全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2003 , 30 (1) : 82～84
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 12 - 02 ; 修回日期 : 2002 - 04 - 18
基金项目 : 辽宁省自然科学基金项目 (9910100303)3 通讯作者 Author for correspondence
利用 PCR技术检测草莓镶脉病毒
隋　春　吴禄平　张志宏 3
(沈阳农业大学园艺学院 , 沈阳 110161 )
摘 　要 : 采用特异引物的 PCR 扩增方法 , 对 30 个草莓品种进行了草莓镶脉病毒的检测 , 同时用指示植
物小叶嫁接法对被检植株进行了病毒检测 , 两种方法结果一致。回收、克隆 PCR 扩增出的特异 DNA 片段 ,
获得了携有草莓镶脉病毒 CP 基因片段的载体。测序结果表明 , 得到的特异 DNA 片段同美国草莓镶脉病毒
的株系 ATCC 45058 CP 基因片段相比 , 同源性为 90. 94 %。
关键词 : 草莓 ; 草莓镶脉病毒 ; 检测 ; PCR
中图分类号 : S 668. 4 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2003) 0120082203
1 　目的、材料与方法
草莓镶脉病毒 (strawberry vein banding virus , SVBV) 是在草莓 ( Fragaria) 上分布较广泛、为害较
严重的主要潜隐性病毒之一。通常检测 SVBV 的方法是指示植物小叶嫁接法 , 此法费时费力。直到目
前 , SVBV 的特异抗血清还没有制备出来。作者利用 PCR 技术检测了 SVBV , 探讨以核酸为基础的更
简便、更快速的草莓病毒检测方法 , 并将 PCR 的特异 DNA 片段进行了回收、克隆与测序。
以小叶嫁接后具有典型镶脉症状的草莓指示植物总 DNA 为阳性对照 , 以微茎尖繁殖的指示植物
总 DNA 为阴性对照。30 个待检草莓品种来源于沈阳农业大学草莓品种资源圃 , 每品种取 1 株供试。
指示植物 UC5 ( F. vesca) 、EMC ( F. vesca) 和UC10 ( F. virginiana) 各 60 株。草莓叶片的总DNA 提
取采用 CTAB 法。PCR 反应在 MJ Research PTC2150 MiniCyclerTM中进行 , 反应终体积为 20μL , 其中含
有 2μL 10 ×Taq buffer , 1. 5 mmol/ L MgCl2 , 0. 2 mmol/ L dNTP , Taq DNA 聚合酶 (Takara) 1U , 两个引物
均为 500 nmol/ L , 100 ng 提取的总 DNA。引物由大连宝生物公司合成 , 上游引物 I2 : 5′GAATGGGA2
CAATGAAATGAG3′; 下游引物 I3 : 5′GTGAGGAGAACTTAGGACA3′〔1〕。反应程序为 : 95 ℃3 min , 94 ℃
30 s , 53 ℃1 min , 72 ℃2 min , 循环 35 次 , 72 ℃5 min。反应产物在含有 EB 的琼脂糖凝胶中电泳 , 紫
外反射透射仪中观察、照相。使用上海生工生物工程公司的 UNIQ25 柱式 DNA 胶回收试剂盒 , 切胶回
收扩增的特异 DNA 片段。电泳检查回收片段。并与大连宝生物公司的 pMD182T 载体连接 , 连接产物
转化大肠杆菌 JM109 菌株感受态细胞。碱裂解法重提质粒 , PCR 法鉴定获得重组质粒。采用大连宝生
物公司的 ABI PRISMTM 377XL DNA 测序仪进行测序。以指示植物小叶嫁接法检测病毒。
2 　结果分析与讨论
2. 1 　PCR产物电泳观察
以提取的草莓总 DNA 为模板 , 用一对引物 ( I2、I3) 进行 PCR 反应 , 部分结果如图 1。30 份样品
经 PCR 扩增有 13 份表现出清晰、明显的特异带 , 17 份无特异带 , 分别占 43. 3 %、56. 7 %。13 个被
测样品出现的特异带大小均与阳性对照出现的一致 , 与 marker 相比在 600 bp 左右。
2. 2 　PCR产物的克隆
PCR 扩增得到的特异 DNA 片段经切胶回收 , 与 pMD182T 载体连接 , 转化大肠杆菌 JM109 菌株感
受态细胞 , 经蓝白斑筛选 , 挑取白色菌落培养 , 提取质粒 , 经 PCR 法鉴定获得重组质粒 (图 2) 。
图 1 　草莓植株中 SVBV的 PCR检测
M: DL2000 Marker , 1 : 阳性对照 , 2 : 阴性对照 , 3 : 绿色种子 ,
4 : 丰香 , 5 : 明磊 , 6 : 鬼怒甘 , 7 : 宝交早生 ,
8 : 全明星 , 9 : 爱尔桑塔 , 10 : 帝国 , 11 : 明晶。
Fig. 1 　Detection of SVBV in the stra wberry plants by PCR
M: DL2000 Marker , 1 : Positive control , 2 : Negative control ,
3 : Lüse zhongzhi , 4 : Toyonoka , 5 : Minglei , 6 : Kinuama , 7 : Hokowase ,
8 : Allstar , 9 : Elsanta , 10 : Empire , 11 : Mingjing.
图 2 　PCR特异 DNA片段克隆鉴定
M: DL2000 Marker , 1 : 阳性对照 , 2 : 阴性对照 ,
3 , 4 , 5 : 重组质粒 PCR 产物。
Fig. 2 　Detection of cloned DNA fragment
M: DL2000 Marker , 1 : Positive control ,
2 : Negative control , 3 , 4 , 5 : Recombinant
plasmid PCR product .
2. 3 　基因序列与同源性分析
测定特异 DNA 片段序列 , 表明得到了预期大小的特异 DNA 片段 , 其序列如图 3 所示。与 Petrzik
等〔2〕发表的美国 SVBV 株系 ATCC 45058 序列的 CP 基因片段相比 , 同源性为 90. 94 %。
图 3 　特异 DNA片段的碱基序列
划线部分为引物序列。
Fig. 3 　The sequence of the special DNA fragment
Sequences of primers used for PCR amplification are underlined.
2. 4 　SVBV的指示植物小叶嫁接法检测
PCR 扩增中出现特异带的 13 株草莓植株在指示植物上表现出镶脉症状 , 没有出现特异带的 17 株
植株在指示植物上未表现出镶脉症状。
自发现草莓病毒病以来 , 其检测方法主要为症状观察、指示植物法、电子显微镜技术、血清学法
以及分子生物学法。大多草莓病毒属潜隐性病毒 , 在栽培草莓品种中很少能表现症状 , 因此通常所采
用的是指示植物的生物鉴定法。此法不仅需要培养指示植物 , 接种过程费力 , 且草莓病毒多为混合侵
染 , 环境影响因素也较多 , 需多种指示植物配合使用 , 长时间观察 , 综合评价方能确证。电子显微镜
381 期 　　　　　　　　　　　　　　隋 　春等 : 利用 PCR 技术检测草莓镶脉病毒 　　　　　　　　　　　　　　　
技术也很难单独使用。目前血清学法 , 尤其是 ELISA 法应用较广泛 , 而对于没有制备出抗血清的
SVBV 及其它病毒 , 应选择更为快速、灵敏的分子生物学检测法。分子生物学检测病毒主要有分子杂
交及 PCR 方法。分子杂交一般采用放射性标记 , 要求条件高且有一定的危险性 , 而非放射性的地高
辛等标记又因价格较高而不易采用。由于 PCR 技术具有高度敏感、特异、快速和简便等优越性 , 采
用 PCR 技术检测病毒 , 被认为是病毒检测技术的一次革命〔2〕。PCR 方法检测病毒的前提是设计出特
异性高的引物 , 并具有阴性和阳性对照 , 避免假阴性与假阳性结果。本试验对 30 株草莓植株的 SVBV
进行 PCR 法及小叶嫁接法检测 , 两者结果一致。所获得的重组质粒可用于今后检测 SVBV 的阳性对照
及制备杂交探针 , 通过分子杂交检测 SVBV , 进一步验证 PCR 方法检测 SVBV 的结果 , 促进 PCR 法检
测 SVBV 及其它草莓病毒的研究与利用 , 为无毒苗投入生产提供可行的检测手段。
参考文献 :
1 　Mraz I , K Petrzik , M Sip , et al . Variability in coat protein sequence homology among American and European sources of strawberry vein banding
virus. Pl . Dis. , 1998 , 82 : 544～546
2 　曾凡济. PCR 用于病毒学领域研究的现状. 病毒学杂志 , 1997 , (2) : 91～101
Detection of Stra wberry Vein Banding Virus in Stra wberries by PCR
Sui Chun , Wu Luping , and Zhang Zhihong
( College of Horticulture , Shenyang Agricultural University , Shenyang 110161 , China)
Abstract : Total DNA , isolated from 30 strawberry cultivars , was used as template to amplify strawberry vein
banding virus (SVBV) CP gene fragment by polymerase chain reaction (PCR) . Meanwhile , the tested plants were
detected by indicator leaf grafting technique. The plants with typical band in PCR showed vein banding symptoms in
indicator UC5 ( Fragaria vesca) , EMC ( F. vesca) , and those without typical band didn’t showed symptoms. Re2
sults were identical in two detection methods. The amplified fragment by PCR was recycled , cloned in pMD182T
vector , and then sequenced. It is suggested that the expected SVBV CP gene fragment was obtained and is
90. 94 % identical to that of American isolate ATCC 45058.
Key words : Strawberry ; Strawberry vein banding virus (SVBV) ; Detection ; PCR
新书推荐 《细胞实验指南》
由美国冷泉港实验室邀请 125 位专家共同研讨和撰稿 , 本书汇总
了被细胞生物学家们证明行之有效的众多的技术和方法 , 它们由三大
主体组成 : 细胞的培养及其生物化学分析、光学显微镜及细胞结构和
基因及其产物的亚细胞定位。本书与备受称赞的冷泉港实验室出版社
的《分子克隆实验指南》和《抗体》两本实验指南具有同样的特点 ,
对即使具有多年工作经验的研究者也极其有用。定价 : 244 元 (上、
下册 , 含邮资) 。
　　购书者请汇款至北京中关村南大街 12 号中国农科院蔬菜花卉所《园艺学报》编辑部 , 邮编 100081。
48　　　　　　　　　　　　　　　　　　园 　　艺 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　30 卷