全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家十二五科技支撑计划"
!"#!123!#1"&"!
#&国家公益性行业科研专项"
!"#""*"!+
#
作者简介$荆
!
腾"
#++#(
#!男!在读硕士研究生!主要从事杜仲育种研究
4)56.7
$
890
:
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#$%,<=5
"
通信作者$杜红岩!研究员!博士生导师!主要从事杜仲育种(栽培与综合利用的研究
4)56.7
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#!$,<=5
杜仲叶片不同发育时期数字基因表达谱分析
荆
!
腾#!!王
!
淋#!!乌云塔娜#!!杜红岩#!"
"
#
中国林业科学研究院经济林研究开发中心!郑州
*&"""%
&
!
国家林业局杜仲工程技术研究中心!郑州
*&"""%
#
摘
!
要$为在转录水平解析杜仲叶片发育过程中的基因表达模式!该研究通过数字基因表达谱技术对)华仲
$
号*
杜仲叶片从展叶"
*
月#到落叶"
#"
月#不同发育时期的基因表达水平进行比较分析!共获得差异基因
%""!
个!其中
#$*
个表达量上调!
#!%@
个下调!这些差异表达基因主要行使催化(氧化还原等功能!参与代谢过程和生物过程
等&进一步
A68;B6
?
富集分析发现!苯丙素类生物合成途径相关基因被富集!其中调控绿原酸合成的
$
个基因差异
表达显著&对这些基因表达模式进行分析显示!
*
月中旬和
+
月中旬基因的表达量较高!暗示这两个时期对于绿原
酸的合成具有重要作用荧光定量
CD)AEC
检测
$
个绿原酸合成相关基因和
#!
个随机选择的差异表达基因!验
证结果显示表达谱测序结果可靠该研究结果为揭示杜仲叶片在不同发育时期的分子调控机制奠定了基础!并为
深入解析杜仲绿原酸合成机理!进而通过分子育种手段提高杜仲绿原酸含量提供新的路径
关键词$杜仲叶片&数字基因表达谱&差异基因&绿原酸
中图分类号$
F@+
文献标志码$
2
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(
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$
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:
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Q=
:
90.<6<.>
!!
杜仲"
!"#$%%&"(%$&)*+[7.S9Q
#是中国特有
的名贵木本药用树种!在中国
!
个省"市(自治区#
均有栽培+#,长期以来!人们以杜仲皮入药!其具有
降压(补肾(强筋骨(保肝利胆(清热解毒等功效+!)*,
而现代药理学研究证实杜仲叶和杜仲皮的化学成分
基本一致!具有同等功效!可以以叶代皮入药+&,杜
仲叶作为一种中药材已收录于
!"#"
版-中华人民共
和国药典.苯丙素类是杜仲中主要的药用活性成
分之一!是衡量杜仲叶片药用价值的重要指标迄
今为止!杜仲中发现的苯丙素类共
##
种+$,!其中研
究最多的是绿原酸!绿原酸抗菌作用强!具有消炎(
止血(抗肿瘤(降压等多种药理作用+,
过去对杜仲叶片的研究主要集中在化学成分的
提取(测定和药理功效方面!在基因水平的研究相对
较少近年来!杜仲全基因组测序工作已初步完成!
并将转录组测序技术应用到了杜仲研究领域!为杜
仲数字基因表达谱的研究奠定了基础由于基因的
表达受时间(空间和内外因子的影响!是一复杂的动
态过程!而基因表达谱的分析正是通过对基因时空
表达的分析来探索生物体内复杂的生理过程+@,
本研究应用数字表达谱技术对杜仲叶片从展叶
"
*
月#到落叶"
#"
月#的生长发育过程中基因表达情
况进行分析!以相邻
!
个时期为对照!分别检测各个
比较组合中的差异表达基因!应用生物信息学方法
初步分析了这些差异基因所行使的功能和参与的代
谢途径!以期了解杜仲叶片生长发育过程中的分子
调控机制!获得绿原酸生物合成途径相关的酶基因!
为相关基因的克隆与鉴定!进而为提高杜仲绿原酸
含量的分子育种奠定基础
#
!
材料和方法
>,>
!
材料及处理
试验材料选自国家林业局泡桐研究开发中心
"河南郑州#的)华仲
$
号*枝条!根据该树叶片以往
生长发育特性!分别于
!"#*
年
*
月
#@
日(
&
月
#@
日(
$
月
#
日(

月
#
日(
@
月
#$
日和
+
月
!"
日选
形态特征基本一致的叶片!迅速采集并放入液氮冷
冻!后移至
(@"]
超低温冰箱保存备用
>,?
!
方
!
法
>@?@>
!
总
AB$
提取纯化及文库构建
!
总
CI2
提
取(纯化和文库构建委托北京诺禾致源公司完成
>,?,?
!
测序数据分析
!
高通量测序"
H7X5.06
O.Y9
D^
!"""
%
.^/9
D^
#得到的原始序列经去接头(
去除不确定碱基信息比例大于
#"_
的
Q96>/
(去除
低质量"质量值
/F
#
&
的碱基数占整个
Q96>
长度
&"_
以上的
Q96>/
#筛选得到过滤序列!用于后续分
析通过测序
A;Q9>
数值(
JE
含量等评估测序质
量&用
D=
T
O68!
软件将过滤后的测序序列进行基因
组定位分析&采用
ODY9
软件对各样品进行基因
表达水平分析!使用的模型为
X0.=0
采用
CA^
和
CA` ^
+,值进行标准化处理!将归一化后的表达数
据作为分析对象并采用
34Y9
方法+#",筛选出
&
个比较组合的差异表达基因!并对所有差异基因进
行
J[
功能显著性富集分析和
A68;B6
?
显著性富
集分析
>@?@C
!
荧光定量
ADEFGA
检测
!
为检测测序结果
的可靠程度!本研究使用实时荧光定量
AEC
对
$
个
绿源酸合成相关的基因以及随机选取
#!
个基因进
行表达量测定!其中
#!
个基因为从
4X&#@S/
4X*#@
比较组合中随机选取的
$
个显著下调基因&
从
4X+!"S/4X@#$
比较组合中随机选取的
$
个显
著上调基因杜仲叶片各个时期样品
CI2
采用
F.2
:
90
公司
CI2
提取试剂盒"
CI96/
?
A76085.0.
.`8
#提取!
<3I2
第一链合成根据
H0S.89Q=
:
90
公司
的
YX
T
9QYT
8
D^
"
R.Q/8)Y8Q60>Y
?
08;9/./Y
?
/895
反转录成第一链!依据数字基因表达谱测序所得序
列!通过
AQ.59QAQ95.9Q&,"
软件设计引物!内参基
因采用
-#.&/
"表
#
#荧光定量
AEC
反应程序$
+&
]
预变性
%"/
&
+&]
变性
&/
(
$"]
退火
%*/
!
*"
个
循环反应结束后!以内参基因在不同时期叶片中
的表达量为
#,"
!采用
!
(
$$
0
8法对表达量进行分析
计算实验
%
次重复
!
!
结果与分析
?,>
!
测序数据评估
为分析杜仲叶片不同时期基因表达情况!构建了
4XL*#@
(
4XL&#@
(
4XL$#
(
4XL#
(
4XL@#$
和
4XL+!"
共
$
个
<3I2
文库对
$
个文库进行
CI2
测序!结果"表
!
#表明!
$
个文库经
O.Y9
!"""
%
.^Y9
高通量测序后得到的过滤序列分别为
!!#%#*
(
$
%@"$@&
(
$###*"
(
$$#""%@
(
$&"%*##
和
%@&$@
!
各占原始序列的
++,*_
(
++,#+_
(
++,!@_
(
++,**_
(
@&!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
>
!
荧光定量
ADEFGA
基因信息
D6P79#
!
J909.0U=Q568.=0U=QCD)AEC
基因编号
J909<=>9
基因
H3
J909H3
引物
AQ.59Q
"
&a
%
%a
#
上游
R=QB6Q>
下游
C9S9Q/9
-#.&/ ( JDJ2E22DJJ22EDJJ22DJJ 2J2EJJ2JJ2D2JEJDJ2JJ
!"1-2# 4ME#+&&" DJ22J22J2DJJDJJEJJ2DD2 22JE2DJJ2JJEEEDJJDJ
!"1-2! 4ME#**%* 2J2DJ2DDJ22EJJJ2J2D 2E222JDJEJ2EJ2J2D22
!"1-2% 4ME#+&*+ J2E22DE22E2EEEDE2DEE 2EDJEEJDEEEJDDD2EE
!"0*3 4ME"@" JEE2EJ2J2DDJ2E2EEJ EE2EE2JJE2DDJ2EE2J
!"*02 4ME##*% EDEEDEDJEEJE222JDE DDEE2JDDE2DEEJEEDE
!"0%3 4ME!&+$+ EEDEEDEDDDJEEDEE2D JDEE2D22DEEJEEE2D2
2 4ME##@+# DDE22JJ2JDJJ2JJ2DJ DJEJD2DDEJEDDEDJD2
1 4ME#"*"% EDJJ2DDEJDJDDEJEDDED J2EDDJEEDEJEEJDDDD
E 4ME#$%!# 2DE2DEEDEEDDJD2DDEED E2EDDDJDE2JEEDEJDE
3 4ME#*$%% J2J2ED2EJJJDJJJ2E2 E22D2JEEDJ22E222J222E
4 4ME"@%$* EE2JJ2DDJJEJDJ2J2D DEJJEDJDJJDDJJ2JDD
R 4ME"$$!! EDEEDDJEED2DE22EEDE DE22DDDJD2JDE2DEEE2JD
J 4ME#"+%+ JJ2DJJDEJDJJDE2JDJ DDJJDJJDEJJ22E222D
O 4ME#!#! JJ2D22E2D222JJEJDDJJ J2DJJE2JDJEDJJDEJD
H 4ME"#!%! EDJ2DJJ22JJ222DJJ 2JE2JDJEJ2J22JJJ2J
G 4ME!%%+@ DJJJ2DDD2D2EDDEDEJJ 22D2JJEDJEDEEDJDJ2
` 4ME"@# DDDJD2DD2JEE2JJE2J2E ED2DJDDEEEJEE2J2JE
L 4ME#!*"" J22E22EEE2JJE2EJ22 2JEEJD2JEEEDJ2E2EDE
表
?
!
数据产出质量情况一览表
D6P79!
!
L./8=U/9
X90<.0
:
>686
X67.8
?
样品名称
Y65
T
790659
原始序列
C6BQ96>/
过滤序列
E7960Q96>/
过滤碱基
E7960P6/9/
测序错误率
4QQ=QQ689
%
_
F!"
%
_ F%"
%
_
JE
含量
JE<=08908
%
_
4XL*#@ !&++&" !!#%#* ",%J ","# +@,+$ +$,$% *$,#&
4XL&#@ $*%!&@$ $%@"$@& ",%!J ","# +@,@! +$,%* *$,$
4XL$# $&++&! $###*" ",%*J ","# +@,! +$,"# *&,#
4XL# $$*!%+ $$#""%@ ",%%J ","# +@,% +$,"! *&,@@
4XL@#$ $@"!+&$ $&"%*!# ",%%J ","# +,$+ +%,&+ *&,%+
4XL+!" &!$&!& %#@"$@ ",%J ","# +@,+" +$,&& **,+"
!!
注$原始序列
,
高通量测序原始数据&过滤序列
,
过滤后的序列数据&过滤碱基
,
过滤序列的个数乘以长度!并转化为以
J
为单位&测序错误率
,
平均碱基错误率&
F!"
(
F%",
分别计算
A;Q9>
数值大于
!"
(
%"
的碱基占总体碱基的百分比&
,JE
含量
,
计算碱基
J
和
E
的数量和占总的碱基数量的百分比
I=89
$
C6BQ96>/,[Q.
:
.067>686UQ=58;9;.
:
;)8;Q=X
:
;
T
X8/9
X90<.0
:
&
E7960Q96>/,Y9
X90<9>6866U89QQ6BQ96>/B9Q9U.789Q9>
&
E7960P6/9/,IX5P9Q=U/9
X909<9/8.59/
790
:
8;=U/9
X90<9/
!
8;90<=0S9Q89>8=X0.8/=UJ
!
8;68./8=8670X5P9Q=UP6/9/
&
4QQ=QQ689,2S9Q6
:
99QQ=QQ689=U/9
X90<.0
:
&
F!"60>F%",16/9/=U
T
;Q9>S67X9/
:
Q9689Q8;60!"
60>%"6Q9<676/6
T
9Q<9086
:
9=U8=867P6/9/
&
JE<=08908,A9Q<9086
:
9=UP6/9/=UJ60>E8=8=867P6/9/,
+&,&+_
和
+,!%_
"测序错误率
#
",#_
#比例接
近!且均达
+&,&+_
以上!说明
<3I2
文库构建和测序
质量较高!去除杂质后的过滤序列可用于后续分析
利用
D=
T
O68!
软件!将上述过滤序列对比到杜
仲基因组序列!结果"表
%
#表明!
$
个
<3I2
文库样
品得到的过滤序列中!分别有
+&,@%_
(
+$_
(
+&,"%_
(
+&,#_
(
+*,*&_
和
+&,!_
的过滤序列可
匹配到杜仲参考基因组说明测序结果具有较高准
确性!满足下一步数据分析要求
?,?
!
叶片发育不同时期基因表达差异分析
?,?,>
!
不同发育时期差异基因的筛选
!
在测序(组
装和注释基础上!将不同发育时期杜仲叶片进行基
因表达对比分析本试验以杜仲叶片发育相邻
!
个
时期为
#
个对照组合!共设计了
&
个对照组合!即
4XL&#@S/4XL*#@
(
4XL$#S/4XL&#@
(
4XL#S/
4XL$#
(
4XL@#$S/4XL#
和
4XL+!"S/4XL@#$
!来
探究叶片不同发育时期差异基因归一化数据利用
34Y9
分析从差异倍数和显著水平
!
个方面设定阈
值进行差异基因筛选!其中满足
&
7=
:
!
&
#
且校正值
1
(
","&
为差异表达基因根据
&
个组合筛选所得
的差异表达基因"
34J/
#列表绘制
b900
图!结果"图
#
#表明!杜仲叶片不同时期产生的
34J/
共计
%""!
个!占杜仲基因组总数的
##,!%_
!其中有
#$*
个基
因表达量上调!
#!%@
个基因表达量下调!且
&
个相邻
+&!
!
期
!!!!!!!!!!!!!!
荆
!
腾!等$杜仲叶片不同发育时期数字基因表达谱分析
表
C
!
测序序列与杜仲基因组比对情况一览表
D6P79!
!
D;9P76/8Q9/X78=U8;9Q96>/B.8;!,"(%$&)*+[7.S9Q
:
90=59
统计项目
H895 4XL*#@ 4XL&#@ 4XL$# 4XL# 4XL@#$ 4XL+!"
测序序列总数
D=867Q96>/
!!#%#* $%@"$@& $###*" $$#""%@ $&"%*!# %#@"$@
被定位序列总数
D=86756
TT
9>
$+!""$&
"
+&,@%_
#
$"+%!*"
"
+$_
#
$%#"%
"
+&,"%_
#
$!@$#!!
"
+&,#_
#
$#*#$!
"
+*,*&_
#
$+"+#
"
+&,!_
#
多次定位序列数
X^78.
T
7956
TT
9>
$#&"$
"
@,&%_
#
&&&@"%
"
@,!_
#
&@!@%!
"
@,$@_
#
&#+!
"
@,*_
#
&+##"
"
+,!_
#
#!#@@
"
+,*_
#
唯一定位序列数
M0.
X97
?
56
TT
9>
$%"*%&+
"
@,%#_
#
&&%*%@
"
@$,+_
#
&+*!!
"
@$,%&_
#
&"@+%"
"
@$,%$_
#
&&**&$!
"
@&,!&_
#
$!&@$"%
"
@&,&*_
#
定位到正链序列数
C96>/56
T
8=
)
c
*
%#*+@"
"
*%,$!_
#
!*&!*%
"
*%,"%_
#
!@@&@
"
*%,"%_
#
!@*+!"+
"
*%,#_
#
!$&@%+
"
*!,&%_
#
%##+$$
"
*!,$*_
#
定位到负链序列数
C96>/56
T
8=
)
(
*
%#&*&@"
"
*%,$+_
#
!+!#+&
"
*%,_
#
!+"$$+*
"
*%,%#_
#
!@&+!!
"
*%,!$_
#
!@!*
"
*!,%_
#
%#%@@%
"
*!,+_
#
完整比对序列数
I=0)/
T
7.<9Q96>/
&%%*#@
"
%,@_
#
*$$!*"%
"
%,"+_
#
*+"*""
"
%,"+_
#
*@**+"%
"
%,%_
#
*$@**%@
"
!,"!_
#
&!@&*$@
"
!,!*_
#
分段比对序列数
Y
T
7.<9Q96>/
+$+$*!
"
#%,*%_
#
@&"%&
"
#%,#_
#
@@+&!
"
#%,!$_
#
@$*"!
"
#%,"_
#
@$"#!&
"
#%,!%_
#
+%#%&
"
#%,%_
#
!!
注$测序序列总数
,
测序序列经过测序数据过滤后的数量统计"过滤序列#&被定位序列总数
,
能定位到基因组上的测序序列的数量&多次定位序列数
,
在参考序
列上有多个比对位置的测序序列的数量&定位到正链序列数(定位到负链序列数
,
测序序列比对到基因组上正链或负链的数量&完整比对序列数
,
为整段比对到外
显子的测序序列数量&分段比对序列数
,
被定位序列中分段比对到
!
个外显子上的测序序列数量
I=89
$
D=867Q96>/,IX5P9Q=UU.789Q9>/9
X90<.0
:
/9
X90<9/
"
<7960>686
#&
D=86756
TT
9>,IX5P9Q=U56
TT
9>/9
X90<.0
:
/9
X90<9/
&
X^78.
T
7956
TT
9>,IX5P9Q=U
/9
X90<9/5X78.
T
7956
TT
9>=0Q9U9Q90<9/9
X90<9/
&
M0.
X97
?
56
TT
9>,IX5P9Q=U/9
X90<9/X0.
X97
?
56
TT
9>=0Q9U9Q90<9/9
X90<9
&
C96>/56
T
8=
)
c
*!
C96>/56
T
8=
)
(
*
,IX5P9Q=U/9
X90<9/56
TT
9>=0
T
=/.8.S960>5.0X//8Q60>/=U8;9
:
90=59
&
I=0)/
T
7.<9Q96>/,IX5P9Q=U/9
X90<9/56
TT
9>.0B;=79=0609Z=0/
&
Y
T
7.<9Q96>/,
IX5P9Q=U/9
X90<9/56
TT
9>/9
:
59089>7
?
=08B=9Z=0/.056
TT
9>/9
X90<9/,
图
#
!
差异基因
b900
图
R.
:
,#
!
D;9b900.56
:
9=U>.UU9Q908.67
:
909/
时期组合中没有共同的差异基因在
4XL&#@S/
4XL*#@
的
#+@+
个
34J/
中!有上调基因
@"
个!
下调基因
#!"+
个&在
4XL$#S/4XL&#@
的
*#&
个
34J/
中!有上调基因
!#
个!下调基因
#**
个&在
4XL#S/4XL$#
的
@
个
34J/
中!有上调基因
*$
个!下调基因
%!
个&在
4XL@#$S/4XL#
的
!&@
个
34J/
中!有上调基因
#%%
个!下调基因
#!&
个&
在
4XL+!"S/4XL@#$
的
@!"
个
34J/
中!有上调
基因
&%*
个!下调基因
!@$
个随着杜仲叶片的发
育!各个比较组合的差异基因数量各不相同!
4XL&#@S/4XL*#@
组合差异基因数最多!占总
34J/
的
$$,!$_
!而
4XL#S/4XL$#
组合差异
基因数最少!仅占总
34J/
的
!,$_

?@?@?
!
不同发育时期差异基因的
.6
富集分析
!
对差异基因进行
J909[08=7=
:?
"
J[
#功能注释!可
以确定差异基因及基因产物所在的细胞位置(分子
功能以及参与的生物过程本试验通过研究不同发
育时期杜仲叶片差异基因的功能及差异显著基因的
J[
富集发现!
&
个相邻的比较组合分别获得
#%+*
(
&@&
(
!#!
(
*#%
和
+&*
个
J[
注释其中!属于生物
过程分别为
!&
(
%"%
(
##"
(
!"#
和
*+
个&属于细胞
组分分别为
#*$
(
&*
(
#+
(
%&
和
#"+
个&属于分子功能
分别为
&!%
(
!!@
(
@%
(
#
和
%*@
个
另外!筛选在差异表达基因中显著富集的
J[
分类"
1
#
",""&
#!结果"表
*
#可以看出!不同组合显
著富集的基因数量相差很大!所行使的功能也不尽
相同其中
4XL&#@S/4XL*#@
比较组合显著富集
的基因数最多!其中基因行使的主要分子功能是代
谢活动和氧化还原活动!较多参与了生物过程和代
谢过程&而
4XL#S/4XL$#
比较组合没有被显
著富集的基因
?@?@C
!
不同发育时期差异表达基因的
F&-H=&
(
富
集分析
!
A68;B6
?
富集分析主要是确定差异表达基
因参与的主要生化代谢途径和信号转导途径!为了
研究杜仲叶片不同阶段发育时期中
A68;B6
?
富集
"$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
I
!
差异基因的
.6
功能显著性富集结果
D6P79*
!
D;9/868./8.<67Q9/X78/=UJ[/.
:
0.U.<60890Q.<;5908=U>.UU9Q908.67
:
909/
样品名称
Y65
T
790659
J[
分类
J[89Q5
功能
RX0<8.=0
M0.
:
909
数量
I=,=U
X0.
:
909
上调数量
M
T
)Q9
:
X7689>
X.0
:
909
下调数量
3=B0)Q9
:
X7689>
X0.
:
909
4XL&#@S/4XL*#@
生物过程
1.=7=
:
.<67
T
Q=<9//
生物过程
1.=7=
:
.<67
/
T
Q=<9// @+* %!@ &$$
微管过程
.^
T
Q=<9// !$ ! !*
代谢过程
9^86P=7.<
T
Q=<9// $+@ !&* ***
脂质代谢过程
L.
T
.>5986P=7.<
T
Q=<9// $! &&
细胞组分
E97X76Q<=5
T
=0908
微管细胞骨架
.^?
8=/d9798=0 !* ! !!
微管相关复合物
.^<=5
T
79Z #@ ! #$
分子功能
=^79催化过程
E6867
?
8.<6<8.S.8
?
%& !*+ *@$
转化活动(酰基转移组
DQ60/U9Q6/96<8.S.8
?
!
8Q60/U9QQ.0
:
6<
?
7
:
Q=X
T
/ &# !" %#
氧化还原酶活动
[Z.>=Q9>X<86/96<8.S.8
?
#&@ $% +&
4XL$#S/4XL&#@
生物过程
1.=7=
:
.<67
T
Q=<9//
除氨酰转化外的转运活动和酰基转移组
DQ60/U9Q6/96<8.S.8
?
!
8Q60/)
U9QQ.0
:
6<
?
7
:
Q=X
T
/=8;9Q8;6065.0=6<
?
7
:
Q=X
T
/
*# #@ !%
4XL$#S/4XL&#@
生物过程
1.=7=
:
.<67
T
Q=<9//
光合作用
A;=8=/
?
08;9/./ #% " #%
寡肽转移
[7.
:
=
T
9
T
8.>98Q60/
T
=Q8 * % #
肽转移
A9
T
8.>98Q60/
T
=Q8 * % #
酰胺转移
25.>98Q60/
T
=Q8 * % #
光合作用!光反应
A;=8=/
?
08;9/./
!
7.
:
;8Q96<8.=0 & " &
细胞组分
E97X76Q<=5
T
=0908
类囊体
D;
?
76d=.> #! " #!
类囊体部分
D;
?
76d=.>
T
6Q8 #! " #!
光合体系
A;=8=/
?
/895 ## " ##
光合膜
A;=8=/
?
08;98.<595PQ609 ## " ##
光合体系
#
A;=8=/
?
/895
#
& " &
光合体系
$
A;=8=/
?
/895
$
& " &
膜
9^5PQ609 &+ %* !&
分子功能
=^79蛋白质二聚活动
AQ=89.0>.59Q.W68.=06<8.S.8
?
#% #" %
4XL@#$S/4XL#
分子功能
=^79转移活动
DQ60/
T
=Q89Q6<8.S.8
?
!$ !" $
4XL+!"S/4XL@#$
生物过程
1.=7=
:
.<67
T
Q=<9//
氧化还原活动
[Z.>68.=0)Q9>X<8.=0
T
Q=<9// @ $" !
光合作用
A;=8=/
?
08;9/./ # " #
生物过程
1.=7=
:
.<67
/
T
Q=<9// *"# !@$ ##&
光合作用!光反应
A;=8=/
?
08;9/./
!
7.
:
;8;6QS9/8.0
:
@ " @
个体代谢活动
Y.0
:
79)=Q
:
60./55986P=7.<
T
Q=<9// ##@ @# %
光合体系!光反应
A;=8=/
?
08;9/./
!
7.
:
;8Q96<8.=0 + " +
代谢过程
9^86P=7.<
T
Q=<9// %#$ !!! +*
初级代谢物和能量的产生
J909Q68.=0=U
T
Q9909Q
:?
#& * ##
细胞组分
E97X76Q<=5
T
=0908
膜
9^5PQ609 #"$ $* *!
光合体系
$
A;=8=/
?
/895
$
$ " $
光合体系
A;=8=/
?
/895 @ " @
光合膜
A;=8=/
?
08;98.<595PQ609 @ " @
类囊体
D;
?
76d=.> @ " @
类囊体部分
D;
?
76d=.>
T
6Q8 @ " @
分子功能
=^79氧化还原活动
[Z.>=Q9>X<86/96<8.S.8
?
+$ $+ !
铁离子结合
HQ=0.=0P.0>.0
:
%! !&
血红素结合
O959P.0>.0
:
%" !& &
四吡咯绑定
D98Q6
T?
QQ=79P.0>.0
:
%" !& &
作用于合并或降低氧分子成对供体的氧化还原活动
[Z.>=Q9>X<)
86/96<8.S.8
?
!
6<8.0
:
=0
T
6.Q9>>=0=Q/
!
B.8;.0<=Q
T
=Q68.=0=QQ9>X<8.=0
=U5=79?:
90
%! !$ $
催化活动
E6867
?
8.<6<8.S.8
?
%#$ !%# @&
钙离子结合
E67<.X5.=0P.0>.0
:
#+ #!
#$!
!
期
!!!!!!!!!!!!!!
荆
!
腾!等$杜仲叶片不同发育时期数字基因表达谱分析
基因的变化规律!对相邻
!
个时期差异表达基因进
行
A68;B6
?
富集的进一步分析发现"图
!
#!在
4XL&#@S/4XL*#@
比较组合里共鉴定出
#"&
条代
谢路径!注释到
+%*
个基因通路主要集中在代谢
通路(次生代谢物合成(丙酮酸代谢(植物激素信号
转导(类胡萝卜素合成(黄酮类合成等!其中最显著
富集的通路为次生代谢物合成!所涉及基因占总注
释基因的
#!,*_
&在
4XL$#S/4XL&#@
比较组合里
共鉴定出
&#
条代谢路径!注释到
#+
个基因通路
主要集中在苯丙素类生物合成(光合作用(次生代谢
物的合成(
21E
转运蛋白等!其中最显著富集的通
路为苯丙素类生物合成!所涉及基因占总注释基因
的
&,"_
&在
4XL#S/4XL$#
比较组合里共鉴定
出
#+
条代谢路径!共注释到
%
个基因通路主要
集中在内质网中的蛋白质过程(苯丙氨酸及酪氨酸
和色氨酸的合成(精氨酸和脯氨酸的代谢(苯丙素类
生物合成等!其中最显著富集的通路为内质网中的
蛋白质过程!所涉及基因占总注释基因的
#",@_
&
在
4XL@#$S/4XL#
比较组合里共鉴定出
!+
条
代谢路径!共注释到
$+
个基因通路主要集中在次
生代谢物的合成(苯丙素类生物合成(淀粉和蔗糖代
谢(亚麻酸代谢(植物激素信号转导等!其中最显著
富集的通路为苯丙素类生物合成!所涉及基因占总
注释基因的
@,_
&在
4XL+!"S/4XL@#$
比较组合
里共鉴定出
@*
条代谢路径!共注释到
%+
个基因
通路主要集中在光合作用相关蛋白(苯丙素类生物
合成(次生代谢物的合成(柠檬酸循环等!其中最显
著富集的通路为光合作用相关蛋白!所涉及基因占
2,4X&#@S/4X*#@
比较组合&
1,4X$#S/4X&#@
比较组合&
E,4X#S/4X$#
比较组合&
3,4X@#$S/4X#
比较组合&
4,4X+!"S/4X@#$
比较组合
图
!
!
差异基因
A68;B6
?
显著性富集结果
2Q9
T
Q9/908/8;94X&#@S/4X*#@
&
1Q9
T
Q9/908/8;94X$#S/4X&#@
&
EQ9
T
Q9/908/8;94X#S/4X$#
&
3Q9
T
Q9/908/8;94X@#$S/4X#
&
4Q9
T
Q9/908/8;94X+!"S/4X@#$
R.
:
,!
!
D;9/868./8.<67Q9/X78/=UA68;B6
?
/.
:
0.U.<60890Q.<;5908=U>.UU9Q908.67
:
909/
!$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
"表示差异显著"
1
(
","&
#&
""
表示差异极显著"
1
(
","#
#
图
%
!
杜仲绿原酸合成相关显著差异基因不同时期表达模式"
RA` ^
#
"
Q9
T
Q9/908//.
:
0.U.<608>.UU9Q90<9
"
1
(
","&
#&
""
Q9
T
Q9/908/5=Q9/.
:
0.U.<608>.UU9Q90<9
"
1
(
","#
#
R.
:
,%
!
D;99Z
T
Q9//.=0
T
6889Q0/=U/.
:
0.U.<608>.UU9Q908.67
:
909/Q97689>8=!,"(%$&)*+
<;7=Q=
:
90.<6<.>/
?
08;9/./.0>.UU9Q908
T
9Q.=>/
"
RA` ^
#
图
*
!
3J4
测序结果和
CD)AEC
表达量比对
R.
:
,*
!
b67.>68.=0=U3J4/9
X90<.0
:
>686P
?
CD)AEC
总注释基因的
!,"_
综上
&
组差异基因通路的富
集可以看出!杜仲叶片在不同发育时期!进行着各种
生物合成和代谢活动!多与各种次生代谢物质的合
成代谢相关!说明杜仲叶片在发育的同时合成积累
大量的活性物质
?,?,I
!
杜仲绿原酸合成途径关键酶基因发掘
!
对
不同发育时期杜仲叶片
3J4
数据进行
A68;B6
?
富
集性分析发现!共有
$
个基因与绿原酸生物合成相
关!其中包括苯丙氨酸解氨酶"
T
;90
?
76760.0965)
5=0.67
?
6/9
!
A2L
#基因
%
个&肉桂酸
)*)
羟化酶"
<.0)
065689*);
?
>Q=Z.76/9
!
E*O
#基因
#
个&香豆酰
)E=2
连接酶"
*);
?
>Q=Z
?
<.0065=
?
7)E=27.
:
6/9
!
*02
#基因
#
个&香豆酸
)%)
羟基化酶"
<=X56Q=
?
7
X.0689%a)5=)
0==Z
?:
906/9
!
0%3
#基因
#
个不同时期基因的表
达量显示!
$
个与杜仲绿原酸合成相关的基因在不
同时期的叶片发育中均有表达!其中
*
月和
+
月中
旬这
!
个时期基因表达量相对较高"图
%
#
?@C
!
荧光定量
ADEFGA
分析
利用相对定量法!从
4X&#@S/4X*#@
组合
"
4X*#@
为对照#中将上述
$
个与杜仲绿原酸合成相
关的基因"
!"1-2#
(
!"1-2!
(
!"1-2%
(
!"0*3
(
!"*02
(
!"0%3
#以及随机选择的
$
个显著下调的
基因"
2)R
#!和从
4X+!"S/4X@#$
组合"
4X@#$
为对
照#中随机选择的
$
个显著上调的基因"
J)L
#!表达
量改变倍数的对数值进行比较"图
*
#!结果显示$这
#@
个基因
CD)AEC
表达量改变倍数和
3J4
结果虽
然不完全成比例!但上下调趋势完全相同!大体趋势
基本一致说明这次数字表达谱测序结果具有较高
的可信度
%
!
讨
!
论
数字基因表达谱技术能快速检测植物在不同组
织细胞(不同发育阶段以及在众多逆境环境胁迫下
基因的表达差异!因此!数字基因表达谱技术在功能
基因组学方面正在发挥着越来越重要的作用+##,
本实验采用数字基因表达谱技术对杜仲叶片不同生
长发育时期的差异基因进行了比较研究!并将差异
表达基因进行了
J[
和
A68;B6
?
途径分类!为进一
步研究杜仲药用的分子机理提供了必要的数据平
台!为研究基因表达变化和多种活性成分之间的关
系奠定了研究基础
通过杜仲叶片不同发育时期基因表达对比分析
发现!不同时期!杜仲叶片的差异基因的数量相差悬
殊!行使的功能也不尽相同!说明杜仲叶片在生长发
育过程中存在着丰富多样的生化进程在
4XL&#@
S/4XL*#@
中!共检测到
34J/#+@+
个!为
&
个对
比组合中数量最多的!而据研究发现杜仲叶片从展
叶到基本停止生长仅需要
#
个月左右!叶片大小在
%$!
!
期
!!!!!!!!!!!!!!
荆
!
腾!等$杜仲叶片不同发育时期数字基因表达谱分析
&月中旬就基本保持恒定不变+#!)#%,!说明从
*
月中
旬到
&
月中旬这一时期杜仲叶片外部形态和内部基
因表达都发生了明显的变化通过差异基因
J[
富
集分析发现!这一时期的叶片中含有大量与微管合
成(膜合成(细胞骨架等细胞组分相关的基因!而这
些基因的表达正是参与细胞有丝分裂(细胞伸长(快
速生长的必要原料!因此!推测杜仲叶片在生长发育
过程中!主要通过调控细胞组分相关基因表达来影
响叶片的生长在
4XL&#@S/4XL*#@
比较组合里
共鉴定出
#"&
条代谢路径!其中最显著富集的通路
为次生代谢物的合成!并且其中大多数次生代谢物
途径相关酶基因出现下调表达&而
4XL$#S/
4XL&#@
(
4XL#S/4XL$#
和
4XL@#$S/4XL#
三个比较组合
34J/
相对较少!经
A68;B6
?
富集到
的次生代谢物途径中相关的
34J/
的数也很少&
4XL+!"S/4XL@#$
比较组合的
34J/
数量突然增
多!且被
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富集到的次生代谢物途径中相关
的
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大多数为上调经大量杜仲叶中次生代谢
物的成分测定发现!从
&
月到
@
月期间杜仲叶片内
的次生代谢物变化处于相对平稳阶段!
+
月开始部
分次生代谢物含量又开始上调+#*)#,!推测杜仲叶片
内次生代谢物的增长速率与其合成途径相关基因的
表达呈正相关性我们可以根据这些基因的变化从
中筛选出感兴趣的基因作为后续研究的基础
苯丙素类化合物是杜仲中主要的药用活性成
分!其中绿原酸作为苯丙素类重要的化合物之一!已
得到了高度的重视+$!#@,迄今为止!杜仲中发现的
苯丙素类化合物共
##
种!其中研究最多的是绿原
酸!甚至有研究者认为绿原酸的含量直接决定着杜
仲的利用价值+#+,目前!对杜仲绿原酸的研究主要
集中在药理活性检测和成分提取方面!从基因表达
水平对其进行研究鲜有报道!因此!本研究试图利用
数字基因表达谱技术分析杜仲叶片中绿原酸代谢通
路!确定相关酶基因本研究中共发掘出
$
个与绿
原酸合成相关的酶基因其中!苯丙氨酸解氨酶
"
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#!已被大量实验证明是绿原酸合成所必须的
关键酶+!")!#,&肉桂酸
)*)
羟化酶"
E*O
#和香豆酰
)E=2
连接酶"
*EL
#是绿原酸奎宁酸和咖啡酰辅酶
2
缩
合途径+!!,与绿原酸香豆酰奎宁酸羟基化途径+!%,共
同上游关键酶&而香豆酸
)%)
羟基化酶"
E%O
#在绿原
酸香豆酰奎宁酸羟基化合成途径中!可直接催化
T
)
香豆酰奎宁酸生成绿原酸的关键酶基因+!%,对这
$
个基因的表达情况分析发现!不同基因在杜仲叶片
发育时期均有表达!但表达差异相对较大!具有明显
的偏好性!并以
*
月和
+
月基因的表达量较高一
般而言!基因表达量相对较高!且表达规律与绿原酸
合成一致的基因可能就是关键的绿原酸合成调控基
因前人研究认为!杜仲叶片生长发育过程中绿原
酸含量变化规律为
*
月中旬到
&
月中旬是杜仲叶片
中绿原酸含量增长速度最快的阶段!随后一直到
+
月中下旬期间!绿原酸的含量变化相对较平缓!值得
注意的是!从
+
月中下旬开始!绿原酸的含量增长速
度突然上升+!*,
!"1-2#
和
!"1-2!
在
*
月中旬
和
+
月中下旬的表达量显著增高!这
!
个基因的表
达变化模式刚好与绿原酸含量变化规律相吻合!呈
现出正相关的趋势!而
!"1-2%
只在
+
月中下旬有
表达较高!说明同一家族基因成员在功能上应存在
冗余&
!"0*3
和
!"*02
与
!"1-2+
的基因表达模
式相近!说明对杜仲叶片中绿原酸的合成应起到主
要的作用&较比其他基因!
!"0%3
基因的表达量相
对较低!因此!推测
!"0%3
基因通过香豆酰奎宁酸
羟基化合成途径合成绿原酸应不是合成绿原酸的主
要途径!这一结果与何柳相一致+!&,
植物数量性状的变化是由多个基因或者基因家
族共同控制作用的结果!是一个相当复杂又协调有
序的过程单个基因表达情况的改变不足以反映特
定功能或通路的整体变化情况!但是!个别功能重要
的基因"主效基因#具有0
OXP
1节点的重要特性!它
的功能改变可能对于整个网络来说是至关重要的
本研究首次利用
3J4
技术在转录水平上解析杜仲
叶片生长发育过程中差异基因的表达模式以及功能
分类!并分析了与杜仲叶片中重要药用活性成分绿
原酸合成相关的酶基因!以期对杜仲绿原酸主效基
因的筛选奠定理论基础!为挖掘杜仲中控制其它性
状的关键基因提供参考!并为深入研究杜仲次生代
谢产物的生物合成与代谢调控提供了理论基础
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