全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ ２０１５ꎬ ４２(５): ８０１ － ８０５ ＤＯＩ: １０􀆰 １３８０２ / ｊ. ｃｎｋｉ. ｚｗｂｈｘｂ. ２０１５􀆰 ０５􀆰 ０１５
基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金(２０１３１８１０１￣２０)
∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ)ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｊｐ１６＠ １２６. ｃｏｍꎬ Ｔｅｌ: ０２１ － ３８６２０５７５
收稿日期: ２０１４ － １１ － ０５
不同引物 ＰＣＲ检测向日葵黑茎病菌的
灵敏度比较及应用
张　 娜１ 　 乾义柯２ 　 尚　 爽２ 　 陆　 平２ 　 易建平３∗
(１.伊犁师范学院ꎬ 新疆 伊宁 ８３５０００ꎻ ２.伊犁出入境检验检疫局ꎬ 新疆 伊宁 ８３５０００ꎻ
３.上海出入境检验检疫局ꎬ 上海 ２００１３５)
摘要: 为准确快速筛查进境油葵种子中携带的向日葵黑茎病菌 Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉꎬ采用常规
ＰＣＲ方法比较了 ３ 对向日葵黑茎病菌 ＰＣＲ检测引物 ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ、ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ和 ＬＬＦ / ＬＬＲ的
灵敏度ꎬ对哈萨克斯坦进境 １２０ 批油葵种子样品进行 ＰＣＲ 检测ꎬ并对检测为阳性的样品进行产物
序列测定及病原菌分离ꎮ 结果显示ꎬ引物 ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ的检测灵敏度最高ꎬ可达 １０ － ５ｎｇ / μＬꎬ引
物 ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ和 ＬＬＦ / ＬＬＲ分别为 １０ － ４ｎｇ / μＬ 和 １０ － ３ｎｇ / μＬꎮ 利用引物 ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ、ＬＥＰＢ /
ＬＥＰＦ和 ＬＬＦ / ＬＬＲ对 １２０ 批进境油葵种子样品进行检测ꎬ阳性检出率分别为 ６５％ 、５０％和 ４５％ ꎬ阳
性检出率高低与引物的检测灵敏度相一致ꎮ 阳性样品扩增的产物序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中向日葵黑茎
病菌的序列同源性最高ꎻ分离的病原菌菌落为乳白色至灰白色ꎬ分生孢子器黑褐色、球形并产生透
明状分生孢子液ꎬ分生孢子单胞、无色、肾型、两端有油球ꎬ与已报道的向日葵黑茎病菌的病原特征
描述一致ꎬ初步鉴定哈萨克斯坦进境油葵种子中存在向日葵黑茎病菌ꎮ
关键词: 向日葵黑茎病菌ꎻ ＰＣＲ检测ꎻ 灵敏度
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ
Ｚｈａｎｇ Ｎａ１ 　 Ｑｉａｎ Ｙｉｋｅ２ 　 Ｓｈａｎｇ Ｓｈｕａｎｇ２ 　 Ｌｕ Ｐｉｎｇ２ 　 Ｙｉ Ｊｉａｎｐｉｎｇ３∗
(１. Ｙｉｌｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅꎬ Ｙｉｎｉｎｇ ８３５０００ꎬ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｙｇｕｒ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｙｉｌｉ Ｅｎｔｒｙ￣Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｙｉｎｉｎｇ ８３５０００ꎬ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｙｇｕｒ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３. Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｅｎｔｒｙ￣Ｅｘｉｔ
Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００１３５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ ｉｎ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄｓ ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ ａｎｄ ｒａｐｉｄｌｙꎬ
ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥꎬ ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ ａｎｄ ＬＬＦ / ＬＬＲ
ｆｏｒ Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
１２０ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄｓ ｆｒｏｍ Ｋａｚａｋｈｓｔａｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｙｐｈａｌ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １０ － ５ꎬ １０ － ３ꎬ １０ － ４ ｎｇ / μＬ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ
ｐｒｉｍｅｒｓ ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥꎬ ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ ａｎｄ ＬＬＦ / ＬＬＲꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ. Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １２０ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｐｒｉｍｅｒｓ ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥꎬ ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ ａｎｄ ＬＬＦ / ＬＬＲ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ６５％ ꎬ ５０％ ａｎｄ ４５％ ｏｆ
ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗａｓ
ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ. Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｈａｒｅｄ ｔｈｅ
ｈｉｇｈｅｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ. Ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｗｅｒｅ ｍｉｌｋ ｗｈｉｔｅ ｔｏ ｌｉｇｈｔ ｇｒｅｙ
ｃｏｌｏｒꎻ ｐｙｃｎｉｄｉａ ｗｅｒｅ ｄａｒｋ ｂｒｏｗｎꎬ ｓｐｈｅｒｉｃａｌｄ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｈｙａｌｉｎｅ ｌｉｑｕｉｄꎬ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｈｙａｌｉｎｅ
ｐｙｃｎｉｄｉｏｓｐｏｒｅｓꎬ ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒꎬ ｋｉｄｎｅｙ￣ｓｈａｐｅｄꎬ ｗｉｔｈ ｏｎｅ ｇｕｔｔｕｌａｔｅ ａｔ ｅａｃｈ ｅｎｄ. Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎｄｉｃｔｅｄ ｔｈａｔ Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ
ｗａｓ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｋａｚａｋｈｓｔａｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉꎻ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
　 　 向日葵黑茎病是向日葵上的一种毁灭性病害ꎬ
其病原菌有性态分类地位为子囊菌亚门腔菌纲格孢
腔菌目格孢腔菌科小球腔菌属ꎬ有性态种名为向日
葵黑茎病菌 Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ (Ｆｒｅｚｚｉ)ꎻ无性态
分类地位为半知菌亚门腔孢纲球壳孢目茎点霉属ꎬ
无性态种名为麦氏茎点霉 Ｐｈｏｍａ ｍａｃｄｏｎａｌｄｉｉ
Ｂｏｍｅｒｍａꎬ该病于 １９６４ 年首次在加拿大被报道ꎬ２０
世纪 ７０ 年代后期在欧洲被发现ꎬ１９８４ 年在美国发
生ꎬ目前已蔓延至世界许多地区(ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ. ꎬ
１９６４ꎻＳａｃｋｓｏｎꎬ１９９２ꎻＲｏｕｓｔａｅｅ ｅｔ ａｌ. ꎬ２０００)ꎮ 向日葵
黑茎病菌能引起向日葵茎斑、叶斑、叶枯、花盘腐烂、
茎折倒伏等症状ꎬ种子干瘪瘦小ꎬ产量和含油量降
低ꎬ造成的生产损失一般超过 ６０％ ꎬ严重的病田发
病率达 １００％ ꎬ造成毁灭性危害(Ｍｉｒｉｃ ｅｔ ａｌ. ꎬ１９９９)ꎮ
向日葵是仅次于大豆和油菜的重要油料作物ꎬ
为满足国内油和饲料的需求ꎬ新疆各口岸陆续从哈
萨克斯坦等中亚国家大量进口油葵ꎬ２０１２—２０１４ 年
共进口油葵 １ １００ 余批ꎬ总重量约 ５ 万 ｔꎬ货值约
２ ０００万美元ꎮ 并在新疆伊犁等地区建有多家油葵
加工基地ꎬ因此对进境油葵中是否携带向日葵黑茎
病菌进行准确检测十分重要ꎮ ２００７ 年向日葵黑茎
病菌列入我国检疫性有害生物目录ꎻ２００８ 年我国新
疆伊犁地区首次报道该病害的发生ꎬ造成毁灭性危
害(陈卫民等ꎬ２００８ａꎻｂ)ꎻ２０１０ 年天津口岸从阿根廷
向日葵种子中首次截获向日葵黑茎病菌ꎬ并从法国
进境向日葵种子中分离到疑似向日葵黑茎病菌菌株
(罗加凤等ꎬ２０１２)ꎮ 有学者利用 １０ 种限制性内切
酶对新疆发生的向日葵黑茎病菌进行了 ＲＦＬＰ 分
析ꎬ明确了新疆分离的向日葵黑茎病菌与向日葵茎
点霉黑茎病菌的同源性ꎬ确认新疆向日葵黑茎病是
由 Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ引起的(张祥林等ꎬ２０１１)ꎮ
国内向日葵黑茎病菌的检测目前多采用常规
ＰＣＲ及实时荧光 ＰＣＲ 检测方法(刘彬ꎬ２０１１ꎻ宋娜
等ꎬ２０１２ꎻ张伟宏等ꎬ２０１３)ꎬ每种方法所分析的基因
序列区间及检测用引物、扩增片段大小各不相同ꎬ所
以应根据实际情况选择所需方法进行检测ꎬ避免假
阴性情况的发生ꎮ 有关不同检测引物灵敏度研究结
果显示ꎬ根据不同目的选择合适的引物ꎬ特别是当待
测样品中带菌率很低时ꎬ应选择高灵敏度的小片段
特异引物(丁芳等ꎬ２００７)ꎮ 本研究测试了已报道的
３ 对检测引物的灵敏度ꎬ并对哈萨克斯坦进境油葵
中向日葵黑茎病菌的携带情况进行了常规 ＰＣＲ 检
测应用及效果评价ꎬ旨在确认快速、准确、灵敏的向
日葵黑茎病菌检测技术ꎬ为进一步提高口岸检疫执
法能力ꎬ防止该病害的传入及扩散ꎬ确保向日葵产业
的安全生产提供技术保障ꎮ
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株:向日葵黑茎病菌 Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ 菌株
Ｙ１７９ 为 ２０１４ 年 ３ 月从进境哈萨克斯坦油葵中分离
获得ꎬ经形态学鉴定、致病性测定和真菌通用引物
ＩＴＳ１ / ＩＴＳ４ 扩增测序鉴定为向日葵黑茎病菌ꎮ
供试引物:根据刘彬 ( ２０１１ ) 报道设计引物
ＬＥＰＢ:５′￣ＧＴＡＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＴＣＴＧＡＴ￣３′和 ＬＥＰＦ:
５′￣ＧＣＣＡＡＣＡＡＴＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧ￣３′ꎻ 根 据 宋 娜 等
(２０１２)报道设计引物 ３２０ＦＯＲ:５′￣ＣＣＴＣＴＴＴＣＴＧＡＴ￣
ＴＣＴＡＣＣＣＡＴ￣３′和 ３２０ＲＶＥ:５′￣ＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＣＣＡＡ￣
ＣＡＣＣＡ￣３′ꎻ根据张伟宏等 (２０１３ ) 报道设计引物
ＬＬＦ: ５′￣ＴＡＧＣＡＴＴＧＴＴＡＧＣＣＧＡＧＧ￣３′ 和 ＬＬＲ: ５′￣
ＣＡＧＣＣＡＧＴＣＴＴＣＴＡＧＣＴＴＧＧ￣３′)ꎮ 所有引物均由宝
生物工程(大连)有限公司合成ꎮ
培养基:马铃薯葡萄糖琼脂 ( ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ
ａｇａｒꎬＰＤＡ)培养基:马铃薯 ２００ ｇ / Ｌ、葡萄糖 ２０ ｇ / Ｌ、
琼脂 １８ ｇ / Ｌꎬ调 ｐＨ为 ４􀆰 ５ꎬ１２１℃高压灭菌 １５ ｍｉｎꎮ
试剂:Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ 植物基因组 ＤＮＡ
提取试剂盒(ＤＰ３０５)ꎬ天根生物科技(北京)有限公
司ꎻＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ. ２ (Ｒ０１０Ａ)、Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ
ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ. ２􀆰 ０ꎬ宝生物工程
(大连)有限公司ꎮ
仪器:ＶＥＲＩＴＩ ２􀆰 ０ ＰＣＲ 扩增仪ꎬ美国 ＡＢ 公司ꎻ
ＡＩＩｅｇｒａ ２５Ｒ 高速冷冻离心机ꎬ美国贝克曼公司ꎻ
ＨＥ９９ 电泳仪ꎬ美国 ＧＥ 公司ꎻＧ∶ ＢＯＸ ＥＦ 凝胶成像
系统ꎬ美国基因公司ꎻＣｌｉｍａｃｅｌｌ ４０４ 培养箱ꎬ德国
ＭＭＭ 公司ꎻ８０ｉ 显微镜 (带成像系统)ꎬ日本尼康
公司ꎮ
２０８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 供试菌株及样品的 ＤＮＡ提取
菌株 ＤＮＡ 提取:将菌株 Ｙ１７９ 在 ＰＤＡ 平板上
２５℃培养 ５ ~ ７ ｄꎬ挑取菌丝烘干ꎬ液氮研磨后参照试
剂盒(ＤＰ３０５)说明书提取 ＤＮＡꎬ用核酸测定仪测定
ＤＮＡ浓度ꎮ
样品 ＤＮＡ提取:进境油葵子每批取样品 ２ ｋｇꎬ
倒入洁净白瓷盘内ꎬ挑选干瘪、弱小、畸形的可疑病
种子和植株残体作为测试材料ꎬ植株残体包括茎杆、
叶柄、花盘等ꎮ 液氮研磨后参照试剂盒(ＤＰ３０５)说
明书提取 ＤＮＡꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２ 供试引物的灵敏度检测
取菌株 Ｙ１７９ 的 ＤＮＡꎬ调整 ＤＮＡ浓度至 １０ ｎｇ /
μＬꎬ依次稀释为 １０ － １、１０ － ２、１０ － ３、１０ － ４、１０ － ５、１０ － ６
ｎｇ / μＬꎬ分别取 ２ μＬ ＤＮＡ 作为 ＰＣＲ 反应模板ꎬ用 ３
对引物 ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ、 ＬＥＰＢ / ＬＥＰ 和 ＬＬＦ / ＬＬＲ
分别进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ ＰＣＲ 反应体系为 ２５ μＬ:２􀆰 ５
μＬ １０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、２ μＬ ｄＮＴＰ(ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、
ｄＣＴＰ各 ２５０ μｍｏｌ / Ｌ)、１􀆰 ５ μＬ ２５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２、１０
μｍｏｌ / Ｌ上下游引物各 １􀆰 ０ μＬ、２ μＬ 模板 ＤＮＡ、１ Ｕ
Ｔａｑ聚合酶ꎬ加无菌水补足至 ２５ μＬꎮ ＰＣＲ 反应程
序:９８℃ ２ ｍｉｎꎻ９８℃ １０ ｓꎬ退火 ３０ ｓ(退火温度:引物
ＬＥＰＢ / ＬＥＰ为 ６５℃ꎻ引物 ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ 为 ５５℃ꎻ
引物 ＬＬＦ / ＬＬＲ为 ５８℃)ꎬ７２℃ １ ｍｉｎꎬ共 ３５ 次循环ꎻ
７２℃延伸 ７ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ扩增产物在 １􀆰 ５％琼脂糖 １ ×
ＴＡＥ缓冲系统中电泳ꎬ每孔加样 ６ μＬꎬ用凝胶成像
系统观察并摄影记录ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３ 样品中向日葵黑茎病菌的检测及序列分析
取 １２０ 批哈萨克斯坦进境油葵种子ꎬ按 １􀆰 ２􀆰 １
所述方法提取样品 ＤＮＡꎬ用 ３ 对引物 ３２０ＦＯＲ /
３２０ＲＶＥ、ＬＥＰＢ / ＬＥＰ和 ＬＬＦ / ＬＬＲ分别对其进行 ＰＣＲ
检测ꎬ反应体系、反应程序、电泳及凝胶成像分析同
１􀆰 ２􀆰 ２ꎬ计算每对引物检出的阳性样品数与样品总数
的比例即为阳性检出率ꎮ 选取 ＰＣＲ 检测为阳性的
部分油葵样品 ＰＣＲ产物ꎬ纯化后送至生工生物工程
(上海)股份有限公司进行双向测序ꎬ所得序列与
ＧｅｎＢａｎｋ中相关序列分别进行比对分析ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４ 样品中病原菌的分离
取 ＰＣＲ检测为阳性的油葵样品 ２ ｋｇꎬ从中挑选
干瘪、弱小、畸形种子和植株残体ꎬ１％次氯酸钠消毒
５ ｍｉｎꎬ无菌水 ３ 次洗涤后置于 ＰＤＡ 平板上ꎬ１０ 粒 /
皿ꎬ２０℃黑暗条件下培养 １０ ｄꎬ从第 ５ 天开始观察是
否有菌丝产生ꎮ 如发现疑似菌丝ꎬ纯化 ３ 次后进行
形态特征鉴定和 ＰＣＲ检测ꎮ
２ 结果与分析
２􀆰 １ 引物灵敏度检测结果
引物 ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ可检测到 １０ － ５ ｎｇ / μＬ的
菌株 Ｙ１７９ 模板 ＤＮＡ(图 １￣Ａ)ꎬ灵敏度最高ꎻ引物
ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ的灵敏度次之ꎬ可检测到 １０ － ４ ｎｇ / μＬ
(图 １￣Ｂ)ꎻ引物 ＬＬＦ / ＬＬＲ 可检测到 １０ － ３ ｎｇ / μＬ(图
１￣Ｃ)ꎬ检测灵敏度相对较差ꎮ
图 １ 引物 ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ(Ａ)、ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ(Ｂ)、
ＬＬＦ / ＬＬＲ(Ｃ)检测灵敏度的比较
Ｆｉｇ. １ Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥꎬ ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦꎬ ａｎｄ ＬＬＦ / ＬＬＲ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｍ: Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ꎻ １ ~７: 模板浓度分别为 １０、１０ －１、
１０ －２、１０ －３、１０ －４、１０ －５、１０ －６ ｎｇ / μＬꎮ Ｍ: Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ꎻ
１ －７: ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｉｓ １０ꎬ １０ －１ꎬ １０ －２ꎬ
１０ －３ꎬ １０ －４ꎬ １０ －５ꎬ １０ －６ ｎｇ / μＬꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
　
２􀆰 ２ 样品中向日葵黑茎病菌检测结果
１２０ 批 进 境 油 葵 样 品 ＤＮＡ 分 别 用 引 物
３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ、 ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ 和 ＬＬＦ / ＬＬＲ 进行
ＰＣＲ检测ꎬ检出的阳性样品分别为 ７８、６０ 和 ５４ 批ꎬ
阳性检出率分别为 ６５％ 、５０％和 ４５％ ꎮ 其中引物
３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ的阳性检出率最高ꎬ且检出的 ７８
批阳性样品全部涵盖引物 ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ 和 ＬＬＦ / ＬＬＲ
所检出的阳性样品ꎻ引物 ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ 检出的 ６０ 批
阳性样品全部涵盖引物 ＬＬＦ / ＬＬＲ 所检出的阳性
样品ꎮ
２􀆰 ３ 产物序列分析结果
选取 ３ 对引物检测均为阳性的油葵样品ꎬ扩增
产物纯化后进行双向测序ꎬ结果表明引物 ３２０ＦＯＲ /
３２０ＲＶＥ和 ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ的扩增产物序列与 ＧｅｎＢａｎｋ
３０８５ 期 乾义柯等: 不同引物 ＰＣＲ检测向日葵黑茎病菌的灵敏度比较及应用
中向日葵黑茎病菌 Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ(登录号 ＪＱ９７９４８８)
序列相似性为 １００％ ꎬ引物 ＬＬＦ / ＬＬＲ 产物序列与
ＧｅｎＢａｎｋ中 Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ(登录号 ＡＹ７４８９７９)的序列
相似性最高为 ９８％ ꎬ表明进境哈萨克斯坦油葵中确
实存在向日葵黑茎病菌ꎮ
２􀆰 ４ 样品中病原菌分离结果
从引物 ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ 检测为阳性的 １２ 批
油葵样品中分离向日葵黑茎病菌ꎬ共获得 ３ 份疑似
分离物ꎬ１ 份从种子外壳上分离获得ꎬ另 ２ 份从植株
残体上分离获得ꎮ 分离所得病原菌菌落特征为乳白
色至灰白色ꎬ培养 ３ ~ ７ ｄ后产生大量黑褐色、球形、
带乳突状并产生透明液的分生孢子器ꎬ显微镜观察
的分生孢子呈单胞、无色、肾型、两端有油球(图 ２)ꎬ
与已报道的向日葵黑茎病菌的病原特征描述一致ꎮ
菌丝 ＤＮＡ经 ＰＣＲ 检测为阳性ꎬ序列测定均为向日
葵黑茎病菌 Ｐ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉꎮ 表明引物 ３２０ＦＯＲ /
３２０ＲＶＥ可用于进境油葵样品中向日葵黑茎病菌的
常规筛查检测ꎮ
图 ２ 进境油葵中分离到向日葵黑茎病菌的形态特征
Ｆｉｇ. ２ Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ
ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄｓ
ａ: 菌落特征ꎻ ｂ: 分生孢子器产生的透明液ꎻ ｃ: 分
生孢子ꎮ ａ: Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｙ ｏｎ ＰＤＡꎻ ｂ: ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ ｌｉｑｕｉｄ
ｏｆ ｐｙｃｎｉｄｉａ ｏｎ ＰＤＡꎻ ｃ: ｃｏｎｉｄｉａ.
　
３ 讨论
为满足口岸快速通关的需求ꎬ利用 ＰＣＲ 方法对
样品中携带的病原菌进行初筛检测已成为主要手
段ꎮ 实时荧光 ＰＣＲ、巢式 ＰＣＲ、常规 ＰＣＲ以及 ＬＡＭＰ
方法在植物病原菌的检测应用方面已经很普遍ꎬ每
种方法都有自己的优势和限制ꎮ 实时荧光 ＰＣＲ 灵
敏度最高ꎬ可用于病原菌早期诊断及监测ꎬ但所需硬
件平台较昂贵ꎬ基层检测机构不易普及(林亚玉等ꎬ
２０１２)ꎻ巢式 ＰＣＲ 检测灵敏度比常规 ＰＣＲ 可提高
１ ０００倍ꎬ但操作过程中易造成污染(高新明ꎬ２０１１)ꎻ
ＬＡＭＰ技术检测速度快、周期短、操作简便、灵敏度
高又无需特殊仪器ꎬ但在引物设计开发方面要求较
高(陈先锋等ꎬ２０１３)ꎮ 相对而言ꎬ目前常规 ＰＣＲ 检
测技术更易操作和普及ꎬ所以本研究利用常规 ＰＣＲ
法比较了已报道的 ３ 对向日葵黑茎病菌检测引物的
灵敏度ꎬ并从 １２０ 批哈萨克斯坦进境油葵样品中提
取 ＤＮＡꎬ进行向日葵黑茎病菌实际检测应用ꎮ 进口
哈萨克斯坦油葵种子含油率高达 ４０％ ꎬ试验中对所
提样品 ＤＮＡ是否存在 ＰＣＲ 干扰物进行了检测ꎬ结
果显示按照本试验中 ＤＮＡ 提取方法ꎬ所提取 ＤＮＡ
样品对 ＰＣＲ扩增并未产生干扰ꎮ
根据 Ａｃｔｉｎ 基因区域特异位点设计的引物 ＬＬＦ /
ＬＬＲ对进境油葵样品的阳性检出率为 ４５％ ꎬＩＴＳ 基
因区域特异位点设计的引物 ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ 和
ＬＥＰＢ / ＬＥＰＦ检出率分别为 ６５％和 ５０％ ꎬ且 ３ 对引
物的阳性检出率高低与检测灵敏度相一致ꎮ 引物
ＬＬＦ / ＬＬＲ对进境油葵样品的阳性检出率最低ꎬ可能
原因是病原菌中 Ａｃｔｉｎ基因总量比 ＩＴＳ 基因低ꎬ或引
物自身与模板结合率的问题等ꎮ 但有学者报道 Ａｃ￣
ｔｉｎ基因能够提供足够丰富的差异位点ꎬ所设计的引
物 ＬＬＦ / ＬＬＲ能够区分向日葵黑茎病菌和向日葵茎
溃疡病菌ꎬ而 ＩＴＳ序列之间相似性非常高ꎬ不能设计
区分 ２ 种病原菌的特异引物(张伟宏等ꎬ２０１３)ꎮ 本
试验中由 ＩＴＳ 区间引物检测为阳性的 ＰＣＲ 产物经
测序均与向日葵黑茎病菌 Ｐ. ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ 同源性最
高ꎬ所以应综合考虑选择灵敏度和特异性均较高的
引物ꎬ必要时可同时选用引物 ３２０ＦＯＲ / ３２０ＲＶＥ 和
ＬＬＦ / ＬＬＲꎬ以防漏检或假阳性的出现ꎮ
向日葵黑茎病菌主要依靠种子及病残体上的菌
丝、子囊孢子和分生孢子越冬并远距离传播(Ｓｍｅｔ￣
ｎｉｋ ｅｔ ａｌ. ꎬ１９９８ꎻＳｔａｊｉｃ′ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００１)ꎬ国内有报道向日
葵种子表面、种壳和内种皮及样品中植株残体中均
可带菌(陈为民等ꎬ２００８ｂ)ꎮ 本试验从植株残体和
种壳中均分离出向日葵病黑茎原菌ꎬ但大部分 ＰＣＲ
阳性样品并未能成功分离到病原菌ꎬ因此 ＰＣＲ检测
可以证实进境哈萨克斯坦油葵样品中存在向日葵黑
茎病菌 ＤＮＡꎬ但是不能判定样品中的向日葵黑茎病
菌是否具有活性ꎮ 所以ꎬ受侵染种子在贮藏一定时
间后ꎬ种子中的菌丝体是否会丧失生活力ꎬ在整个油
４０８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
葵运输和储藏过程中只残存菌体 ＤＮＡ 而不具侵染
能力的可能性还有待进一步研究ꎮ
参 考 文 献 (Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ)
Ｃｈｅｎ ＷＭꎬ Ｇｕｏ ＱＹꎬ Ｓｏｎｇ ＨＭꎬ Ｗａｎｇ Ｈꎬ Ｍａ ＦＪꎬ Ｊｉｎｇ ＸＹ. ２００８ａ.
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ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ Ｐｈｏｍａ ｂｌａｃｋ ｓｔｅｍ ｉｎ Ｉｌｉ Ｒｉｖｅｒ Ｖａｌｌｅｙꎬ Ｓｉｎｋｉａｎｇꎬ Ｃｈｉ￣
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Ｃｈｅｎ ＷＭꎬ Ｇｕｏ ＱＹꎬ Ｓｏｎｇ ＨＭꎬ Ｗａｎｇ Ｈꎬ Ｍａ ＦＪꎬ Ｊｉｎｇ ＸＹ. ２００８ｂ.
Ｔｈｅ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ Ｐｈｏｍａ ｂｌａｃｋ ｓｔｅｍ ｉｎ Ｉｌｉ Ｒｉｖｅｒ Ｖａｌｌｅｙꎬ
Ｓｉｎｋｉａｎｇ. Ｐｌａｎｔ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅꎬ ２２(３): １７６ － １７８ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[陈卫民ꎬ 郭庆元ꎬ 宋红梅ꎬ 王华ꎬ 马福杰ꎬ 景新跃. ２００８ｂ.
新疆伊犁河谷发 现 向 日 葵 黑 茎 病. 植 物 检 疫ꎬ ２２
(３): １７６ － １７８]
Ｃｈｅｎ ＸＦꎬ Ｚｈａｎｇ ＪＨꎬ Ｃｕｉ ＪＸꎬ Ｚｈａｎｇ ＨＬꎬ Ｇｕｏ ＬＸꎬ Ｙｕ ＳＱ. ２０１３.
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Ｚｈａｎｇ ＷＨꎬ Ｌｉａｏ Ｆꎬ Ｌｕｏ ＪＦꎬ Ｌｉ ＧＲ. ２０１３. Ｔｒｉｐｌｅｘ￣ＰＣＲ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｆｕｎｇａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒꎬ Ｌｅｐｔｏ￣
ｓｐｈａｅｒｉａ ｌｉｎｄｑｕｉｓｔｉｉ ａｎｄ Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｈｅｌｉａｎｔｈｉ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ￣
ｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ)ꎬ ３５(１): １０ － １５ (ｉｎ
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测. 西南大学学报(自然科学版)ꎬ ３５(１): １０ － １５]
Ｚｈａｎｇ ＸＬꎬ Ｌｉｕ Ｂꎬ Ｗａｎｇ Ｃꎬ Ｑｉａｎ ＹＫꎬ Ｌｕｏ Ｍꎬ Ｃｈｅｎ Ｙ. ２０１１. Ｉｓｏ￣
ｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈｉ Ｔａｂｅｒｏｓｉ ａｎｄ ｉｔｓ
ＲＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ ４８(２): ２０４ －
２０９ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [张祥林ꎬ 刘彬ꎬ 王翀ꎬ 乾义柯ꎬ 罗明ꎬ 陈
燕. ２０１１. 向日葵黑茎病菌分离鉴定及其 ＲＦＬＰ分析. 新疆
农业科学ꎬ ４８(２): ２０４ － ２０９]
(责任编辑:李美娟)
５０８５ 期 乾义柯等: 不同引物 ＰＣＲ检测向日葵黑茎病菌的灵敏度比较及应用