全 文 ：书西北植物学报!
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基金项目$林业公益性行业科研专项" !"#&"&!#+ #&国家自然科学基金" %##+")$+
#&西北农林科技大学博士科研启动基金"
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作者简介$张好强" #2!( #!男!讲师!主要从事微生物学与森林保护学研究 3*45.6$
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通信作者$唐 ! 明!教授!博士生导师!主要从事微生物学与森林保护学研究 3*45.6$
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油松根际外生菌根真菌龟裂秃马勃的
分离鉴定及培养
张好强!余红霞!唐
!
明"
"西北农林科技大学 林学院 陕西杨陵
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#
摘
!
要$该研究采用组织分离法对黄土高原子午岭林区连家砭林场油松根际外生菌根真菌进行了分离!并采用 CDE 序列对分离的真菌进行鉴定!研究了菌根真菌的培养条件!为菌剂的生产奠定基础结果表明$子午岭林区油松根
际分离培养出的真菌为龟裂秃马勃"
!"#$%&"()* + ,)-*. #!能够与油松形成外生菌根采用 FFG 培养基为基础 培养基!纯培养条件下!龟裂秃马勃生长的最适 H I 为$,"
!最适温度为
!)J
以蔗糖为唯一碳源的培养基中龟裂
秃马勃生长速度最快!其次是麦芽糖和葡萄糖!生长最慢的为乳糖!在以几丁质和碳酸氢钠为碳源的培养基上不生
长有机氮源中!对脯氨酸为唯一氮源的利用能力最好!其次是酪蛋白!尿素最差&无机氮源中!以磷酸氢二铵为唯
一氮源时生长最好!其次是硝酸钙!最差为酒石酸铵该研究首次报道了黄土高原子午岭林区外生菌根真菌龟裂
秃马勃!并初步确定了其最佳培养条件
关键词$龟裂秃马勃&外生菌根真菌&黄土高原子午岭林区&最佳培养条件 中图分类号$
K%*%%#
文献标志码$L$%"&(#")
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外生菌根"
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3QF
#是林木最重
要的菌根类型(#)!广泛分布于全球范围内多种林木
树种(!)基于分类学和生态学的调查!
[
"
%[
的
陆生植物能够与
3QF
真菌形成外生菌根(%*&)!其中
包括许多重要的生态和经济林木!如松科*壳斗科*
桦木科*南青冈科*龙脑香科和苏木科的林木())
3QF
可以增加宿主植物根系的吸收面积!提高植物
对土壤营养的吸收和利用!促进植物生长!改善植物
在逆境条件下的适应性以及增强宿主植物的抗逆
性!提高逆境条件下宿主植物的成活率(#!))
3QF
真菌的分离和纯化是室内和野外研究
3QF
真菌的前提和基础不同
3QF
真菌生长的
最适
H
I
*温度*碳源和氮源不尽相同($*)由于 3QF 真菌与林木之间复杂的共生关系!其共生机理 涉及到的代谢产物等很多方面都不明确!许多 3QF 真菌的分离培养比较困难因此!探索 3QF 真菌 的生物学特性*配制合适的培养基等就成为 3QF 真菌分离培养成功与否的关键(#) 油松" 0*#.("12"& + ,)-*. #为中国暖温带森林 主要建群种!在黄土高原子午岭林区目前存在唯一 保存较为完整的天然次生林!同时存在有超过 )%"""84 ! 的人工纯林(#")油松对 3QF 有很强 的依赖性并能够与多种真菌形成共生关系(#!##*#!)! 然而目前针对子午岭林区油松根际 3QF 真菌的研 究相对匮乏本研究首次在子午岭林区油松林采集 真菌子实体进行分离*鉴定!并将所得真菌回接油松 检测能否成功定殖于油松根系!形成外生菌根在 此基础上!纯培养条件下研究 3QF 真菌生长的环 境因子"温度和 H I #!以及营养因子"碳源和氮源#! 确定适宜 3QF 真菌生长的最佳条件!为 3QF 真菌 菌丝体的扩繁和菌剂生产奠定基础 # ! 材料和方法 >,> ! 野外真菌的采集与培养 >,>,> ! 采样地概述 ! 研究区位于甘肃省合水县连 家砭林场" #"2\#"] " #"\#2]3 ! %)\"%] " %$\%+]G
#!
坐落在黄土高原子午岭林区北部该地区为黄土高
原丘陵沟壑区!属中温带半干旱大陆性季风气候
海拔
#!##
"
#&)%4
!年均气温
+,&J
!年均降雨量
)2+,$44 近来年!人工林面积持续增加!其中油 松人工林的覆盖面积约为 )%"""84 ! !占人工林总 面积的 2#[ 最常见的伴生树种为辽东栎" 4&)5 6.2*",(# 7 &#.*. #*山杨" 0, 8 2.$"/*$*"#" #和虎 榛子" 9.() : , 8 .*.$"/*$*"#" # ( #% ) >,>,? ! 样品采集及真菌分离 ! !"#" 年 2 月中下 旬!在研究区利用路线调查和随机踏查相结合的方 法!在油松林下裸露油松根系!寻找大型真菌子实 体!进行摄影*记录特征!并小心沿着子实体上的菌 索挖至根系!以初步确定是否为 3QF 真菌!然后小 心采集子实体!做好标记!用吸水纸包好装入冰盒带 回实验室! &28 内进行分离用以提取 G^L 的子 实体置于 (!"J 冰箱备用 真菌分离采用组织分离法!将子实体表面消毒 后!无菌操作取新鲜菌肉 &44 % 置于培养基上!分 离培养基为 X^ L 和 FFG ( # ) !每 #"""4W 培养基 中加入 %4W 乳酸和 ","$
9
链霉素分离后将培养
皿放入
!)J
恒温箱中暗培养
>,>,@
!
真菌鉴定
!
取纯培养菌丝体*新鲜子实体和
成熟风干子实体孢子粉进行
CDE
序列分析真菌基
因组
G^L
采用
QDL_
法提取(#&)真菌
CDE
序列使
用
CDE#*R
"
)]*QDDMMDQLDDDLMLMMLLMDLL*
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#和
CDE&
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#进
行
XQZ
扩增(#))
XQZ
采用
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体系!其中包括
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引物
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XQZ
条件为$&J 预变性 %4.0 & %) 个循 环! )J 变性 &)/ ! ))J 退火 ))/ ! +!J 延伸 &)/ & 最终 +!J 延伸 #"4.0 取 XQZ 产物 ) # W !在 #[ 琼脂糖凝胶电泳" #""b ! %"4.0 #检测 XQZ 产物 送至上海生工生物工程公司进行双向测序 将获得的 CDE 序列提交到 M?0_50c 数据库后! 在线运用 _WLED 工具进行同源比对!并从 GQ_C 下载 M?0_50c 数据库内已知同源序列使用序列 构建软件 Q6=/B56d#,2# 和 F3ML " b?S/.:0),") # 进行对比分析!用 G?. 9 8Y:S*e:.0.0 9 法构建系统发 育树! f.4=S5*B<:* H 5S54?B?S 模型计算遗传距离! #""" 次随机抽样!计算 _::B/BS5 H 值以评估系统发 育树的置信度(#$)
>,?
!
培养真菌回接油松
>,?,>
!
接种真菌培养
!
将分离和纯化的菌株接种
到
FFG
培养基上!
)J
培养箱内暗培养
#&@
后!
接种时用内径
#A4
的打孔器沿菌落边缘打菌饼
"!&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 >,?,? ! 育苗 ! 油松种子"陕西省林业厅林业技术推 广总站提供#用 #"[ I ! a ! 消毒 !"4.0 !无菌水冲 洗数次后 &)J 浸泡$
"
+8
消毒种子转移到铺有
灭菌纱布的托盘中!
)J
培养箱中催芽!每天早晚
用水冲洗
#
次!待种子发芽后播入孔穴盘"灭菌蛭
石#育苗
&
周后挑选长势一致的油松苗移栽
>,?,@
!
接种
!
油松栽培基质为河沙*土和蛭石
"
!g!g#
!
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%
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#混合物!高温高压蒸汽灭菌"
#!#
J
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H
5
#
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!放置
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后使用将油松苗移栽
至一次性纸杯"含
#!"
9
栽培基质#每杯
#
株!同时
取
3QF
真菌的菌饼
&
个放置在幼苗根系周围
>,?,A
!
培养
!
将接种
3QF
真菌的幼苗放入人工
气候箱"
ZKI*!)"
!上海精宏#中培养!培养箱参数
设置如下$#&8 光照% @ ! !)J &无光照 #"8 % @ ! !" J &空气湿度$"[

>,?,B
!
检测
!
培养
2
周后!取油松根用流水洗掉表
面土后!在体视显微镜下观察根的形态*颜色!并拍
照将根剪成长约
#A4
根段!染色后显微镜下观察
根内及根外菌丝形态())
>C@
!
不同培养条件对
0-D
真菌生长的影响
>C@C>
!
生长速度测定
!
在
FFG
固体培养基上活
化
3QF
真菌!用内径为
",)A4
的灭菌打孔器在菌
落边缘打取菌饼!接种到另一
FFG
培养基"直径
,"A4
!
"4W
%皿#中央!
!)J
恒温暗培养!每
!@
用游标卡尺通过十字交叉法测量菌落直径!连续记
录
!2@

>C@C?
!
9
E
对生长的影响
!
在
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的三角瓶中
加入
#""4WFFG
液体培养基!用
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%
WIQ6
或
#4:6
%
WG5aI
分别调整
H
I
为
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*
&
*
)
*
$* + 和 2 !然后在 #!# J * ",#FX5 条件下灭菌 !"4.0 FFG 液体培养基冷却后接种 # 个 ",)44 直径菌 饼! )J 恒温震荡" #!"S % 4.0 #培养 #&@ 菌丝用 连接有布氏漏斗的真空泵抽滤获得后 2"J 烘箱中 烘至恒重!取出置于密闭干燥器中冷却至室温时称 菌丝干物重每个处理设 & 个重复!试验重复 % 次 >,@,@ ! 温度对生长的影响 ! 将 # 个 ",)44 直径 菌饼置于 FFG 培养基"直径 ,"A4 ! "4W %皿#中 央!分别置于 #)J * !"J * !)J * %"J 和 %)J 下恒 温暗培养!接种 #"@ 后测量菌落直径"方法同上# 每个处理设 & 个重复!试验重复 % 次 >,@,A ! 碳源对生长的影响 ! 分别用 #" 9 % W 的葡萄 糖*乳糖*甘露醇*可溶性淀粉*果糖*麦芽糖*蔗糖* 几丁质"制备成胶体几丁质备用!方法参考 Q8?0 等(#+)#*海藻糖和碳酸氢钠替代 FFG 培养基中的 碳源物质"葡萄糖 ` 麦芽汁#接种 # 个 ",)44 直 径菌饼后 !)J 恒温暗培养!接种 #"@ 后测量菌落 直径"方法同上#每个处理设 & 个重复!试验重复 % 次 >,@,B ! 氮源对生长的影响 ! 分别用 ",) 9 % W 的酒 石酸铵*磷酸氢二胺*硝酸纳*硝酸钙*硝酸铵*硫酸 铵*甘氨酸*脯氨酸*精氨酸*天冬氨酸*谷氨酸*丙氨 酸*尿素和酪蛋白替代 FFG 培养基中的氮源物质 "" GI & # ! IXa & ` 麦芽汁#接种 # 个 ",)44 直径 菌饼后 !)J 恒温下暗培养!接种 #"@ 后测量菌落 直径"方法同上#每个处理设 & 个重复!试验重复 % 次 >,A ! 数据处理与分析 试验数据采用 3PA?6!"#" 整理!使用 ELE " b?S/.:02,# #软件进行方差分析" LGabL #!使用 =^0A50 新复极差法进行多重比较 ! ! 结果与分析 ?,> ! 菌种分离与鉴定 野外采集的子实体呈陀螺形!褐色!宽 2 " #" A4 !高 #" " #!A4 "图 # #从野外采集的子实体上 成功分离的菌株在 X^ L 及 FFG 培养基上生长良 好!呈白色棉絮状"图 ! #!其生长较为缓慢!且在培 图 # ! 成熟子实体照片 R. 9 ,# ! X.AB=S?/:>45B=S?>S=.B.0 9 Y:@ T 图 ! ! 分离菌株在 FFG " L #和 X^ L " _ #培养基上 生长 # 周的菌落形态 R. 9 ,! ! a0?*??c:6@A:6:0<brT :>./:65B?@>=0 9 =/ :0FFG " L # 50@X^ L " _ # 4?@.=4 #!& ! 期 !!!!!!!!!!! 张好强!等$油松根际外生菌根真菌龟裂秃马勃的分离鉴定及培养
养过程中不产孢
对分离得到真菌的纯培养菌丝体!以及新鲜子
实体和成熟风干子实体孢子粉!使用
CDE#*R
和
CDE&
引物扩增后"约
))"Y
H
#进行双向测序结果
表明野外采集的风干成熟子实体*新鲜子实体以及
分离的菌株为同一真菌"菌株编号为
I#
#
GQ_C
的
_WLED
比对结果表明!
I#
"
eG&##)&
#与
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株
M?0_50c
编号为
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和
Le$#+&" 的 !"#$%&"()*
+
,)-*.
真菌序列相似度达
[
&
构建系统发育树的分析结果表明"图
%
#!
I#
与这
%
株
!3()*
+
,)-*.
真菌的自展支持率为
2[
!因此
可以将
I#
鉴定为
!3()*
+
,)-*.
"龟裂秃马勃#
?,?
!
菌株回接油松
龟裂秃马勃接种油松苗
!
个月后!能够与油松
苗根系形成
3QF
!主要形态为单轴状和二叉分枝状
"图
&
#染色后显微镜观察结果表明!龟裂秃马勃
与油松的
3QF
形成了菌套结构!出现在细根根端
或者整个包围细根!并在菌套四周有根外菌丝!根系
内形成许多根内菌丝可见!龟裂秃马勃能良好定
殖于油松根系!形成外生菌根"图
&
#
?,@
!
培养条件对龟裂秃马勃生长的影响
?,@,>
!
龟裂秃马勃的生长曲线
!
通过每天测量龟
裂秃马勃菌落直径发现!其生长缓慢!需要
&
周才能
长满整个平板"直径
A4
#龟裂秃马勃在第
!
周
图
%
!
基于
S^ GLCDE
序列构建的系统发育树
R.
9
,%
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根段染色观察$5, 形成的菌根结构& Y, 根外菌丝& A, 形成的菌套& @, 根内菌丝 图 & ! 龟裂秃马勃与油松形成的外生菌根 L ! _,^.>>?S?0B?AB:4 T A:SS8.7564:S H 8:6: 9 .?/ & Q(R,D8?S?/=6B/:>S::B/B5.0.0 9$
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西
!
北
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物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 和第 % 周时生长较快!而在第 # 周和第 & 周生长较 为缓慢!生长曲线如图 ) ! L ?C@C? ! 9 E 对龟裂秃马勃生长的影响 ! 在 H I%," " 2," 的范围内!龟裂秃马勃均能生长!其生物量随 着 H I 升高先增加后降低!在 H I$,"
时达到最大生
物量!为"
,%2h","2
#
9
"图
)
!
_
#
H
I),"
和
$,"
时的生物量均高于
H
I+,"
!也高于
H
I2,"
!说明弱
酸性环境更适合龟裂秃马勃的生长!龟裂秃马勃对
酸性环境的适应力较碱性环境要好然而!当
H
I
下降至
&,"
和
%,"
!或上升到
+,"
和
2,"
时龟裂秃
马勃生物量显著下降!说明龟裂秃马勃对酸碱度的
忍耐力有限!过酸和过碱的环境都不利于其生长
?,@,@
!
温度对龟裂秃马勃生长的影响
!
温度对龟
裂秃马勃生长影响显著"图
)
!
Q
#!并在
!)J
时生长
最 好&温度升高后其生长显著减弱!在
%)J
时生长
图中不同小写字母表示经
=^0A50
新复极差法
验证在
",")
水平差异显著
图
)
!
龟裂秃马勃的生长曲线"
L
#及
H
I
"
_
#和
温度"
Q
#对其生长的影响
.^>>?S?0B6:9
0.>.A50B@.>>?S?0A?
5B",")Y
T
=^0A50
+
/0?<4=6B.
H
6?S50
9
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9
,)
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MS:!3()*
+
,)-*.
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#!
B8??>>?AB
:>
H
I
"
_
#
50@B?4
H
?S5B=S?
"
Q
#
:0.B/
9
S:最差&温度下降至
#)J
和
!"J
时龟裂秃马勃的生
长也显著减弱!但分别较温度升高至
%"J
和
%)J
时的生长要好因此!龟裂秃马勃对温度升高更为
敏感!而对温度降低的耐受性强于温度升高这可
能与该真菌生活在野外森林环境中有关!森林中晚
上温度较白天温度低!对真菌的生长和进化有一定
的适应和选择作用
?,@,A
!
碳源对龟裂秃马勃生长的影响
!
龟裂秃马
勃对不同碳源的利用能力不同研究发现!龟裂秃
马勃在以几丁质和碳酸氢钠为碳源的培养基上不生
长!故仅对剩余
2
种碳源进行分析!结果见图
$! L 以蔗糖为碳源的培养基中龟裂秃马勃生长效果最 好!直径达到" &,$)h",#)
#
A4
!其次在麦芽糖和葡
萄糖为碳源的培养基中也能较好生长!直径分别为
Q#,
葡萄糖&
Q!,
乳糖&
Q%,
甘露醇&
Q&,
可溶性淀粉&
Q),
果糖&
Q$麦芽糖& Q+, 蔗糖& Q2, 海藻糖& Q, 几丁质& Q#", 碳酸氢钠& G#, 酒石酸铵& G!, 磷酸氢二胺& G%, 硝酸钠& G&, 硝酸钙& G), 硝酸铵& G$,
硫酸铵&
G+,
甘氨酸&
G2,
脯氨酸&
G,
精氨酸&
G#",
天冬氨酸&
G##,
谷氨酸&
G#!,
丙氨酸&
G#%,
尿素&
G#&,
酪氨酸&图中不同小写
字母表示经
=^0A50
新复极差法验证在
",")
水平差异显著
图
$! 不同碳源" L #及氮源" _ #对龟裂秃马勃生长的影响 Q#,M6=A:/? & Q!,W5AB:/? & Q%,F500.B:6 & Q&,E:6=Y6?/B5SA8 & Q),RS=AB:/? & Q$,F56B:/?
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因此!培养龟裂秃马勃的最佳碳源是蔗糖
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氮源对龟裂秃马勃生长的影响
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#
A4
龟裂秃马勃在以不同氨基酸为
氮源的培养基上生长差异明显!其中脯氨酸有利于
龟裂秃马勃的生长!生长量达"
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#
A4
!而
对精氨酸的利用最差!仅为"
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由此
可知!龟裂秃马勃对氨基酸具有一定的选择性
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经分子特征鉴定以及回接油松检验!本研究首
次在子午岭林区油松林分离得到油松外生菌根真
菌,,,龟裂秃马勃"
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欧洲等地区均有报道(#*!#)在黄土高原子午岭林区
油松形成外生菌根为首次发现
龟裂秃马勃的子实体不仅可以食用!同时还具
有一定的药用价值(!!*!%)!为了更好地发挥其作用!本
研究进一步研究了龟裂秃马勃的培养条件纯培养
条件下!龟裂秃马勃生长的最佳
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!最佳碳源和氮源分别为蔗糖和脯氨酸
一般来说!菌根真菌喜偏酸性环境!最适
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现!与无机氮如硝酸铵和硫酸铵相比!有机态氮"如
赖氨酸等氨基酸#更能促使一些代谢产物的蓄积
但有报道认为!无机态氮可能更有利于真菌相关代
谢酶类的表达和分泌(!+)本研究结果对龟裂秃马
勃的进一步研究和应用具有重要的指导意义
参考文献!
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刘润进!陈应龙
,
菌根学(
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,
北京$科学出版社!
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