全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#)#!)!$
&修改稿收到日期$
!"#$)"!)"#
基金项目$国家自然科学基金"
%"*""*,#
#
作者简介$关晓弯"
#*1*(
#!女!在读硕士研究生!主要研究果树资源与生物技术育种
2)34.5
$
#!$$&!%!
!
#$%+673
"
通信作者$张水明!博士!副教授!主要从事园艺植物种质资源与生物技术育种研究
2)34.5
$
8940
:
/931*%
!
/79;+673
石榴果肉
1
2
3$4%45
基因克隆及
不同温度处理下的表达分析
关晓弯!陈
!
磊!涂佳丽!张水明"
"安徽农业大学 园艺学院!合肥
!%""%$
#
摘
!
要$为探讨不同温度处理对采后石榴果肉花青苷含量的影响及花青苷合成相关基因"
!%""#
#在石榴果肉花青
苷生物合成途径中的作用!该研究以(玉石籽)石榴为试材!于不同温度"
<
*
<
*
#"<
*
#<
#处理下测定石榴果
肉花青苷含量!同时利用
=>?2
技术克隆了石榴果肉花青苷合成相关基因!命名为
$
%
!%""#
!
@A0B40C
登录号为
DE"11*!
&并利用
=F)G?=
技术分析
$
%
!%""#
基因在不同贮期温度下石榴果肉中的表达特性结果表明$"
#
#
不同温度处理下!石榴果肉花青苷含量随着贮藏时间"
"
$H
#的增长呈上升趋势&在整个贮藏过程中!
#<
条件
下!花青苷含量最高!
#" <
次之!
<
和
" <
则处于较低水平&
# <
时花青苷含量在
#&H
后表现不稳定
"
!
#
$
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基因全长
6IJ>
为
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L
!开放阅读框
*#1K
L
!编码
%"
个氨基酸!在
J
端
%$
"
%*
处含有细胞色
素
G&"
家族基因的特征保守氨基酸序列"
?MG
基序(
GG@G
)#&生物信息学分析表明!该基因编码的氨基酸序列与
巨桉的
2
:
N%OOP!
*麻风树的
Q6N%OOP!
和荷花的
J0N%OOP!
氨基酸序列一致性分别高达
1$R
*
1!R
和
1#R

"
%
#在
"<
*
<
*
#"<
处理条件下!石榴果肉
$
%
!%""#
基因表达量随着贮藏时间"
"
$H
#的延长均呈上升趋势!
#<
处理下!石榴果肉
$
%
!%""#
基因表达量不稳定&石榴果肉
$
%
!%""#
基因表达与花青苷含量呈显著正相关
关系研究结果为深入探讨采后石榴果肉花青苷的含量变化奠定了基础
关键词$石榴果肉&花青苷&温度&
$
%
!%""#
&
=>?2
&
=F)G?=
中图分类号$
S,1
&
S,1$
文献标志码$
>
&"()"*1
2
3$4%45 +)()#(,"-)
.
/0(01),2
3
0(!415
67
3
/)55#"(2(!)/8#**)/)(19)-
3
)/012/)9/)01-)(15
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FEQ.45.
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Z.6;5[;Z45E0.\AZ/.[
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L
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]
40.0670[A0[/7Y
L
7/[94Z\A/[
L
73A
:
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L
;5
L
!
40H[9AY;06[.707Y40[976
]
40.0K.7/
]
0[9A/./)ZA54[AH
:
A0A
"
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#
.040[976
]
40.0K.7)
/
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0[9A/./
L
4[9U4
]
7Y
L
73A
:
Z404[A
L
;5
L
!
[4C.0
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73A
:
Z404[A6;5[.\4Z
+
M;/9.8.
,
4/[A/[34[AZ.45/
!
UA3A4/)
;ZAH40[976
]
40.0670[A0[/7Y
L
73A
:
Z404[A
L
;5
L
;0HAZH.YYAZA0[[A3
L
AZ4[;ZA
"
<
!
<
!
#"<
!
#<
#
[ZA4[)
3A0[/+>[[9A/43A[.3A440[976
]
40.0K.7/
]
0[9A/./)ZA54[AH
:
A0AU4/6570AHYZ73
L
73A
:
Z404[A
L
;5
L
K
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043AH$
%
!%""#
"
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$
DE"11*!
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+F9AA^
L
ZA//.705A\A5/7Y$
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!%""#.0
L
73A)
:
Z404[A
L
;5
L
H;Z.0
:
H.YYAZA0[[A3
L
AZ4[;ZA/[7Z4
:
A
L
AZ.7H/UAZA4045
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8AHK
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=F)G?=+F9AZA/;5[//97UAH
[94[
$"
#
#
;0HAZH.YYAZA0[[A3
L
AZ4[;ZA[ZA4[3A0[/
!
40[976
]
40.0670[A0[/7Y
L
73A
:
Z404[A
L
;5
L
/97UAH4Z./.0
:
[ZA0H4/[9A/[7Z4
:
A[.3A
"
"($H
#
UA0[70
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_0[9AU975A/[7Z4
:
A[.3A
!
40[976
]
40.0670[A0[/UAZA[9A
9.
:
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!
/A670H5
]
#"<
!
<40H"<4[57UAZ5A\A5/
&
>0[976
]
40.0670[A0[/;0HAZ
#< UAZA;0/[4K5A4Y[AZ#&H+
"
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#
F9AY;5)5A0
:
[96IJ>7Y$
%
!%""# U4/##**K
L
U.[9407
L
A0ZA4H.0
:
YZ43A7Y*#1K
L
A067H.0
:
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%
!%""#
670[4.0AH[9A694Z46[AZ./[.6670/AZ\AH/A
`
;A06A/
"
?MG37[.Y
(
GG@G
)#
7Y[9A6
]
[769Z73AG&"Y43.5
]
:
A0A/
&
B.7.0Y7Z34[.6//97UAH[94[[9A43.0746.H/A
`
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:
N%OOP94H9.
:
9670/./[A06
]
U.[9&()*
+
,-
./
%
0)123/2
:
N%OOP!
!
4).05
-
6)(0()/Q6N%OOP!40H78+9:51(3
;
80)J0N%OOP!4/1$R
!
1!R
40H1#R
!
ZA/
L
A6[.\A5
]
+
"
%
#
F9AA^
L
ZA//.705A\A5/7Y$
%
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:
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:
A[.3A
"
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!
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!
KA.0
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;0/[4K5A;0HAZ#<
&
F9AZA54[.\AA^
L
ZA/)
/.707Y$
%
!%""# U4//.
:
0.Y.640[5
]L
7/.[.\A5
]
67ZZA54[AHU.[940[976
]
40.0670[A0[/7Y
L
73A
:
Z404[A
L
;5
L
+
F9AZA/A4Z69ZA/;5[/54.H[9AY7;0H4[.70Y7ZA^
L
57Z.0
:
[9A6940
:
A/7Y40[976
]
40.0670[A0[/.0
L
7/[94Z\A/[
L
73A
:
Z404[A
L
;5
L
+
=)
>
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$
L
73A
:
Z404[A
L
;5
L
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40[976
]
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&
[A3
L
AZ4[;ZA
&
$
%
!%""#
&
=>?2
&
=F)G?=
!!
石榴"
$13()
%
0)1).9 V+
#属于石榴科石榴
属!为多年生落叶乔木或灌木!是最早发现的可食用
水果之一-#.近年来!由于石榴具有多种医疗保健
作用受到人们越来越多的重视-!.石榴果肉中含有
丰富的花青苷!花青苷是自然界一类广泛存在于植
物中的水溶性天然色素!主要存在于彩色植物叶片*
花或种子的叶肉细胞和表皮细胞的液泡中-%.花青
苷具有显著的抗氧化*抗炎*抑菌*防止肝脂肪积聚
及变性*防治心血管疾病*抑制多种癌细胞生长等多
种生理活性!在食品*医药*化妆等领域有着广泛的
应用前景-&.但花青苷是一类不稳定的物质!其生
物合成和积累易受环境因子的调节-)$.!温度是其中
的一个主要的环境因子!不仅能影响花青苷生物合
成的速率!而且可以对其积累量和稳定性产生作
用-,.!这在葡萄-1.*长叶车前-*.*马铃薯-#".等研究中
已得到证实而温度对采后石榴果肉中花青苷含量
的影响方面的研究还未见报道
花青苷合成代谢涉及多个结构基因*调节基因
的相互作用!基因编码的酶决定了花青苷合成的种
类-##.花青苷的生物合成主要由苯丙氨酸解氨酶
"
G>V
#*查尔酮合成酶 "
?PX
#*查尔酮异构酶
"
?P_
#*黄烷酮
%)
羟化酶"
N%P
#*类黄酮
%O
羟基化酶
"
N%OP
#*类黄酮
%O
!
O
羟基化酶"
N%OOP
#*二羟基黄
酮醇还原酶"
IN=
#*花青苷合成酶"
>JX
#以及类黄
酮
%)a)
糖基转移 酶 "
EN@F
#等多 种 酶 基 因 调
控-#!)#%.其中
<#=
*
<#>
*
!%#
*
?!@
*
A7=
和
B!CD
等基因已在石榴中克隆-#.!而在石榴中尚未
见到关于花青苷合成相关基因"
!%""#
#的研究报
道国内外研究表明!
%""#
基因在仙客来-#&.*马
铃薯-#.等很多植物中已经克隆!通过调节花青苷的
生物合成途径!从而影响花青苷的种类和含量
本研究以安徽怀远(玉石籽)石榴为试材!研究
采后不同贮藏温度"
<
*
<
*
#"<
*
#<
#对石榴
果肉花青苷含量的影响同时利用
=>?2
技术克
隆花青苷合成相关基因"
$
%
!%""#
#
6IJ>
全长!然
后利用
=F)G?=
技术分析该基因在不同贮期温度
石榴果肉中的表达特性!为深入研究采后石榴果肉
花青苷的含量变化奠定基础
#
!
材料和方法
@+@
!
实验材料
供试材料为+玉石籽,的成熟果实!于
!"#&
年
*
月
#$
日采自安徽省蚌埠市怀远县!选择成熟度相
同*果形匀称*大小一致"约
%""
:
#和无机械伤的果
实!置于
&<
条件下预冷
,!9
后!将果实分成
&
批
分别置于
"<
*
<
*
#"<
和
#<
条件下定期"*
#&
*
!1
*
&!
和
$H
#取样!并模拟货架期!置于
!"<
恒温环境条件下
,H
后!剥取籽粒!液氮速冻后!于
(1"<
超低温冰箱中保存
@+A
!
花青素苷含量的测定
采用
L
P
示差法-#$.分别对不同贮藏温度不同
贮藏期石榴果肉的花青苷含量进行测定$取混合石
榴籽粒解冻!冰上研磨后!迅速转移至离心管称重!
,"""Z
%
3.0
离心
#"3.0
!收集上清液!记录上清液
体积&取上清液
#3V
!分别用
"+&375
%
VD?5)P?5
缓冲溶液"
L
P#+"
#和
"+&375
%
V
醋酸钠缓冲溶液
"
L
P&+
#稀释至
3V
!混匀!室温放置
!"3.0
&用
蒸馏水作对照!在
#"
和
,""03
下测定光密度值!
重复
%
次
石榴果肉中花青苷含量"
3
:
%
:
#
b
#
AcEc
?!cFc#""
%"
9c
!
cG
#!其中$
Ab
"
A
#"03
(
A
,""03
#
L
P#+"
(
"
A
#"03
(A
,""03
#
L
P&+
&
E
为矢车菊
素
)%)
葡萄糖苷的相对分子质量"
&&*+!
:
%
375
#&
?!
为稀释因子&
F
为石榴汁体积"
3V
#&
9
为称取的石
$%&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
榴果肉质量"
:
#&
#
为矢车菊素
)%)
葡萄糖苷的摩尔比
吸收系数"
!$*""V
/
375
(#
/
63
(#
#.!
G
为光程!
#63

@B$
!
1
2
3$4%45
基因
<8C:
全长克隆
@B$B@
!
1
2
3$4%45
基因中间片段的获得
!
依据
@A0B40C
中已经登录的其他植物
!%""#
基因的
IJ>
结合结构域保守区!使用软件
GZ.3AZGZA3.AZ
+"
设计目的片段的扩增引物
N%OOP)N
和
N%OOP)
=
"表
#
#!获取基因同源片段利用艾德莱
=J>
试
剂盒"北京艾德莱生物科技有限公司#提取(玉石籽)
石榴果肉总
=J>
!用
d)dVe
反转录酶"
GZ73A
:
4
公司#合成
6IJ>
!以其为模板进行
G?=
反应反
应条件为$
*&<
预变性
%3.0
&
*&<
变性
%"/
!
<
退火
%"/
!
,!<
延伸
%"/
!
%
个循环&
,!<
延伸
#"
3.0
!
G?=
产物用
#+"R
琼脂糖凝胶电泳检测将
G?=
产物进行回收并连接至
G@2d)FA4/
]
载体
"
GZ73A
:
4
#上!转化大肠杆菌
IP
$
"上海康润生物
公司#进行克隆!挑取阳性单菌落进行测序
@B$BA
!
1
2
3$4%45
基因末端扩增及全长
<8C:
拼接
!
根据获得的
!%""#
中间片段核苷酸序列!设计
用于
%O
端和
O
端克隆的基因特异性引物"表
#
#参
照
Xd>=FAZ
Fd
=>?26IJ>
扩增试剂盒"
?570)
[A69
公司#说明书!以
%O)?IXGZ.3AZ>
为接头!反
转录得到
%O)=>?2)=A4H
]
6IJ>
!以
O)?IXGZ.3AZ
和
BIXd>=F
%
>75.
:
7
为接头!反转录得到
O)
=>?2)=A4H
]
6IJ>

采用巢式
G?=
法进行
O
端扩增!
N%OOP)O
@XG#
外特异性引物与
EGd)V70
:
作为第
#
轮扩增
引物!以此
G?=
产物为模板!
N%OOP)O@XG!
内特
异性引物与
JEG
作为引物进行第
!
轮扩增!获得
!%""#
基因的
O
端序列!两轮扩增程序相同!退火
温度分别为
<
和
$"<
回收扩增产物并连接至
G@2d)FA4/
]
载体!转化大肠杆菌
IP
$
进行克
隆!筛选阳性单菌落进行测序分别用特异性引物
N%OOP)%O@GX#
*
N%OOP)%O@GX!
和 通 用 引 物
EGd)V70
:
和
JEG
!进行
%O
端扩增!两轮退火温度
分别为
<
和
1<
!扩增方法参照
O
端扩增将
所得的
O
端序列*
%O
端序列和目的片段进行拼接!获
得
$
%
!%""#
基因的全长序列
@BD
!
1
2
3$4%45
基因的生物信息学分析
将
$
%
!%""#
基因序列在
J?B_
数据库中运用
B54/[
工具进行序列比对和同源性分析&运用
N.0HAZ
软件"
9[[
L
$%%
UUU+06K.+053+0.9+
:
7%
:
7ZY
%
7ZY.
:
+
6
:
.
#查找并翻译开放阅读框&运用
2^ G>X
]
)GZ7[)
L
4Z43F775
"
9[[
L
$%%
UAK+A^
L
4/
]
+7Z
:
%
L
Z7[
L
4Z43
%#
分析蛋白质的理化性质&运用
J?B_
"
9[[
L
$%%
UUU+
06K.+053+0.9+
:
7%
X[Z;6[;ZA
%
6HH
%
UZ
L
/K+6
:
.
#进行
蛋白质保守结构域搜索&运用
?54;/[45^
和
@2J2)
Ia?
软件进行氨基酸序列比对和相似性分析&运用
d2@>
软件构建系统进化树
@B%
!
石榴果肉
1
2
3$4%45
基因在不同贮期温度的
表达分析
利用艾德莱
=J>
试剂盒提取不同温度"
<
*

<
*
#" <
*
# <
#处理石榴果肉的总
=J>
!采用
F4C4Z4
公司的
GZ.3AX6Z.
L
[
&
=FZA4
:
A0[D.[U.[9
:
IJ>2Z4/AZ
"
GAZYA6[=A45F.3A
#试剂盒将总
=J>
表
@
!
本实验相关引物序列
F4K5A#
!
=A54[AH
L
Z.3AZ/A
`
;A06A/.0[9./[A/[
引物类型
GZ.3AZ[
]L
A
引物名称
GZ.3AZ043A
引物序列
GZ.3AZ/A
`
;A06A
"
O
$
%O
#
目的片段特异性引物
F4Z
:
A[
:
A0A
L
Z.3AZ/
N%OOP)N @?FFF??FF>>>>???F>@>
N%OOP)= ??>??>??>F@F??FF@>>?
通用引物
E0.\AZ/45
L
Z.3AZ/
EGd)V70
:
?F>>F>?@>?F?>?F>F>@@@?>>@?>@F@@F>F?>>?@?>@>@F
JEG >>@?>@F@@F>F?>>?@?>@>@F
%O)=>?2
N%OOP)%O@GX# ?F@>?FF>?@?F>F@@?>>>
N%OOP)%O@GX! @@F@FF?@F@>F@>>@@@>F
%O)?IX >>@?>@F@@F>F?>>?@?>@>@F>?
"
F
#
%"eJ
O)=>?2
N%OOP)O@GX# ?FF?>F?>?@>>?>???F??
N%OOP)O@GX! ??@F>@F?@@?@>>>>??>F
O)?IX
"
F
#
!eJ
"
Jb>
!
?
!
@7ZF
&
eb>
!
@7Z?
#
BIXd>=F
%
>75.
:
7 >>@?>@F@@F>F?>>?@?>@>@F>?TTTTT
=F)G?=
G
:
N%OOP)N @@?>?F??FFFF@@F>F@
G
:
N%OOP)= ?@>@@>??F@>FF>?@?F
G
:
>6[.0)N >@F??F?FF??>@??>F?F?
G
:
>6[.0)= ?>?F@>@?>?>>F@FFF??>
,%&
%
期
!!!!!!!!!
关晓弯!等$石榴果肉
$
%
!%""#
基因克隆及不同温度处理下的表达分析
反转录为
6IJ>
根据
$
%
!%""#
基因的全长序
列!使用软件
GZ.3AZGZA3.AZ+"
设计荧光定量
G?=
引物
G
:
N%OOP)N
%
G
:
N%OOP)=
"表
#
#分别
以不同处理的
6IJ>
为模板!采用
A(.31
基因作为
内标对样品的
6IJ>
模板量进行校准!进行特异性
表达分析反应体系按
F4D4=4XMB=GZA3.^ 2^
D)
H
试剂盒步骤进行操作$
XMB=GZA3.^ 2^ D)
H
"
!
c
#为
#"

V
!
=aTGAYAZA06AI
]
A
"
"c
#为
"+&

V
!
模板为
!

V
!正反向引物"
#"

375
%
V
#各
"+1

V
!
HHP
!
a
为
$+&

V
!总体系为
!"

V

G?=
扩增反应
程序为$
*<
预变性
%"/
!
*<
变性
/
!
$"<
退火
%"/
!
,!<
延伸
#3.0
!共
&"
个循环每个样品各设
置
&
个重复!以
=aT
作为荧光校正!使用
!
(
##
<[法
进行相对表达量分析
!
!
结果和分析
A+@
!
不同温度处理石榴果肉花青苷含量分析
采用
L
P
示差法测得不同温度不同贮藏期石榴
果肉的花青苷含量"图
#
#在
"<
和
<
贮藏条件
下!石榴果肉花青苷含量在贮藏
"
"
#&H
过程中快
速升高!花青苷含量差异均达到显著水平&贮藏
#&
"
&!H
期间!花青苷含量处于一个比较稳定的阶
段&贮藏
&!
"
$H
期间!花青苷含量急剧上升!达到
最大值!分别为
"H
的
!+"%
和
!+11
倍在
#"<
条
件下!贮藏
"
"
&!H
期间!花青苷含量呈快速上升趋
势!到
&!H
时达到高峰!为
"H
的
%+!
倍!且各个阶
段花青苷含量差异性均达到显著水平&到
$H
时!
花青苷含量开始缓慢下降!仅次于
&!H
在
#<
条
件下!贮藏
"
"
#&H
花青苷含量快速上升!达到第一
个高峰!为
"H
的
%+#*
倍&贮藏
#&
"
!1H
开始缓慢
下降!
1
"
$H
又开始回升!到
$H
时达到最高峰!
为
"H
的
&+#,
倍!花青苷含量虽一直处于最高水
平!但不稳定结果表明$不同温度"
<
*
<
*
#"
<
*
#<
#处理条件下!石榴果肉花青苷含量随着贮
藏时间"
"
$H
#的增长均呈不断上升趋势&在整个
贮藏过程中!
#<
处理条件下!花青苷含量一直处
于最高水平!
#"<
次之!
<
和
" <
则处于较低
水平
ABA
!
石榴
1
2
3$4%45
基因的克隆
根据基因特异引物
N%OOP)N
%
N%OOP)=
扩增
石榴果肉中
!%""#
基因目的片段!电泳回收后进
行连接转化!筛选阳性克隆!测序得到一个
%$,K
L
的核酸片段"图
!
!
>
#测序结果在
J?B_
网站的
B54/[
中进行比较!发现该片段序列与锦绣杜鹃
"
@65252812051 c
-
+(609
#的
@
-
!%"" #
"
>B!1**1+#
#的序列一致性高达
1"R
!初步判断
该片段为石榴
!%""#
基因序列片段
O
端扩增得到一个
&1$K
L
的片段"图
!
!
B
#!其
O
端发现起始密码子
>F@

J?B_
序列对比结果显
小写字母表示同一温度不同贮期
花青苷含量
"+"
水平差异显著性
图
#
!
不同温度不同贮期石榴果肉花青苷含量
I.YYAZA0[07Z3455A[[AZ/.0[9A675;303A40
/.
:
0.Y.640[H.YYAZA06A4370
:
40[976
]
40.0670[A0[/7Y[9A/43A
[A3
L
AZ4[;ZAH;Z.0
:
H.YYAZA0[/[7Z4
:
A
L
AZ.7H/4["+"5A\A5
N.
:
+#
!
>0[976
]
40.0670[A0[/7Y
L
73A
:
Z404[A
L
;5
L
.0H.YYAZA0[[A3
L
AZ4[;ZA/[7Z4
:
A
L
AZ.7H
d+IV!"""
&
>+G
:
N%OOP
&
B+O)=>?2
&
?+%O)=>?2
图
!
!
石榴果肉
$
%
!%""#
基因的扩增结果
N.
:
+!
!
G?=43
L
5.Y.64[.70ZA/;5[/7Y$
%
!%""#
:
A0A.0
L
73A
:
Z404[A
L
;5
L
1%&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
示!该片段序列与巨桉"
&()+
,-
./
%
0)123/
#的
&
%
!%""#!*+3I8
"
Td
0
"#""&$,,&+#
#的序列一致性
高达
1%R
!说明已克隆到石榴
!%""#
基因
6IJ>
的
O
端序列
%O
端扩增得到一个
"%K
L
的片段"图
!
!
?
#!其
%O
端发现终止密码子
F>>
和
G75
]
>
尾
巴!说明已到达
%O
末端
J?B_
序列对比结果显示!
该片段序列与山字草"
<+)0I3))0().)
#的
<)!%""
##
"
D?"#*!%,+#
#的序列一致性高达
1#R
!分析确
定为石榴
!%""#
基因的
%O
序列将获得的
%O
段序
列*
O
段序列和目的片段序列进行拼接!得到一个长
##**K
L
的
6IJ>
序列
AB$
!
1
2
3$4%45
基因生物信息学分析
通过
J?B_
的
a=NN.0HAZ
分析!
$
%
!%""#
基
因全长
6IJ>
为
##**K
L
!其中包含
O
非编码区
##K
L
!
%O
非编码区
#$$K
L
和开放阅读框
*#1K
L
!编
码一个含有
%"
个氨基酸的蛋白质!起始密码子为
>F@
!终止密码子为
F>>
"图
%
#将其命名为
$
%
!%""#
!
@A0B40C
登录号为
DE"11*!

!!
GZ7[
L
4Z43
分析其理化性质!推测该蛋白分子
式为
?
#&$
P
!&,,
J
&#*
a
&"&
X
!%
!相对分子量为
%&#%+$
!
等电点为
*+1*
!理论推导其半衰期大约为
%"9
!不
稳定参数为
&!+1
!蛋白质性质不稳定"
&"
以下为稳
定蛋白#&该蛋白中相对含量较多的氨基酸是亮氨酸
VA;
"
#"+R
!
%!
个#和丙氨酸
>54
"
*+!R
!
!1
个#!
含量较少的是半胱氨酸
?
]
/
"
#+"R
!
%
#和色氨酸
FZ
L
"
#+%R
!
&
个#&总的带负电荷残基"
>/
L
f @5;
#
为
!
!总的带正电荷残基"
>Z
:
f V
]
/
#为
&#
&脂肪
族氨基酸指数为
*&+%%
!总平均疏水指数"
@=>eM
#
为
"+"*,
!该蛋白为疏水性蛋白
将
$
%
!%""#
基因编码的氨基酸序列进行同
源性分析"图
&
#!结果发现!该氨基酸序列与巨桉
2
:
N%OOP!
*麻风树
Q6N%OOP!
和荷花
J0N%OOP!
的氨基酸一致性较高!均达到
1"R
以上
J?B_
保
守结构域搜索结果显示!
G
:
N%OOP
氨基酸序列含有
细胞色素
G&"
家族基因的特征保守氨基酸序列$
J
端
%$
"
%*
处的
?MG
基序(
GG@G
)!为连接膜的锚定
方框中碱基序列
>F@
表示起始密码子&
"
表示终止密码子
F>>
图
%
!
$
%
!%""#
基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列
F9A0;65A7[.HA/A
`
;A06A>F@.0[9AK7^ 3A40/.0.[.4[7Z67H70
&
F>>U.[9
"
3A40/[AZ3.04[7Z67H70
N.
:
+%
!
F9A6IJ>/A
`
;A06A40H
L
ZAH.6[AH43.0746.H/A
`
;A06A7Y$
%
!%""#
*%&
%
期
!!!!!!!!!
关晓弯!等$石榴果肉
$
%
!%""#
基因克隆及不同温度处理下的表达分析
位点和酶蛋白的球体部分!在不同的物种中是高度 保守区-#,.将
$
%
!%""#
推导的氨基酸序列与其
图中从上至下依次代表的是石榴*巨桉*荷花*黑果茶*麻风树*甜橙*可可*
陆地棉*胡杨*葡萄*锦绣杜鹃*蔓长春花*仙客来*野茶树*矮牵牛的
N%OOP
氨基酸序列
图
&
!
石榴
G
:
N%OOP
与其他植物
N%OOP
氨基酸序列比对
F9A43.0746.H/A
`
;A06A/.0[9A34
L
U9.69YZ73[9A[7
L
[7[9AK7[[73ZA
L
ZA/A0[./
$
$13()
%
0)1).9
!
&()+
,-
./
%
0)123/
!
78+9:51(3
;
80)
!
@3:8/13
%
09
!
4).05
-
6)(0()/
!
<3.0//3181/3/
!
D685:059)()()5
!
C5//
,-
39630/.9
!
$5
-
+/8
-
60).3()
!
F3.3/J313
;
80)
!
@65252812051c
-
+(609
!
F31()9)
K
50
!
<
,
(+)981
-
80/3(9
!
<)98++3)/3181/3/
!
$8.13)c6
,
:032)
N.
:
+&
!
>5.
:
03A0[7Y43.0746.H/A
`
;A06A/7YG
:
N%OOPU.[9N%OOPYZ737[9AZ
L
540[/
"&&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
节点数字表示
B77[/[Z4
L
验证中基于
#"""
次重复的可信度"大于
%"R
显示#&标尺代表遗传距离&括号内编号为氨基酸登录号
图

!
花青苷合成相关
!%""#
基因编码的氨基酸系统进化树
B77[/[Z4
L
\45;A/
:
ZA4[AZ[940%"R4ZA/97U04[07HA/K4/AH70#"""ZA
L
5.64[.70/
&
F9A/645AK4Z
ZA
L
ZA/A0[/
:
A0A[.6H./[406A
&
F9A466A//.70J7+./
:
.\A0.0KZ46CA[/
N.
:
+
!
G9
]
57
:
A0A[.6[ZAA673
L
4Z.0
:
[9A43.0746.H/A
`
;A06A/7Y$
%
!%""#[7
40[976
]
40.0K.7/
]
0[9A/./)ZA54[AH!%""#YZ737[9AZ/
L
A6.A/
它植物中调控花青苷合成代谢的
N%OOP
氨基酸序
列进行比对!并构建系统进化树 "图

#!发现
G
:
N%OOP
与 巨 桉
2
:
N%OOP!
"
>66A//.70
$
TG
0
"#""&"1#+#
#的进化关系相对较近
ABD
!
不同温度处理石榴果肉
1
2
3$4%45
基因的差
异表达分析
应用
=F)G?=
技术分析
$
%
!%""#
基因在不
同贮期温度石榴果肉中的表达特性"图
$
#在
"<
贮藏条件下!
"
"
#&H
期间!
$
%
!%""#
基因表达量
一直处于一个较低水平&
#&
"
&!H
!
$
%
!%""#
基因
表达量快速上升!达到高峰!为
"H
基因表达量的
%+&
倍!且各阶段基因表达量差异显著&
$H
又开
始下降!仅次于
&!H
在
<
和
#" <
条件下!
$
%
!%""#
基因表达量均呈现快速上升趋势!到
$
H
时!基因表达量分别为
"H
的
+#
和
&+"!
倍&在
#<
贮藏条件下!
"
"
#&H
期间!
$
%
!%""#
基因表
达量急剧上升!
#&H
时达到第一个高峰!为
"H
基因
表达量的
%+**
倍&
#&
"
&!H
期间!基因表达量急剧
下降!下降了
!+&1
倍!且各个阶段基因表达量差异
显著&到
$H
时!基因表达量又急剧上升!达到最大
值!为
"H
基因表达量的
+!$
倍结果表明$在
"
<
*
<
*
#"<
处理条件下!石榴果肉
$
%
!%""#
基
因表达量随着贮藏时间"
"
$H
#的增长呈不断上
升趋势&在
#<
处理条件下!石榴果肉
$
%
!%""#
基因表达量
#&H
后表现不稳定
用
XGXX
软 件 对 不 同 温 度 处 理 石 榴 果 肉
$
%
!%""#
基因表达量与花青苷含量"图
#
#进行相
关性比较分析可知!
$
%
!%""#
基因表达与花青苷
含量呈显著正相关"
0b"+,&!
!
$
%
"+"
#
小写字母表示同一温度不同贮期相对表达量
"+"
水平差异显著性
图
$
!
不同温度处理石榴果肉
$
%
!%""#
的相对表达量
I.YYAZA0[07Z3455A[[AZ/.0[9A675;303A40
/.
:
0.Y.640[H.YYAZA06A4370
:
ZA54[.\AA^
L
ZA//.707Y[9A/43A
[A3
L
AZ4[;ZAH;Z.0
:
H.YYAZA0[/[7Z4
:
A
L
AZ.7H/4["+"5A\A5
N.
:
+$
!
=A54[.\AA^
L
ZA//.707Y$
%
!%""#.0
L
73A
:
Z404[A
L
;5
L
;0HAZH.YYAZA0[[A3
L
AZ4[;ZA[ZA4[3A0[/
%
!
讨
!
论
本研究通过分析不同温度贮期石榴果肉的花青
苷含量发现$适当的低温"
#"<
#促进花青苷含量增
长!这在许多植物中已经得到证实如
M4340A
等-#1.对葡萄*谢兴斌-#*.对苹果*李智-!".对茶树的研
究表明!适当的低温条件促进葡萄皮*苹果皮*茶树
芽叶花青苷积累而在较低温度"
<
和
<
#贮期
下!石榴果肉花青苷含量增长缓慢!张学英等-!#.对
李的研究表明!李果实在
"<
低温下的花青苷含量
积累缓慢!说明促进植物花青苷积累的低温也是有
一定阈值范围的!非常低的温度不利于花青苷的合
成温度稍高"
#<
#时!石榴果肉花青苷含量不稳
#&&
%
期
!!!!!!!!!
关晓弯!等$石榴果肉
$
%
!%""#
基因克隆及不同温度处理下的表达分析
定
P;9
等-!!.对菊花*
G7;HA5
等-!%.对葡萄的研究
表明!高温"
%"<
左右#会影响花青苷的稳定性!也
就是说当温度升高时!花青苷的合成速率会减慢!降
解速率却增加!进而导致花青苷的积累量降低!至于
高温对采后石榴果肉花青苷积累及稳定性的影响!
还有待进一步研究可见!温度不仅影响采后石榴
果肉花青苷积累!还影响其稳定性
经过
N%OOP
氨 基 酸 多 序 列 比 对 发 现!
G
:
N%OOP
含有与其他
N%OOP
相似的保守区!不同
物种
N%OOP
氨基酸序列的主要差异存在于
J
端约
%#
个氨基酸!这段序列主要含有疏水氨基酸残基!
是膜插入点的信号序列-!&.
N%OOP
属于细胞色素
G&"
家族的单加氧酶-##.!细胞色素
G&"
家族基因
含有
%
个特征保守氨基酸序列$
J
端
?MG
基序
(
GG@G
)*
_
螺旋基序(
>@FIF
)和血红素"
PB=
#结
合区域序列(
N@>@==_?>@
)
-
#,
.

G
:
N%OOP
仅含
有
?MG
基序!缺少
_
螺旋基序和
PB=
结合区域序
列!这与矮牵牛"
$8.13)c6
,
:032)
#的
G9N%OOP
氨基酸序列"
B>N$&&1%+#
#相一致至于这些基序
的缺乏对石榴果肉花青苷的生物合成有什么具体影
响!还需要进一步验证
通过
=F)G?=
技术分析发现!不同温度贮期石
榴果肉
$
%
!%""#
基因的相对表达量存在差异$适
当的低温"
<
和
#"<
#促进
$
%
!%""#
基因的表
达&而在较低温度"
<
#下!
$
%
!%""#
基因的表达
量增 长 缓 慢&温 度 稍 高 "
# <
#时!石 榴 果 肉
$
%
!%""#
基因的表达量虽然显著上升!但不稳定
可见!温度影响
$
%
!%""#
基因的表达另外!不
同贮期温度石榴果肉
$
%
!%""#
基因表达与花青
苷含量呈显著正相关!推测
$
%
!%""#
基因促进石
榴果肉花青苷的合成这与近年来国内外许多研究
结果相一致!如葡萄"
F3.3/J313
;
80)
#
FJ!%""#
-
!
.
和月季"
@5/)6
,
:032)
#
@6!%""#
-
!$
.基因的表达有
助于花青苷含量的增长另外!通过转基因技术引
入外源
!%""#
基因来改变植物花青苷积累!已在
多种植物上获得成功!如风铃草"
<)9
-
)1+)9823*
9
#的
<9!%""#
基因-!,.和野茶树 "
<)98++3)
/3181/3/
#的
基因-!1.转化烟草!转化株系
中均提高了花青苷含量花青苷是影响石榴品质的
一个重要因子!由于花青苷生物合成途径复杂!至于
其他结构基因*调节基因和环境因子对采后石榴果
肉花青苷积累的影响!还有待进一步研究
参考文献!
-
#
.
!
WP>aTS
!
ME>JWP
!
N2J@VQ
!
8.)++?570.0
:
40HA^
L
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/.707Y40[976
]
40.0K.7/
]
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A0A/.0ZAH40HU9.[A
L
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Z404[A
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Q
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$+)1.@8/8)0(6
!
"#
!
#!1
$
1,)$*$+
-
!
.
!
冯玉增!胡清波
+
无公害农产品高效生产技术丛书$石榴-
d
.
+
北京$中国农业大学出版社!
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冯立娟!尹燕雷!苑兆和!等
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苷含量及品质指标的变化-
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!
AE
"
%
#$
#,*)#1%+
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N2J@VQ
!
M_JMV
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ME>JWP
!
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40.0
670[A0[40H
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!
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!
AE
"
%
#$
#,*)#1%+
-
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赵贝塔
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不同石榴品种花色苷的提取*纯化工艺及抗氧化活性
研究-
I
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陕西杨凌$西北农林科技大学!
"#&+
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郭松年!董周永!孙海燕!等
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石榴汁花色苷热稳定性及其降解
动力学研究-
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农业工程学报!
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!
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XEJPM
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8.)++X[4K.5.[
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4)
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D0)1/)(.351/5
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.68<6318/8=5(38.
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!
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$
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胡
!
可!韩科厅!戴思兰
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环境因子调控植物花青素苷合成及呈
色的机理-
Q
.
+
植物学报!
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D%
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