 园援 缘 皂早遥 第 员尧圆 次
按 员皂早 辕 皂蕴分别与等体积的弗氏完全佐剂和弗氏不
完全佐剂混合袁皮下多点注射曰第 猿 耀缘 次按照 员 皂早 辕
皂蕴分别与等体积的 园援 怨豫生理盐水混合袁腿部两侧
肌肉注射遥 每次免疫间隔时间为 猿 周袁第 缘 次免疫
苑 凿后取血并分离血清袁分装后 原 愿园 益保存遥
员援 圆援 源 抗血清效价及其反应灵敏度的测定
抗血清效价院采用间接 耘蕴陨杂粤 测定袁先用稀释
缓冲液倍比稀释抗血清袁再将纯化的重组蛋白稀释
员 园园园 倍作为抗原进行血清学反应遥
反应灵敏度院先用稀释缓冲液倍比稀释纯化
的重组蛋白袁再用稀释 圆 园园园 倍的抗血清作为一抗
渊员 颐 员冤进行 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼分析袁以验证抗血清与不同
浓度纯化重组蛋白反应的灵敏度袁方法同 员援 圆援 圆遥
员援 圆援 缘 杂灾月灾 韵砸云 遇基因在本氏烟中的瞬时表达
含重组表达载体 责悦粤酝 悦匀鄄韵砸云 遇和 责悦粤酝
哉杂鄄韵砸云 遇的农杆菌分别浸润本氏烟叶片遥 浸润 远 凿
后采样袁每克新鲜样本加入 圆 皂蕴 提取缓冲液研磨袁
室温下 员园 园园园 则 辕 皂蚤灶离心 员园 皂蚤灶袁取上清液待测遥 阳
性对照为稀释 员 园园园 倍的重组蛋白袁阴性对照为未
浸润本氏烟叶片提取液 遥将制备的抗血清稀释
圆 园园园 倍袁间接 耘蕴陨杂粤 检测 杂灾月灾 中国分离物和
杂灾月灾美国分离物 韵砸云 遇基因在本氏烟中瞬时表达
的蛋白水平遥
圆 结果与分析
圆援 员 杂灾月灾 韵砸云 遇基因的克隆
以提取的感染 杂灾月灾的草莓总 阅晕粤为模板袁用
引物 悦匀鄄孕远鄄云尧悦匀鄄孕远鄄砸进行 孕悦砸扩增袁可以得到 员
条约 员援 缘 噪遭的特异性扩增条带袁条带大小与预期结
果相符渊图 员冤遥 克隆并测序袁证明插入 责酝阅员愿鄄栽 的
韵砸云 遇基因序列没有发生变异遥
图 员 杂灾月灾 韵砸云 遇基因的 孕悦砸产物
云蚤早援 员 孕悦砸 责则燥凿怎糟贼泽 燥枣 早藻灶藻 韵砸云 遇 燥枣 杂灾月灾
摇 摇 酝院阅晕粤分子量标准曰员 耀 圆院杂灾月灾 韵砸云 遇曰猿院阴性对照遥 酝院
阅晕粤 皂葬则噪藻则曰 员 原 圆院 杂灾月灾 韵砸云 遇曰 猿院 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造援
圆援 圆 重组原核表达载体的酶切鉴定
重组原核表达载体 责耘栽鄄韵砸云 遇经双酶切体系
验证袁酶切片段大小符合理论值渊图 圆冤袁说明插入的
韵砸云 遇基因读码框正确遥 第 圆 次测序进一步验证
韵砸云 遇基因序列未发生突变遥
圆援 猿 重组蛋白的诱导表达与纯化
杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳检测纯化的重组蛋白袁在约 怨园
噪阅处出现 员 条明显的诱导表达条带渊图 猿鄄葬冤袁与预
期结果一致遥 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 分析显示袁匀蚤泽 单抗能与
诱导的 责耘栽鄄韵砸云 遇表达的重组蛋白发生特异反应袁
而与未诱导的 责耘栽鄄杂哉酝韵 空载体宿主菌尧诱导的
责耘栽鄄杂哉酝韵 空载体宿主菌和未诱导的 责耘栽鄄 韵砸云 遇
源员缘 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
图 圆 重组质粒 责耘栽鄄韵砸云 遇的限制性酶切电泳图谱
云蚤早援 圆 耘造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽 责葬贼贼藻则灶泽 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼
责造葬泽皂蚤凿 责耘栽鄄韵砸云 遇 凿蚤早藻泽贼藻凿 憎蚤贼澡 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶
藻灶凿燥灶怎糟造藻葬泽藻 藻灶扎赠皂藻泽
摇 摇 酝 院阅晕粤分子量标准 曰员 院月葬皂匀玉和 杂葬造玉双酶切 责耘栽 鄄
韵砸云 遇曰圆院重组质粒 责耘栽鄄韵砸云 遇遥 酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则曰 员院 则藻糟燥皂遭蚤鄄
灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 凿蚤早藻泽贼藻凿 憎蚤贼澡 月葬皂匀玉葬灶凿 杂葬造玉曰 圆院 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽鄄
皂蚤凿 责耘栽鄄韵砸云 遇援
图 猿 重组蛋白的 杂阅杂鄄孕粤郧耘 渊葬冤和
宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 渊遭冤分析
云蚤早援 猿 杂阅杂鄄孕粤郧耘 渊葬冤 葬灶凿 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 渊遭冤
葬灶葬造赠泽藻泽 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶
摇 摇 酝院蛋白分子量标准曰员院未诱导的含 责耘栽鄄杂哉酝韵空载体的宿
主菌曰圆院诱导的含 责耘栽鄄杂哉酝韵空载体的宿主菌曰猿院未诱导的 责耘栽鄄
韵砸云 遇曰源院诱导的 责耘栽鄄韵砸云 遇曰缘院纯化的重组蛋白遥 酝院 孕则燥贼藻蚤灶
皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 皂葬则噪藻则曰 员院 责耘栽鄄杂哉酝韵 增藻糟贼燥则 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 月蕴圆员
渊阅耘猿冤 憎蚤贼澡燥怎贼 陨孕栽郧 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶曰 圆院 责耘栽鄄杂哉酝韵 增藻糟贼燥则 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿
月蕴圆员 渊阅耘猿冤 憎蚤贼澡 陨孕栽郧 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶曰 猿院 责耘栽鄄韵砸云 遇 憎蚤贼澡燥怎贼 陨孕栽郧
蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶曰 源院 责耘栽鄄韵砸云 遇 憎蚤贼澡 陨孕栽郧 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶曰 缘院 责怎则蚤枣蚤藻凿 则藻糟燥皂鄄
遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶援
均无特异性反应渊图 猿鄄遭冤遥 表明经过原核表达与纯
化袁得到 杂灾月灾 韵砸云 遇基因表达的融合蛋白遥
圆援 源 抗血清效价及其反应灵敏度
间接 耘蕴陨杂粤检测发现抗血清进行 员 颐 圆缘远 园园园 稀
释时袁仍表现出明显的阳性反应渊样品 阅源园缘 辕阴性对
照 阅源园缘 跃 圆冤袁表明制备的抗血清效价较高遥宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼分析显示袁在 怨园 噪阅 处均有 员 条明
显的特异性条带袁其清晰度随着重组蛋白稀释度的
降低而减弱袁重组蛋白稀释 远源 园园园 倍时袁仍能检测
到 员 条较为清晰的条带渊图 源冤袁表明制备的抗血清
反应灵敏度较高袁能够检测到极低浓度的重组蛋白遥
图 源 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼检测抗血清与重组蛋白的反应灵敏度
云蚤早援 源 砸藻葬糟贼蚤燥灶 泽藻灶泽蚤贼蚤增蚤贼赠 燥枣 贼澡藻 责则藻责葬则藻凿 葬灶贼蚤泽藻则怎皂 葬灶凿
则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶 憎葬泽 凿藻贼藻糟贼藻凿 憎蚤贼澡 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼
摇 摇 酝院蛋白分子量标准曰员 耀 缘院纯化的重组蛋白分别稀释 源 园园园尧
愿园园园尧员远 园园园尧猿圆 园园园 和 远源 园园园 倍遥 酝院 孕则燥贼藻蚤灶 皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼
皂葬则噪藻则曰 员 原 缘院 责怎则蚤枣蚤藻凿 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶 葬贼 葬 凿蚤造怎贼蚤燥灶 燥枣 员 颐 源园园园袁
员 颐 愿园园园袁 员 颐 员远 园园园袁 员 颐 猿圆 园园园 葬灶凿 员 颐 远源 园园园援
圆援 缘 杂灾月灾 韵砸云 遇基因在本氏烟中的表达
用制备的抗血清检测 杂灾月灾中国分离物和美国
分离物 韵砸云 遇基因在本氏烟中的瞬时表达遥 抗血
清与 圆 个 杂灾月灾 韵砸云 遇基因瞬时表达的蛋白均表现
出较强的阳性反应袁责悦粤酝 悦匀鄄韵砸云 遇和 责悦粤酝 哉杂鄄
韵砸云 遇瞬时浸润本氏烟的阅源园缘分别为员 援 园 苑 缘和园援 苑怨远袁达到未浸润本氏烟 阅源园缘 渊园援 圆圆远冤的 源援 愿 倍和猿援 缘 倍遥 表明制备的抗血清在 圆 园园园 倍的稀释度下袁
仍可以检测到 圆 个 杂灾月灾 韵砸云 遇基因在本氏烟中瞬
时表达的蛋白袁而且 杂灾月灾中国分离物 韵砸云 遇基因
瞬时表达的血清学反应强度高于 杂灾月灾美国分
离物遥
猿 讨论
目前袁悦葬酝灾 韵砸云 遇编码的 孕远 蛋白功能报道较
多袁并已证明 悦葬酝灾 孕远 是一个多功能蛋白遥 砸赠葬遭燥鄄
增葬等咱员远暂研究发现袁悦葬酝灾 孕远 蛋白是一个翻译再起
始的反式激活因子袁与病毒 原寄主互作的专化性有
关曰悦葬酝灾 孕远 蛋白能够与其 韵砸云玉编码的 孕员 蛋白
渊酝孕冤发生互作袁共同参与病毒在寄主体内富集和传
播咱员苑暂 遥 尤其是 悦葬酝灾的致病性与其 孕远 蛋白的表达
水平密切相关袁悦葬酝灾不同株系的孕远诱导的症状类
缘员缘远 期 江摇 彤等院草莓镶脉病毒 韵砸云 遇基因的原核表达与抗血清制备
型和严重程度不同袁而且 孕远 表达水平越高袁症状表
型越重咱员愿暂 遥 另外袁悦葬酝灾 孕远 蛋白还是一个 砸晕粤 沉
默抑制子咱员怨暂 遥 杂灾月灾在寄主体内的致病机制可能与
悦葬酝灾类似袁本实验室在 圆园员员 年已克隆了 杂灾月灾 中
国分离物 韵砸云 遇基因咱怨暂 袁研究证明 杂灾月灾 韵砸云 遇基
因编码的 孕远 蛋白与病毒的致病性相关袁且是一个
砸晕粤沉默抑制子遥 本研究利用大肠杆菌高效表达
了 杂灾月灾 韵砸云 遇基因袁获得了纯化的重组蛋白袁并
制备了特异性抗血清袁不仅可以分析 孕远 蛋白表达水
平与症状严重度以及与其沉默效率的关系袁还可以
进行蛋白原位杂交尧胶体金免疫定位以及 孕远 与寄主
蛋白互作等研究遥
序列比对发现袁杂灾月灾 中国分离物和美国分离
物 韵砸云 遇基因核苷酸序列相似性为 愿源援 缘豫 咱怨暂 袁说
明长期的地理隔离使 圆 个 杂灾月灾 分离物的 韵砸云 遇
基因发生了一定程度的分子变异袁其编码的 孕远 蛋白
表位肽也发生相应的改变遥 本研究是以 杂灾月灾中国
分离物 韵砸云 遇基因表达产物为抗原制备的抗血清袁
间接 耘蕴陨杂粤 检测表明袁稀释 圆 园园园 倍的抗血清与 圆
个 韵砸云 遇基因在本氏烟中瞬时表达的蛋白均表现
出较强的阳性反应袁说明所制备的抗血清能够检测
出 杂灾月灾 韵砸云 遇基因在寄主中内源性表达蛋白水
平的变化遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 洪健袁李德葆袁周雪平援 植物病毒分类图谱援 北京院科学出版
社袁圆园园员院源园 原 源圆
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咱远暂 隋春袁吴禄平袁张志宏 援 利用孕悦砸技术检测草莓镶脉病毒 援
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咱苑暂 肖敏袁张志宏袁代红艳袁等援 孕悦砸检测草莓镶脉病毒的稳定性
研究援 果树学报袁圆园园缘袁圆圆渊缘冤院源愿猿 原 源愿苑
咱愿暂 周厚成袁李思源袁何水涛袁等援 草莓镶脉病毒的 孕悦砸 检测及
特异片段的序列分析援 果树学报袁圆园园缘袁圆圆渊猿冤院圆愿远 原 圆愿愿
咱怨暂 李瑞袁倪方锐袁贾琳袁等援 草莓镶脉病毒渊杂灾月灾冤韵砸云 遇基因
的克隆及其蛋白特性分析援 西南大学学报渊自然科学版冤袁
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