全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
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&
%#"*""%1
#
作者简介$梁文裕"
#(*(
#!男!博士!教授!主要从事植物资源及植物分子生物学的研究
2)34.5
$
5.40
6
7
8
!""(
!
#*%+9:3
发菜耐旱相关蛋白
$%&()
的
基因克隆与表达分析
梁文裕#!杨
!
佳#!吴诗杰#!焦广飞!!王淑萍#!徐婷婷#
"
#
宁夏大学 生命科学学院!银川
,$""!#
&
!
福建农林大学 生命科学学院!福州
%$"""!
#
摘
!
要$在发菜耐旱差异蛋白质组学研究中!发现假定蛋白"
;
8<
:=>?=.945
<
@:=?.0ABC)"#
#在干旱胁迫条件下表达
量逐渐增加根据已知氨基酸序列设计简并引物克隆
!"#)"#
基因!长度为
%!,D
<
"
E?0F40G
登录号为
;H1$&!11
#生物信息学分析表明!该基因具有较高保守性!蛋白质二级结构主要由
"
螺旋和随机卷曲构成!是亲
水性的膜外蛋白!有
$
个
I?@
磷酸化位点!
#
个
J>@
磷酸化位点将
!"#)"#
基因在大肠杆菌中表达!获得预期大
小的重组蛋白"
#!+&GK
#
LJ)MNL
分析表明!
!"#)"#3LAO
在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加!与
ABC)"#
蛋
白的表达趋势一致
关键词$发菜&假定蛋白
ABC)"#
&干旱胁迫&基因克隆&原核表达
中图分类号$
P,1$
&
P,1*
文献标志码$
O
*+",-.,!/0
1
2-33#","45
61
"78-7#9.+:2"7-#,$%&();-+.7-!
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8
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<
@?//.:0
!!
干旱是影响植物的最主要非生物胁迫因素之 一植物对干旱胁迫的响应根本上决定于基因的时
空表达与调节(#)%)这些基因至少可分为两类!一类
是用于防止细胞脱水的结构基因!另一类是胁迫诱
导的与基因表达和信号传导有关的调节基因这些
干旱胁迫诱导基因产物不仅通过重要代谢蛋白保护
细胞结构!而且起调节信号传导和基因表达的作用
随着分子生物学技术不断发展!人们对植物抗旱相
关基因表达的研究越来越集中到特异基因的分离克
隆及其在干旱胁迫过程中的特异表达(&)$)方面
发菜"
!$%&$
(
)*
+
,))-
(
$./,
#是一种分布于干
旱半干旱荒漠草原地区的陆生固氮念珠藻!在结构
和生理上表现出强烈的旱生生态适应性(*)1)在发
菜耐旱蛋白质组学研究中!获得了大量差异表达的
蛋白!其中假定蛋白"
>
8<
:=>?=.945
<
@:=?.0ABC)"#
#
在
!)K2
图谱上显示的分子量为
#!+!GK
!
<
Q
为
&+$(
!它在干旱胁迫条件下表达量明显高于吸水条
件下的表达量(*)这种变化表明该蛋白可能在发菜
耐旱机制中具有重要作用本研究根据串联质谱分
析所得的肽段氨基酸序列!设计简并引物克隆
!"#)"#
基因并进行生物信息学分析!研究其原核
表达和干旱胁迫下转录水平变化!为进一步研究发
菜
ABC)"#
结构及其在干旱防御和胁迫应答等方面
的功能提供依据
#
!
材料和方法
)+)
!
材
!
料
发菜采自宁夏香山发菜自然生长地!人工模拟
发菜生长环境进行培养培养条件为温度"
!$_!
#
`
!光周期为
#!>
光照%
#!>
黑暗!光照强度为
!""
#
3:5
*
3
!
*
/
#
每天供水
#
次!供水量一致!使
发菜充分吸胀培养
%"后测定光合速率和呼吸
速率!确保处于正常生长状态"与野生状态对照#
样品处理$发菜藻体充分吸水
&>
"
&;OL
#!藻体含
水量为"
1%$_#"
#
a
&发菜藻体充分吸水
&>
后干旱
胁迫
&1>
"
&1;OK
#!藻体含水量为"
(+$_!
#
a
将
样品立即放入液氮中冷冻后置于
1" `
冰箱中
备用
)+C
!
方
!
法
)DCD)
!
发菜
167()
基因
:*;
扩增
!
发菜基因组
KAO
提取参考梁文裕等的方法(*)
根据
ABC)"#
的
HOCKQ)JW[)JW[
%
HI
肽质
量指纹图谱测定的部分氨基酸序列设计简并引物!
上游引物为
M
#
"
$b)OJEOEJOONNN
"
N
%
O
#
NJ
"
J
%
O
#
EJONO)%b
#!下游引物为
M
!
(
$b)
"
N
%
J
#
JO
"
N
%
J
#"
E
%
O
#
NOEOO
"
E
%
N
#
J
"
J
%
O
#
NJENEOJ)%b
)
MNL
扩增条件为
(&`
预变性
13.0
!
(&`
变性
$"
/
!
&(`
退火
$"/
!
,!`
复性
#3.0
!
%$
个循环&最后
,!`
延伸
#"3.0
MNL
扩增产物经
#a
"
2
%
3
#琼脂糖凝胶电泳
后!回收纯化连接到
<
HK
#1
)J
载体上!然后转化至
大肠杆菌
K;$
"
感受态细胞!挑取阳性克隆!
MNL
检测后送至天根公司测序
)+C+C
!
序列分析
!
将测序结果进行
FCOIJ
检索!
进行基因确认运用
KAOHOA
软件对基因序列
及推导出的氨基酸序列与其他物种进行同源性比较
分析运用
KAO/=4@*+"
软件对氨基酸序列进行
分析利用瑞士生物信息学研究所"
I7.//Q0/=.=S=?
:XF.:.0X:@34=.9/
!
IQF
#
M@:=I945?
程 序
c
8
=?
和
K::5.==5?
算法!对发菜
ABC)"#
氨基酸序列做亲%疏
水性 分 析利 用
KAOHOA
+
MFQCCTWA)E2L)
COAK
信息库+
IRQIIHWK2C
网站和
KAOI=4@
软件对
;
8<
:=>?=.945
<
@:=?.0ABC)"#
二级结构进
行预测分析利用丹麦科技大学"
KJV
#
JH;HH
I?@Z?@Z+!+"
程序进行
ABC)"#
序列跨膜区分析
"
>==
<
$%%
777+9D/+\=S+\G
%
/?@Z.9?/
%
JH;HH
%&
参数选择$
2Y=?0/.Z?7.=>
6
@4
<
>.9/
#利用丹麦科
技大学"
KJV
#
A?=M>:/!+"I?@Z?@
程序对
ABC)"#
做磷酸化位点分析"
>==
<
$%%
777+9D/+\=S+\G
%
/?@Z.9?/
%
A?=M>:/
%#
)DCDE
!
167()
基因原核表达
!
根据发菜
!"#)
"#
基因测序结果!设计扩增目的基因的引物
N
#
"
$b)
NENEEOJNNOJEOEJOONNNONJJEJONO)
%b
#和
N
!
"
$b)NNENJNEOEJJOJONOEOOEJ)
JNJENEOJ)%b
#!并分别在引物
$b
端添加保护碱基
"方框部分#以及
4*/;
$
和
"5$
$
限制性酶切位
点"下划线部分#
MNL
扩增条件为
(&`
预变性
1
3.0
!
(&`
变性
$"/
!
$"`
退火
$"/
!
,!`
延伸
#
3.0
!共进行
%$
个循环!
,!`
延伸
#"3.0
用
4*/;
$
和
"5$
$
双酶切纯化的
MNL
产物
和
<
2J)!14
载体!回收酶切产物!连接目的基因与
载体片段!转化
K;$
"
感受态细胞!
c40
抗性筛选阳
性克隆!提取质粒酶切鉴定!鉴定正确的质粒转化
FC!#
感受态细胞!以终浓度为
#33:5
*
C
#
QMJE
诱导
!"#)"#
表达
#!+$aIKI)MOE2
电泳检测
并分析
)DCDF
!
发菜总
;$?
提取及反转录
!
发菜总
LAO
提取+去除基因组
KAO
和总
LAO
纯度测定等参照
C.40
6
(
*
)的方法将去除基因组
KAO
的
LAO
直接
$&
#
期
!!!!!!!!!!!
梁文裕!等$发菜耐旱相关蛋白
ABC)"#
的基因克隆与表达分析
作为反转录模板!反应体系
!$
#
C
反应体系包含
LAO
模板
#"
#
C
!
K2MN
水
$
#
C
!
*
个碱基的随机引
物
<
"
A
#
*
"
!"
#
3:5
%
C
#
#
C
!混匀后于
,"`
反应
$
3.0
!冰浴
$3.0
!再依此加入
$dHHCeLJFSXX?@
$
#
C
!
\AJM
"
#"33:5
%
C
#
!
#
C
!
LA4/?Q0>.D.=:@
;MLQ#
#
C
!
HHCeLA4/?;#
#
C
混匀后于
&!
`
反转录
#>
反应产物可直接用于
MNL
反应或
!"`
长期保存备用
)DCDG
!
167()
表达的
;H:*;
分析
!
利用
WHQ)
EO!
软件设计发菜
!"#)"#
引物上游引物
LJ)
M
#
"
$b)OOEJJNJENEOJOOJEJJE)%b
#!下游引
物
LJ)M
!
"
$b)EOENOEJEENJEOOEJOEJ)%b
#!
#*/@LAO
的
<
#
"
$b)NJEONONJEOEEEONEOO)
%b
#和
<
!
"
$b)NEEEONJJOONNNOONOJJ)%b
#为
内标基因的上下游引物
提取吸水和干旱胁迫条件下发菜总
LAO
!按照
前述反转录方法分别合成
9KAO
后进行
LJ)MNL
先取不同的
9KAO
各
#
#
C
!以
#*/@LAO
基因作为
内标!根据其
LJ)MNL
产物亮度调节需要加入
9K)
AO
模板的量!然后再根据确定的
9KAO
模板量进
行
!"#)"#
的
LJ)MNL
检测
MNL
扩增条件为
(&
`
预变性
$3.0
!
(&`
变性
$"/
!
$$`
退火
$"/
!
,!
`
延伸
#3.0
!共进行
!1
个循环!
,!`
延伸
#"3.0
)+E
!
数据处理
将所得实验数据用
IMII#%+"
进行方差分析!
检验结果的差异显著性
!
!
结果与分析
CD)
!
发菜
167()
基因的
:*;
扩增及目的片段的
克隆
将以发菜总
KAO
为模板进行
MNL
扩增的产
物经
#a
"
2
%
3
#琼脂糖凝胶电泳鉴定!得到一条长
与预期大小相符的
KAO
扩增片段"图
#
#
用
KAO
胶回收试剂盒回收目的片段连接到
<
HK#1)J
载体上!转化到大肠杆菌
K;$4
!挑选阳
性单菌落进行
MNL
鉴定!扩增产物在
$""D
<
处出
现特异性条带!表明外源目的片段已成功克隆
"图
!
#
CDC
!
发菜
167()
基因序列测定及同源分析
为进一步鉴定所得到的
KAO
片段是否确为
!"#)"#
基因!运用
<
HK
#1
)J
载体通用引物对目的
KAO
片段进行双向测序结果表明!目的
KAO
片
段大小为
%!,D
<
把测序结果提交
ANFQ
进行
FCOIJ
检索!确定获得了发菜
!"#)"#
基因编码
序列!
E?0F40G
登录号为
;H1$&!11
"图
%
#
由
!"#)"#
基因序列所推译的氨基酸序列表
明
ABC)"#
包含
#"1
个氨基酸残基通过
KAO/=4@
*+"
分析表明
ABC)"#
分子量为
##+,*$GK
!等电点
为
&+&!
!带电荷总氨基酸为
!(+*%a
!极性氨基酸占
!$+""a
!疏水氨基酸占
%,+(*a
!酸性氨基酸和碱
性氨基酸分别占
#,+$(a
和
#"+#(a
在
;
8<
:)
=>?=.945
<
@:=?.0ABC)"#
中含量丰富的氨基酸"频
率#分别为
O54
"
#%+1(a
#+
C?S
"
##+##a
#+
E5S
"
#"+#(a
#+
O@
6
"
(+!*a
#+
O/
<
"
,+&#a
#+
I?@
"
,+&#a
#+
e45
"
,+&#a
#
应用
KAOHOA
软件将发菜
!"#)"#
基因核
苷酸序列和氨基酸序列与
E?0F40G
中收录的相关
序列进行
FCOIJ
比较!发现发菜
!"#)"#
基因具
有较高保守性!与点形念珠藻"
!1
6
78&-
(
$./,MNN
,%#"!
#假定的保守蛋白基因核苷酸相似性达
(%a
!
氨基酸相似性达
(!a
&与泡沫节球藻"
!$97)*.-*
图
#
!
!"#)"#
基因
MNL
扩增结果
#
+
!+!"#)"#
基因&
H+H4@G?@
[.
6
+#
!
MNL43
<
5.X.94=.:0:X!"#)"#
6
?0?
#
!
+!"#)"#
6
?0?
&
H+H4@G?@
图
!
!
!"#)"#
基因重组质粒阳性转化子
"
K;$4
%
ABC)"#
#的
MNL
检测
H+H4@G?@
&
#+!"#)"#
基因阳性转化子
"
K;$4
%
ABC)"#
#&
!+
阴性对照
[.
6
+!
!
MNL.\?0=.X.94=.:0:X
<
:/.=.Z?
=@40/X:@340=
"
K;$4
%
ABC)"#
#
H+H4@G?@
&
#+!"#)"#
6
?0?
<
:/.=.Z?=@40/X:@340=
"
K;$4
%
ABC)"#
#&
!+A?
6
4=.Z?9:0=@:5
*&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
%6
7/-
+
,8*NNT(&#&
#假定保守蛋白基因核苷酸相
似性达
1#+,a
!氨基酸相似性为
1#+$a
&与多变鱼
腥藻"
:8*8*,8*;*.-*<-)-%OJNN!(&#%
#基因核苷
酸相似性为
,1+%a
!氨基酸相似性为
1"+*a
&与念
珠藻"
!$%&$/
<
+MNN,#!"
#基因核苷酸相似性为
,,+&a
!氨基酸相似性达
,(+*a
而与颤藻"
=%-)>
)*&$.-*/
<
+MNN*$"*
#基因核苷酸序列和氨基酸相
似性最低!分别为
$(+%a
和
*!+"a
"图
&
#
CDE
!
发菜
$%&()
的疏水性+跨膜区+磷酸化位点
分析及二级结构预测
对发菜
ABC)"#
氨基酸序列疏水性分析表明!
在第
#"#
位的
E5S
亲水性最强!第
#!
位的
E5
8
疏水
性最强从整体来看!亲水性氨基酸主要分布在肽
链的中部!且多于疏水性氨基酸整个多肽链表现
为亲水性!表明
ABC)"#
是亲水性蛋白
利用丹麦科技大学"
KJV
#的
NFI
服务器上的
JH;HHI?@Z?@Z+!+"
程序进行蛋白序列跨膜区
分析结果表明!
ABC)"#
为膜外蛋白
利用
A?=M>:/!+"I?@Z?@
程序对蛋白序列中的
I?@
+
J>@
和
J
8
/%
种氨基酸残基可成为磷酸化位点
作出预测结果表明!发菜
ABC)"#
有
$
个
I?@
磷
酸化位点!分别位于第
*1
+
,#
+
,*
+
,,
+
#",
位有
#
个
J>@
磷酸化位点!位于
#"*
位
!!
运用
KAOHOA
软件+
MFQCCTWA)E2LCOAK
信息库+
IRQIIHWK2C
网站和
KAOI=4@
软件对
ABC)"#
二级结构进行预测分析表明!
&
种方法预测
的二级结构中!虽然不同结构的氨基酸数目和百分
比有一定差异!但这主要是由于方法和原理不同所
导致的综合分析认为!发菜
ABC)"#
二级结构主
要是由
"
螺旋和随机卷曲构成"表
#
#
CDF
!
167()
在
8"&*-
中的表达
以质粒
<
HK
#1
)J)ABC)"#
为模板!
MNL
扩增
!"#)"#
基因将
MNL
扩增产物回收纯化!用
4*/;
$
和
"5$
$
进行双酶切后!与同样经
4*/;
$
和
"5$
$
双酶切的质粒
<
2J!14
"
f
#相连接!获
得
!"#)"#
基因表达载体
<
2J!14)!"#)"#
将重
组质粒
<
2J!14)!"#)"#
转化到大肠杆菌培养!通
过卡纳青霉素抗性挑选阳性克隆!提取质粒进行
MNL
和双酶切验证
<
2J!14)!"#)"#
经双酶切
后!在
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处出现
#
条特异条带!与预期片段大
小一致"图
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KAO
片段就
是
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基因
将
<
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阳性质粒转化到
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感
受态细胞中!并以
QMJE
诱导
ABC)"#
蛋白表达!
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电泳!结果表明有大量外源蛋白
表达"图
*
#!参照蛋白分子量标准!外源蛋白分子量
图
%
!
发菜
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的核苷酸序列"上行#及推导氨基酸序列"下行#
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图
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核苷酸序列"
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期
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梁文裕!等$发菜耐旱相关蛋白
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的基因克隆与表达分析
表
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发菜
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二级结构预测
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折叠
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转角
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随机卷曲
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氨基酸数目&
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图
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阳性质粒
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诱导
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蛋白总量的
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图
,
!
干旱胁迫条件下发菜
!"#)"#
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表达谱"
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#及表达量差异"
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发菜干旱胁迫条件下
167()
基因表达特征
提取不同干旱条件下发菜总
LAO
!并进行定
量取等量总
LAO
进行反转录!并取等量反转录
产物进行
LJ)MNL
扩增!最后取等量
MNL
产物在
琼脂糖凝胶电泳分析结果"图
,
#表明!在干旱胁
迫条件下表达量明显高于充分吸水时的表达量"
?
#
"+"$
#!这与
!"#)"#
在干旱胁迫下的表达趋势
基本一致
%
!
讨
!
论
对某一新蛋白进行生物信息学分析是研究蛋白
质最基本和最常用的方法!多数情况下可以发现该
蛋白的同源性或其拥有的家族成员!并且可以通过
已知功能的其它成员对所关注蛋白功能+进化速度
等做出合理推断()#")本研究根据干旱胁迫条件下
差异表达的
ABC)"#
氨基酸序列设计简并引物!成
功克隆发菜中
!"#)"#
基因同源性比较发现发
菜
!"#)"#
基因具有较高保守性!与点形念珠藻
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#假定的保守蛋白基因
核苷酸相似性达
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!氨基酸相似性达
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生物信息学分析表明
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西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
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有
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有
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个磷酸化位
点二级结构预测表明发菜
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主要由
"
螺旋
和随机卷曲构成这为进一步研究发菜
ABC)"#
结
构及其在发菜干旱防御和胁迫应答以及提高发菜抗
旱机制等方面奠定了基础此外!本研究构建了发
菜
!"#)"#
高效表达载体!
$>
的表达量占可溶性
蛋白
*$a
以上!且以可溶性蛋白的形式存在!为今
后利用工程菌大量生产
ABC)"#
提供了试验依据
蛋白质"酶#是基因表达的产物!蛋白质生物学
功能的发挥是多个因素综合作用的结果发菜
ABC)"#
的表达与其生长发育和所处的环境密切相
关发菜生长于极端干旱的环境中!其风干含水量
在
,+%a
&
##+!a
之间!饱和含水量在
*#*a
&
#!$1+&a
之间!相对含水量极低!只有
#a
左右!与
其他旱生植物相比!对极端干旱环境具有更强的适
应能力(##)此外!发菜在干旱胁迫条件下!新陈代
谢减弱!光合活性降低!固氮能力下降!而恢复吸水
时!光合活性和固氮能力升高(#!)#&)本研究表明!
!"#)"#3LAO
在干旱胁迫条件下表达量逐渐增
加!与
ABC)"#
的
!)K2
的结果一致(*)!这一结果暗
示
!"#)"#
在发菜耐旱作用中可能发挥了重要作
用然而!发菜在其生长发育和耐旱过程中!
!"#)
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究竟是单独起到抗逆作用还是与其他因素相互
影响共同抵御干旱环境的!仍需要深入研究
参考文献!
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