全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（３）： ３９１ － ３９７ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０３􀆰 ００６
基金项目：国家自然科学基金（３１５７０６４２），黑龙江省自然科学基金（Ｃ２０１４０９），东北林业大学青年拔尖人才支持计划（ＰＹＴＴ⁃１２１３⁃１０）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｃｈｕａｎｗａｎｇｃａｏ＠ １２６． ｃｏｍ
收稿日期： ２０１４ － １２ － ２１
舞毒蛾 ＤｎａＪ１ 基因克隆分析及对甲萘威胁迫响应
问荣荣　 刘　 鹏　 邹传山　 王志英　 曹传旺∗
（东北林业大学林学院， 哈尔滨 １５００４０）
摘要： ＤｎａＪ蛋白是 ＤｎａＫ ／ Ｈｓｐ７０ 的辅助分子伴侣，通过调节 Ｈｓｐ７０ 的 ＡＴＰａｓｅ活性来影响蛋白复合
体的合成与组装。 为明确舞毒蛾 Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ 的 ＬｄＤｎａＪ１ 基因特性及对杀虫剂甲萘威的胁迫
响应，通过克隆 ＬｄＤｎａＪ１ 全长基因并运用实时荧光定量 ＲＴ⁃ＰＣＲ 技术测定了甲萘威对其 ＬｄＤｎａＪ１
基因表达量的影响。 结果表明，舞毒蛾 ＬｄＤｎａＪ１ 全长基因开放阅读框为 １ ０６２ ｂｐ，编码 ３５３ 个氨基
酸，分子质量为 ３９􀆰 ９１ ｋＤ，理论等电点为 ５􀆰 ６５；舞毒蛾 ＤｎａＪ与柑橘凤蝶 Ｐａｐｉｌｉｏ ｘｕｔｈｕｓ ＤｎａＪ亲缘关
系较近。 甲萘威对舞毒蛾 ２ 龄幼虫 ２４ ｈ 和 ４８ ｈ 的致死中浓度 ＬＣ５０分别为 ７４􀆰 ０４ ｍｇ ／ Ｌ 和 ３１􀆰 ４８
ｍｇ ／ Ｌ。 低剂量（ＬＣ５、ＬＣ１０和 ＬＣ３０）甲萘威胁迫下，舞毒蛾 ２ 龄幼虫 ＬｄＤｎａＪ１ 基因表达量均下调，
ＬＣ３０甲萘威处理后 ７２ ｈ时 ＬｄＤｎａＪ１ 基因表达量最低，仅为对照的 １５􀆰 ７０％ 。 表明甲萘威可抑制舞
毒蛾 ＬｄＤｎａＪ１ 基因的表达，且呈现明显的时间和剂量效应。
关键词： 舞毒蛾； ＬｄＤｎａＪ１ 基因； 甲萘威； 基因表达量
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＬｄＤｎａＪ１ ｉｎ ｇｙｐｓｙ ｍｏｔｈ Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ ａｎｄ
ｉｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃａｒｂａｒｙｌ ｓｔｒｅｓｓ
Ｗｅｎ Ｒｏｎｇｒｏｎｇ　 Ｌｉｕ Ｐｅｎｇ　 Ｚｏｕ Ｃｈｕａｎｓｈａｎ　 Ｗａｎｇ Ｚｈｉｙｉｎｇ　 Ｃａｏ Ｃｈｕａｎｗａｎｇ∗
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００４０， Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＤｎａＪ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｏｆ ＤｎａＫ ／ Ｈｓｐ７０ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ＡＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ
ＬｄＤｎａＪ１ ｉｎ ｇｙｐｓｙ ｍｏｔｈ Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ （Ｌｉｎｎａｅｕｓ） ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃａｒｂａｒｙｌ ｓｔｒｅｓｓ， ｔｈｅ ｆｕｌｌ⁃ｌｅｎｇｔｈ
ｃＤＮＡ ｏｆ ＬｄＤｎａＪ１ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｒｂａｒｙｌ ｏｎ ＬｄＤｎａＪ１ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ
ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ ＬｄＤｎａＪ１ ｗａｓ １ ０６２
ｂｐ， ｅｎｃｏｄｉｎｇ ３５３ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ３９􀆰 ９１ ｋＤ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｐＩ ｏｆ ５􀆰 ６５．
Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤｎａＪ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＬｄＤｎａＪ１ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ Ｐａｐｉｌｉｏ ｘｕｔｈｕｓ．
Ｔｈｅ ２４⁃ｈ ａｎｄ ４８⁃ｈ ＬＣ５０ ｏｆ ｃａｒｂａｒｙｌ ｆｏｒ ２ｎｄ ｉｎｓｔａｒ Ｌ． ｄｉｓｐａｒ ｌａｒｖａｅ ｗａｓ ７４􀆰 ０４ ｍｇ ／ Ｌ ａｎｄ ３１􀆰 ４８ ｍｇ ／ Ｌ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｌｏｗ ｄｏｓｅｓ （ＬＣ５， ＬＣ１０ ａｎｄ ＬＣ３０） ｏｆ ｃａｒｂａｒｙｌ ｓｔｒｅｓｓ， ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＬｄＤｎａＪ１ ｉｎ
２ｎｄ ｉｎｓｔａｒ Ｌ． ｄｉｓｐａｒ ｌａｒｖａｅ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ａ ７２ ｈ⁃ｐｅｒｉｏｄ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＬｄＤｎａＪ１
ｗａｓ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ａｔ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ７２ ｈ ｗｉｔｈ ｏｎｌｙ １５􀆰 ７％ ｏｆ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｕｎｄｅｒ ＬＣ３０ ｄｏｓｅ ｏｆ ｃａｒｂａｒｙｌ
ｓｔｒｅｓｓ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＬｄＤｎａＪ１ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｃａｒｂａｒｙｌ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｄｅｄ ｔｏ
ｃａｒｂａｒｙｌ ｉｎ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ⁃ ａｎｄ ｔｉｍｅ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｗａｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ； ＬｄＤｎａＪ１； ｃａｒｂａｒｙｌ； ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ
　 　 舞毒蛾 Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ （Ｌｉｎｎａｅｕｓ）是一种世界
性、周期性发生的林业食叶害虫，分布广、食性杂，可
为害杨、柳、苹果、樟子松、落叶松等 ５００ 多种植物
（Ｌａｚａｒｅｖｉｃ′ ｅｔ ａｌ． ，１９９８），给农林业生产带来巨大的
经济损失。 化学防治仍是目前有效控制舞毒蛾的主
要措施，但该方法容易引起害虫“３Ｒ”问题，随着分
子生物学的发展，寻找分子靶标创制绿色杀虫剂已
成为防治害虫的新策略。 理想的分子靶标是参与机
体至关重要的生理功能的基因产物，通过调节这种
靶标的活性来干扰害虫正常的生理功能。
热激蛋白（ｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｓｐ），又称热休
克蛋白或应激蛋白，由于其在表达上的多样性，可根
据相对分子量、氨基酸序列的同源性及功能来划分。
目前，参考人类基因组织基因命名委员会标准将其
划分为 ７ 个家族，依次为 ＨｓｐＨ （ Ｈｓｐ１１０ ）、 ＨｓｐＣ
（Ｈｓｐ９０）、ＨｓｐＡ（Ｈｓｐ７０）、ＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）、ＨｓｐＢ（小分
子 Ｈｓｐ）、ＨｓｐＤ ／ Ｅ （Ｈｓｐ６０ ／ Ｈｓｐ１０）和 ＣＣＴ （ ＴＲｉｃ）。
ＤｎａＪ最早是从大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中分离出的
１ 种 ４１ ｋＤ的调节蛋白，与人类、动物、植物、酵母等
许多真核生物 ＤｎａＪ家族具有序列和功能同源性，在
生物体内具有非常重要的生理功能（Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ
ａｌ． ，１９８０；Ｂｕｋａｕ ＆ Ｈｏｒｗｉｃｈ，１９９８）。 ＤｎａＪ 是 ＤｎａＫ ／
Ｈｓｐ７０ 亚类的辅助因子，通过特异性结合调节
ＤｎａＫ ／ Ｈｓｐ７０ 的 ＡＴＰａｓｅ 活性使 Ｈｓｐ７０ 构象发生改
变（周人纲和 Ｍｉｅｒｎｙｋ，１９９９； Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｋｉｎｄｌ，
２０００），最终使得 Ｈｓｐ７０ 结合的底物多肽发生折叠，
促进部分变性的蛋白复性（重新折叠）来保护胁迫
损害的细胞并使其恢复正常功能 （ Ｇｌｏｖｅｒ ＆
Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９９８；Ｗｅｂｅｒ⁃Ｂａｎ ｅｔ ａｌ． ，１９９９）。
ＤｎａＪ 蛋白参与植物应对热激（周人纲和 Ｍｉ⁃
ｅｒｎｙｋ，１９９９）、盐（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ． ，１９９３）、重金属（柴团耀
等，２０００）等方面的胁迫，还参与生物体内新生肽的
运输、折叠、组装、定位以及变性蛋白的复性和降解，
在植物抗逆性中发挥着重要作用 （ Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ． ，
１９９６）。 在昆虫中，步翠玉等 （２００９）克隆了家蚕
Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ的 ＤｎａＪ５ 基因，并发现在 ５ 龄幼虫和蛹
的各组织中都有表达。 而有关昆虫 ＤｎａＪ 蛋白在应
对逆境（如杀虫剂）胁迫响应中的作用机制鲜有报
道。 因此，本研究在分析舞毒蛾转录组文库的基础
上，克隆分析了 １ 条舞毒蛾 ＬｄＤｎａＪ 基因 ｃＤＮＡ 全
长，并采用实时荧光定量 ＰＣＲ技术分析了杀虫剂甲
萘威对该基因在其幼虫体内表达量的影响，以期为
利用“反向毒理学”策略开发新型杀虫剂防治舞毒
蛾提供基础依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试昆虫及植物：舞毒蛾卵块和人工饲料来源
于中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究
所，孵化幼虫于 ２５ ± １℃、光照 １４ Ｌ ∶ １０ Ｄ、相对湿度
７５％的条件下人工饲养，取健康、大小一致的舞毒蛾
２ 龄幼虫为试虫。 小黑杨 Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｉｍｏｎｉｉ × Ｐ． ｎｉｇｒａ
叶片采自于东北林业大学示范林场。
试剂：９５％甲萘威（ ｃａｒｂａｒｙｌ）原药，南开大学国
家农药工程中心；ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ 动物组织总 ＲＮＡ 提
取试剂盒，上海 Ｑｉａｇｅｎ生物技术有限公司；Ｔａｑ ＤＮＡ
聚合酶、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ，宝生物工程
（大连）有限公司；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ，东洋纺（上海）生物科技有限公司。
仪器：ＢＩＣ⁃４００ 人工气候箱，上海博讯实业有限
公司；ＭＸ３０００Ｐ 实时荧光定量 ＰＣＲ 仪，美国 Ａｇｉｌｅｎｔ
科技公司；梯度 ＰＣＲ 仪，德国 Ｂｉｏｍｅｒｒａ 公司；Ｇｅｎｅ
Ｑｕａｎｔ １３００ 紫外分光光度计，美国 ＧＥ公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ ＬｄＤｎａＪ１ 基因的克隆与分析
随机选用活泼、健康、大小一致的舞毒蛾 １ ～ ６
龄幼虫各 １０ 头，采用 ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ动物组织总 ＲＮＡ
提取试剂盒提取 ＲＮＡ，然后将各龄幼虫提取的 ＲＮＡ
等比例混匀，２０ μｇ 总 ＲＮＡ 用于转录组文库构建，
采用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑＴＭ ２０００ 由深圳华大基因科技有
限公司进行文库测序。 从转录组文库中获得编号为
Ｕｎｉｇｅｎｅ８４８３ 的序列，进行 ＢＬＡＳＴＸ 和 ＢＬＡＳＴＮ 分
析，根据功能注释结果查找获得 ＤｎａＪ 基因。 将提
取的舞毒蛾幼虫总 ＲＮＡ，经 ＤＮａｓｅ Ｉ消化除去 ＤＮＡ，
采用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ 合成 ｃＤＮＡ 作为
模板，并设计引物进行 ＰＣＲ，进一步测序确定所获
得的全长 ＤｎａＪ 基因序列。 用 ＯＲＦ Ｆｏｕｎｄｅｒ 程序确
定其开放阅读框；用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件计算推导其蛋白
质分子量及理论等电点；用 ＮＣＢＩ 的 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏ⁃
ｍａｉｎｓ程序预测蛋白的保守区；采用在线工具 Ｓｃａｎ⁃
Ｐｒｏｓｉｔｅ 预测蛋白质的基因家族和结构域， Ｉｎｔｅｒ⁃
ＰｒｏＳｃａｎ预测蛋白质结构域和功能基序 （ Ｃｈｅｎ ｅｔ
ａｌ． ，２００５）。 利用 ＢＬＡＳＴ 程序进行序列同源性搜
索，选择与其相似程度高的双翅目、膜翅目、鳞翅目
昆虫的 Ｈｓｐ 蛋白氨基酸序列，用 ＣｌｕｓｔａｌＷ２ 进行多
序列比对。 应用 ＣｌｕｓｔａｌＸ １􀆰 ８３ 和 ＭＥＧＡ ５􀆰 １，采用
邻接法构建系统发育树（Ｂｒｏｄｓｋｙ ｅｔ ａｌ． ，１９９３）。
１􀆰 ２􀆰 ２ 生物测定和致毒处理
采用浸叶法进行毒力测定。 以丙酮配制甲萘威
母液（丙酮终浓度不超过 ０􀆰 ５％ ），用蒸馏水将甲萘
威母液稀释成 ７ ～ ９ 个浓度，将新鲜小黑杨叶片浸于
不同浓度的甲萘威药液中 ５ ｓ，以蒸馏水 （含有
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０􀆰 ５％丙酮）浸叶为对照，叶片于室内自然阴干，湿
润脱脂棉裹叶柄保湿，将健壮、饥饿 ２４ ｈ的舞毒蛾 ２
龄幼虫置于透气性良好的直径 ７ ｃｍ、高 １０ ｃｍ 透明
养虫瓶，每处理 １５ 头，３ 次重复；以解剖针触动尾部
不动视为死亡，分别于 ２４、４８ ｈ后统计幼虫死亡数。
采用饲料混毒法进行致毒处理。 将上述配制好
的甲萘威母液均匀加入到人工饲料中，分别配制成
４８ ｈ 亚致死浓度 ＬＣ５、ＬＣ１０和 ＬＣ３０甲萘威（分别为
８􀆰 ５３、１１􀆰 ３８ 和 ２０􀆰 ７６ ｍｇ ／ Ｌ）的毒饵，以含有等浓度
丙酮水溶液的人工饲料为对照，分别于饲喂舞毒蛾 ２
龄幼虫后 ６、１２、２４、４８、７２ ｈ随机挑取活泼幼虫，液氮冷
冻后用于基因表达分析，每处理 １５头幼虫，重复 ３次。
１􀆰 ２􀆰 ３ 实时荧光定量 ＲＴ⁃ＰＣＲ分析
提取对照（非杀虫剂处理）和 ＬＣ５、ＬＣ１０和 ＬＣ３０
亚致死剂量甲萘威分别处理 ６、１２、２４、４８ 和 ７２ ｈ 后
的舞毒蛾 ２ 龄幼虫的总 ＲＮＡ，经 ＤＮａｓｅ Ｉ 消化除去
ＤＮＡ，采用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ合成 ｃＤＮＡ，
稀释至 １００ μＬ，作为实时荧光定量 ＰＣＲ模板。 实时
荧光定量 ＰＣＲ 使用试剂盒 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ
ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 进行。 选择 Ａｃｔｉｎ、ＥＦ１α 和 ＴＵＢ 作
为内参基因以消除单内参基因表达的误差（表 １）。
实时荧光定量 ＰＣＲ 反应体系为： ２ × ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ
Ｅｘ Ｔａｑ酶１０ μＬ、１０ μｍｏｌ ／ Ｌ 正反向引物各 １ μＬ、稀
释 ｃＤＮＡ模板 ２ μＬ，去离子水补足至 ２０ μＬ。 实时
荧光定量 ＰＣＲ 反应条件为：９４℃预变性 ３０ ｓ，９４℃
变性 １２ ｓ，６０℃退火 ４５ ｓ，７２℃延伸 ４５ ｓ，８１℃读板
１ ｓ，４５ 个循环，每个样品重复 ３ 次，用 ２ －△△Ｃｔ方法进
行基因的相对定量分析（Ｐｆａｆｆｌ ｅｔ ａｌ． ，２００２）。
表 １ 本研究实时荧光定量 ＲＴ⁃ＰＣＲ引物序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
基因
Ｇｅｎｅ
正向引物序列（５′⁃３′）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
反向引物序列（５′⁃３′）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＬｄＤｎａＪ１ ＣＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＣＡＴＣＣ ＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＴＣ
Ａｃｔｉｎ ＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴ ＡＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡＣＴＧＴＣＡＴ
ＥＦ１α ＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡＡＣＡ ＴＧＴＡＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＧＧＴ
ＴＵＢ ＡＡＴＧＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＣＧＣＣＴ ＡＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡ
１􀆰 ３ 数据分析
利用 ＰＯＬＯ软件计算致死中浓度 ＬＣ５０和各亚致
死浓度及其 ９５％ 置信区间。 采用统计软件 ＳＰＳＳ
１７􀆰 ０ 进行单因素方差分析，应用 Ｄｕｎｃａｎ 氏新复极
差法检验不同浓度和不同时间条件下各处理组间基
因表达量的差异显著性。
２ 结果与分析
２􀆰 １ ＬｄＤｎａＪ１ 基因生物信息学分析
通过对舞毒蛾幼虫转录组数据的分析，获得了
舞毒蛾 ＤｎａＪ 基因（暂命名为 ＬｄＤｎａＪ１）的全长 ｃＤ⁃
ＮＡ序列，该基因阅读框长 １ ０６２ ｂｐ，编码 ３５３ 个氨
基酸（图 １）。 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 预测编码蛋白分子质量为
３９􀆰 ９１ ｋＤ，理论等电点为 ５􀆰 ６５，为酸性蛋白。 该蛋
白中亮氨酸含量最多，为 ３０ 个，占总氨基酸数的
８􀆰 ５％ ；其次是谷氨酸和甘氨酸各 ２７ 个，各占
７􀆰 ６％ 。 ＢＬＡＳＴＰ 对 ＬｄＤｎａＪ１ 蛋白保守区的预测显
示，该蛋白属于 Ｈｓｐ 家族中的 ＤｎａＪ 蛋白，含高度保
守的 Ｊ结构域和保守性较低的 Ｃ结构域（图 ２），且 Ｊ
结构域中含有组氨酸、脯氨酸和天冬氨酸组成的高
度保守的 ＨＰＤ（Ｈｉｓ ／ Ｐｒｏ ／ Ａｓｐ，ＨＰＤ）三肽域（图 １）。
经 ＢＬＡＳＴＰ 多 序 列 比 对， 选 择 与 舞 毒 蛾
ＬｄＤｎａＪ１ 蛋白序列相似度高的 １２ 种其它昆虫 ＤｎａＪ
蛋白进行比对，氨基酸序列同源性为 １１􀆰 ８３％ ～
８７􀆰 ５４％ ，相似度较高的 Ｊ 区域如图 ３ 所示。 由 １３
种昆虫 ＤｎａＪ 蛋白构建的系统进化树表明，ＤｎａＪ 蛋
白可分为 ２ 大类，红带袖蝶 Ｈｅｌｉｃｏｎｉｕｓ ｍｅｌｐｏｍｅｎｅ 和
艺神袖蝶 Ｈ． ｅｒａｔｏ的 ＤｎａＪ同源性较高，为 ９８􀆰 ５２％ ，
聚为一类，其它昆虫聚为一类；其中舞毒蛾与柑橘凤
蝶 Ｐａｐｉｌｉｏ ｘｕｔｈｕｓ ＤｎａＪ蛋白的亲缘关系较近（图 ４）。
２􀆰 ２ 甲萘威对舞毒蛾幼虫的毒力
甲萘威对舞毒蛾 ２ 龄幼虫 ２４ ｈ 和 ４８ ｈ 的致死
中浓度 ＬＣ５０分别为 ７４􀆰 ０４ ｍｇ ／ Ｌ 和 ３１􀆰 ４８ ｍｇ ／ Ｌ，且
随着作用时间的延长毒力增强（表 ２）。 ４８ ｈ的甲萘
威亚致死剂量 ＬＣ５、 ＬＣ１０、 ＬＣ２０ 和 ＬＣ３０ 值分别为
８􀆰 ５３、１１􀆰 ３８、１６􀆰 １４、２０􀆰 ７６ ｍｇ ／ Ｌ，毒力大于 ２４ ｈ 的
处理，因此后续试验采用 ４８ ｈ的 ＬＣ５、ＬＣ１０和 ＬＣ３０剂
量处理毒饵分别胁迫舞毒蛾 ２ 龄幼虫，分析其
ＬｄＤｎａＪ１ 对甲萘威的胁迫响应。
２􀆰 ３ 甲萘威胁迫对 ＬｄＤｎａＪ１ 基因表达的影响
３ 个亚致死剂量 ＬＣ５、ＬＣ１０和 ＬＣ３０甲萘威处理舞
毒蛾 ２ 龄幼虫后，其 ＬｄＤｎａＪ１ 基因的表达量在 ７２ ｈ
内均表现为下调。 ＬＣ３０甲萘威处理 ７２ ｈ 时舞毒蛾
ＬｄＤｎａＪ１ 基因表达量最低，仅为对照的 １５􀆰 ７０％ ，抑
３９３３ 期 问荣荣等： 舞毒蛾 ＤｎａＪ１ 基因克隆分析及对甲萘威胁迫响应
　 　 　
图 １ 舞毒蛾 ＬｄＤｎａＪ１ 基因 ｃＤＮＡ及推导的氨基酸序列
Ｆｉｇ． １ Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ ＤｎａＪ１
下划线氨基酸： Ｊ结构域； 双下划线氨基酸： Ｎ端保守序列标签； 加框氨基酸： ＨＰＤ 三肽区。 Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ：
Ｊ ｄｏｍａｉｎ； ｄｏｕｂｌｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ： Ｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ； ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｆｒａｍｅ： Ｈｉｓ ／ Ｐｒｏ ／ Ａｓｐ ｒｅｇｉｏｎ．
　
制作用显著高于其它处理组（Ｐ ＜ ０􀆰 ０５）；ＬＣ５ 甲萘
威处理６ ｈ 时对舞毒蛾 ＬｄＤｎａＪ１ 基因抑制作用最
小，表达量为对照的 ６３􀆰 ４７％ （图 ５）。
４９３ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
图 ２ 舞毒蛾 ＬｄＤｎａＪ１ 蛋白氨基酸序列保守区预测
Ｆｉｇ． ２ Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＬｄＤｎａＪ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ
　
图 ３ １３ 种昆虫 ＤｎａＪ蛋白 Ｊ结构域的多序列比对
Ｆｉｇ． ３ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｊ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ １３ ｉｎｓｅｃｔ ＤｎａＪ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
加框部分： ＤｎａＪ蛋白 Ｊ结构域中 ＨＰＤ三肽区； ∗：具有相同氨基酸残基； “． ”：氨基酸残基保守性弱； “：”：氨基酸残
基保守性强。 Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｉｔｈ ｆｒａｍｅ： Ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＨＰＤ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ Ｊ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＤｎａＪ ｐｒｏｔｅｉｎ； ∗：
ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ； “． ”： ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｅ ｌｏｗｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ； “：”： ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ．
　
图 ４ 以邻接法构建的 １３ 种昆虫 ＤｎａＪ蛋白系统进化树
Ｆｉｇ． ４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １３ ｉｎｓｅｃｔ ＤｎａＪ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ
　
３ 讨论
ＤｎａＪ家族蛋白存在于从衣藻到哺乳动物的多
种生物细胞内，具有多种功能，包括新生蛋白的折
叠、胞吞作用、多肽穿过细胞器质膜的转运、调整对
各种胁迫的反应及干预降解蛋白的靶标等（Ｔｉｓｓｉéｒｅｓ
５９３３ 期 问荣荣等： 舞毒蛾 ＤｎａＪ１ 基因克隆分析及对甲萘威胁迫响应
　 　 　 表 ２ 甲萘威对舞毒蛾 ２ 龄幼虫的毒力
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃａｒｂａｒｙｌ ｔｏ ２ｎｄ ｉｎｓｔａｒ ｇｙｐｓｙ ｍｏｔｈ ｌａｒｖａｅ
处理时间 （ｈ）
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ
ＬＣ５
（９５％ ＣＬ）
ＬＣ１０
（９５％ ＣＬ）
ＬＣ２０
（９５％ ＣＬ）
ＬＣ３０
（９５％ ＣＬ）
ＬＣ５０
（９５％ ＣＬ）
χ２
２４ ２４􀆰 ２３
（１１􀆰 ５５ ～ ３５􀆰 ８８）
３１􀆰 ０１
（１６􀆰 ５７ ～ ４３􀆰 ５１）
４１􀆰 ８１
（２５􀆰 ５３ ～ ５５􀆰 ２０）
５１􀆰 ８６
（３４􀆰 ６８ ～ ６５􀆰 ８８）
７４􀆰 ０４
（５６􀆰 ３５ ～ ９０􀆰 １４）
７􀆰 ９５
４８ ８􀆰 ５３
（２􀆰 ６６ ～ １４􀆰 ８７）
１１􀆰 ３８
（４􀆰 １８ ～ １８􀆰 ４９）
１６􀆰 １４
（７􀆰 ２１ ～ ２４􀆰 １７）
２０􀆰 ７６
（１０􀆰 ６３ ～ ２９􀆰 ４７）
３１􀆰 ４８
（１９􀆰 ８０ ～ ４１􀆰 ６６）
８􀆰 ７５
　 　 χ２ ＜ χ２（１３，０􀆰 ０５） ＝ ２２􀆰 ３６，故毒力回归方程与实际相符。 χ２ ＜ χ２（１３，０􀆰 ０５） ＝ ２２􀆰 ３６， ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｓ ａｃｃｏｒｄａｎｔ ｗｉｔｈ
ａｃｔｕａｌ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ．
图 ５ 甲萘威胁迫对舞毒蛾 ＬｄＤｎａＪ１ 基因表达量的影响
Ｆｉｇ． ５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｒｂａｒｙｌ ｏｎ ＬｄＤｎａＪ１ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ
２ｎｄ ｉｎｓｔａｒ ｇｙｐｓｙ ｍｏｔｈ ｌａｒｖａｅ
图中数据为平均数 ± 标准误。 不同字母表示经
Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平差异显著。
Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＥ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎ’ ｓ ｎｅｗ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ．
　
ｅｔ ａｌ． ，１９７４；Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ ＆ Ｐａｒｄｕｅ，１９８３；Ｆｅｄｅｒ ＆ Ｈｏｆ⁃
ｍａｎｎ，１９９９），并能够通过促进部分变性的蛋白复性
（重新折叠）来保护胁迫损害的细胞使其恢复正常
功能（Ｗｅｂｅｒ⁃Ｂａｎ ｅｔ ａｌ． ，１９９９）。 ＤｎａＪ蛋白多为调节
蛋白分子伴侣或热休克蛋白，是一类分布广泛且进
化上非常保守的蛋白家族，根据蛋白结构特征主要
分为 ３ 类（ＤｎａＪ１、ＤｎａＪ２ 和 ＤｎａＪ３）。 本研究获得的
舞毒蛾 ＤｎａＪ基因，编码 ３５３ 个氨基酸，分子质量为
３９􀆰 ９１ ｋＤ，蛋白结构域分析其属于 ＤｎａＪ２ 蛋白
（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ． ，２００４），这与大肠杆菌 ＥｃＤｎａＪ 所编码
的 ３７６ 个氨基酸、分子质量为 ４０􀆰 ９８ ｋＤ 的蛋白相
近。 舞毒蛾 ＤｎａＪ 蛋白 Ｊ 结构域由 ６６ 个氨基酸组
成，其中 ＨＰＤ 三肽区位于 Ｊ 结构域的第 ２９ ～ ３１ 位
氨基酸，而大肠杆菌 ＥｃＤｎａＪ 蛋白 Ｊ 结构域由 ５５ 个
氨基酸组成，ＨＰＤ三肽也位于 Ｊ结构域的第 ２９ ～ ３１
位氨基酸（Ｏｈｋｉ ｅｔ ａｌ． ， １９８６）。 系统进化分析表明
舞毒蛾与柑橘凤蝶的 ＤｎａＪ 蛋白亲缘关系近；同时
ＤｎａＪ蛋白亚家族结构组成又存在差异性，这导致同
目昆虫 ＤｎａＪ同源性差异而发生分离。
　 　 在外源有毒物质对生物体毒性作用的研究中，
Ｈｓｐ基因作为生物标志基因而被广泛研究。 Ｓｏｎｏｄａ
＆ Ｔｓｕｍｕｋｉ（２００７）曾报道溴虫腈能显著诱导人工培
养的甘蓝夜蛾 Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ Ｈｓｐ９０、 Ｈｓｐ７０、
Ｈｓｐ２０􀆰 ７ 和 Ｈｓｐ１９􀆰 ７ 基因的表达，且诱导表达呈时间
和浓度效应；郭雅洁等（２０１３）分别测定了烯啶虫
胺、毒死蜱和高效氯氰菊酯对烟粉虱地中海隐种
Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ成虫体内热激蛋白基因
Ｈｓｐ７０ 表达水平的影响，结果表明 ３ 种杀虫剂诱导
Ｈｓｐ７０ 表达量增加，增强了烟粉虱地中海隐种对杀
虫剂和高温的耐受能力，这可能是导致其在我国快
速扩张的原因之一。 昆虫 Ｈｓｐ７０ 基因对外源有毒物
质的胁迫具有诱导响应，在 Ｈｓｐ７０ 保护受损细胞及
恢复其正常功能的过程中，ＤｎａＪ 是重要的辅助因
子，而有关 ＤｎａＪ 基因对杀虫剂的胁迫响应研究甚
少。 本研究结果表明，甲萘威对舞毒蛾 ２ 龄幼虫 ４８
ｈ 的 ＬＣ５、ＬＣ１０和 ＬＣ３０分别为 ８􀆰 ５３、１１􀆰 ３８、２０􀆰 ７６ ｍｇ ／
Ｌ，表现出较高的杀虫活性，在此基础上进一步测定
了这 ３ 种亚致死剂量处理舞毒蛾 ２ 龄幼虫后，其
ＬｄＤｎａＪ１ 基因的表达量在 ７２ ｈ 内均表现为下调。
因此，ＬｄＤｎａＪ１ 基因表达受到抑制可能导致细胞内
ＤｎａＪ蛋白减少，进而影响其对 Ｈｓｐ７０ 的 ＡＴＰａｓｅ 活
性的调节，无法正常协作 Ｈｓｐ７０ 在逆境下防止蛋白
的聚集变性和促进聚集蛋白的溶解复性，无法保护
生物膜的结构和功能（Ｂｏｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ，１９９６；ＭｃＣａｒｔｈｙ
ｅｔ ａｌ． ，１９９８），这将可能有效干扰害虫生理功能，并
降低害虫应对外界胁迫时产生的蛋白修复能力。 因
此，进一步明确其作用机制对于通过基因工程手段
干预这类基因的表达，从而达到控制害虫的目的具
有重要意义，今后可研究 ＲＮＡｉ技术沉默 ＬｄＤｎａＪ 基
因后的舞毒蛾生存能力及对杀虫剂甲萘威敏感性的
变化，探讨其作为分子靶标创制新型杀虫剂防治舞
毒蛾的可行性。
６９３ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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ｒｉｐｌｅｘ ｎｕｍｍｕｌａｒｉａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｔｈｅ ｂａｃｔｅ⁃
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（责任编辑：李美娟）
７９３３ 期 问荣荣等： 舞毒蛾 ＤｎａＪ１ 基因克隆分析及对甲萘威胁迫响应