全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(1): 93-97(2011)
收稿日期: 2010-03-04; 修回日期: 2010-11-07
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30771354); 河北省杰出青年基金资助项目(C2009001540)
通讯作者: 董金皋,教授,主要从事植物分子病理学研究; E-mail: dongjingao@126. com。
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췍研究简报
谷子抗病基因同源序列的克隆与分析
董志平1, 李志勇1, 马继芳1, 瓮巧云2, 董 立1, 全建章1, 董金皋2*
( 1河北省农林科学院谷子研究所, 石家庄 050031; 2河北农业大学生命科学学院, 保定 071001)
Cloning and sequencing of disease resistance gene analogs in foxtail millet　 DONG
Zhi-ping1, LI Zhi-yong1, MA Ji-fang1, WENG Qiao-yun2, DONG Li1, QUAN Jian-zhang1, DONG
Jin-gao2 　 ( 1Millet Institute, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050031,China; 2Life Science
of College, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)
Abstract: Cloning approach of resistance gene analogs (RGA) is simple and practical method in finding
plant resistant gene. In order to clone RGA from the foxtail millet cultivar Shilixiang resistant to rust , PCR
method was carried out with degenerate primers based on conserved regions of NBS domain and STK domain.
25 NBS-LRR RGAs and 11 STK RGAs were isolated. The cloned NBS-LRR RGA had the conservative motifs
P-loop, Kinase 2a, Kinase 3a and hydrophobic domain and the cloned STK RGA had eight catalytic domain.
Tryptophan as the last residue of Kinase-2a motif and phylogenetic analysis showed that the cloned NBS-LRR
RGAs were non-TIR NBS-LRR family. The further study of such RGA was useful for breeding of rust resis-
tant foxtail millet cultivars and cloning rust resistant gene.
Key words: Setaria italica; Uromyces setariae-italicae; resistance gene analogs
文章编号: 0412-0914(2011)01-0093-05
　 　 谷子锈病是谷子上的一种流行性强、毁灭性大
的病害,严重影响谷子生产。 种植抗病品种是防治
锈病最经济有效的方法,但谷子抗锈病种质资源非
常贫乏,而且高抗锈病的材料其农艺性状又很差,
很难通过传统育种方法培育抗锈病品种,因此克隆
谷子抗锈病基因尤为重要。 目前克隆到的许多植
物抗病基因编码的氨基酸序列都有一定的保守结
构域。 根据抗病基因保守结构域,已克隆的抗病基
因主要分为 5 类,其中最主要的是 NBS-LRR(nu-
leotide-binding site leucine-rich repeat)和 STK(Se-
rine / Threonine protein kinase)类。 因而根据抗病
基因保守结构域设计引物,从植物的 DNA 中扩增
植物的抗病基因同源序列 RGA ( resistance gene
analogs)更加快捷有效,目前通过 RGA 方法克隆
植物抗病基因已有报道[1,2]。
本研究所用的谷子亲本“十里香”是从 16 000
多份谷子资源中鉴定出的高抗锈病抗源,具有稳定
的抗锈病遗传性。 本文根据 NBS-LRR 和 STK 类
抗病基因保守结构域设计简并引物,以“十里香”
基因组 DNA为模板扩增,从“十里香”中分离与克
隆谷子 NBS-LRR 和 STK 2 类抗病类似序列
(RGAs),为揭示谷子抗锈病机理,研究谷子抗锈
病相关基因的功能及利用提供参考。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
谷子“十里香”和大肠杆菌 JM109 菌株由本实
验室保存。
　
植物病理学报 41 卷
1. 2　 基因克隆
采集“十里香”幼叶,按常规 CTAB 法小量提
取基因组 DNA。 根据 NBS-LRR 类抗病基因保守
结构域 MGGVGKTT和 GLPLAL 设计 2 对简并引
物 P1: 5′-GGNATGGGNGGNNTNGGNAARAC-
NAC-3′和 P2: 5′-NACYTTNAGNGCNAGNGGN-
AGNCC-3′; P3: 5′-TGSSRGGHWYRGGBAAR-
ACTAC-3′和 P4: 5′-CARCGNTAGTGSCAMTCC-
3′,用来扩增谷子 NBS-LRR类 RGA; 根据 STK类
抗病基因保守结构域设计一对简并引物 STK1: 5′-
GGNCARGGNGGNTTYGGNWSNG-3′ 和 STK2:
5′-YTCNGGNGCDATRTANCCCATTG-3′,用来扩
增谷子 STK 类 RGA。 以“十里香”DNA 为模板,
利用上述引物进行 PCR 扩增。 扩增程序:94℃
5 min;94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 1 min,35 个循
环;72℃ 10 min。 将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳
后回收目的条带,与 T 载体连接后热激转化到大
肠杆菌 JM109 中, 通过菌落 PCR鉴定阳性克隆,
对阳性克隆进行测序(上海生工生物工程有限公
司)。
1. 3　 生物信息学分析
利用 NCBI中 ORF finder寻找各个 RGA开放
阅读框,NCBI 中蛋白比对分析所获的 RGA 与已
报道的抗病基因的同源性,并向 GenBank 提交所
克隆的谷子“十里香”抗病类似序列。 利用 DNA-
MAN软件分析各个 RGA 之间的保守结构域和同
源性并构建所获的 RGA聚类树,以 TIR-NBS-LRR
类烟 草 N 基 因 ( A54810 )、 亚 麻 L6 基 因
(AAA91021)、non-TIR-NBS-LRR 类拟南芥 RPS2
基因(Q42484)和水稻 Xa1 基因(T00020)为参照。
2　 结果与分析
2. 1 　 NBS-LRR 和 STK 类抗病基因同源序列的
扩增
利用同源序列法对谷子 NBS-LRR 和 STK 2
类 RGA 进行了研究,发现 25 个 NBS-LRR 类
RGA,分别命名为 N1 ~ N25 (GenBank 登录号:
GU930309 ~ GU930333 )。 得到 11 个 STK 类
RGA,分别命名为 S1 ~ S11 (GenBank 登录号:
GU930343 ~ GU930353)。
2. 2　 RGA序列比较及结构分析
通过 GenBank BLASTx 比对,发现本研究克
隆的 RGA与水稻和高粱的抗病相关基因具有很
高的同源性,其中 N1 与拟南芥抗病基因 RPM1 同
源性达 65% ,N23 与玉米抗锈病基因 Rp1-D 同源
性达 81% ,N9 与水稻抗病基因 Pi-ta 同源性达
71% ,S1 与水稻抗病基因 Xa21 同源性达 84% ,
S11 与小麦抗叶锈基因 Lr10 同源性达 89% ,其余
的序列与已报道的 R 基因也有很高的同源性。 研
究还发现,从 “十里香” 中克隆的 NBS-LRR 类
RGA 具有该亚类典型的保守结构域,如 P-loop
(GMGGVGKTT)、Kinase-2(LIVLDDVW / D) 、Ki-
nase-3(GSR / KILVTTR)和疏水结构域 HD (GL-
PLAL)。 所克隆的谷子 NBS-LRR类 RGA Kinase-
2 结构域最后一个氨基酸都为色氨酸,符合 non-
TIR-NBS-LRR类 RGA 特点(图 1)。 利用 DNA-
MAN 软件进行聚类分析发现 TIR-NBS-LRR 类
RGA(L6、N)聚在一起,而 non-TIR-NBS-LRR 类
RGA(Xa1、RPS2)与谷子中克隆的 25 个 NBS-LRR
类 RGA 聚类在一起(图 2),说明所克隆的 NBS-
LRR类 RGA为 non-TIR-NBS-LRR类 RGA。
克隆得到的 11 个 STK 类 RGA 具有与 Xa21
和 Lr10 等 RLKs基因所固有的 8 个保守催化结构
域(图 3)。 S5、S6、S7、S9、S11、S3 和 S8 与小麦抗
叶锈基因 Lr10 同源性都较高,说明谷子中这类的
丝 /苏氨酸激酶为一个大家族,且分化性很高。 S1
和 S4 与水稻抗病基因 Xa21 同源性很高。
3　 讨论
克隆植物抗病基因并阐明其抗病机制已成为
当今植物学研究领域的热点。 由于谷子中转座子
标签尚未建立,可用的分子标记比较少,因此通过
图位克隆法克隆抗病基因难度很大。 通过 PCR 扩
增抗病基因同源(类似)序列(RGA)己成为一种快
捷的克隆抗病基因的新途径,而且还有助于抗病基
因的分类及作用机制的研究。
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　 1 期 董志平,等:谷子抗病基因同源序列的克隆与分析
Fig. 1　 Multiple amino acid sequence alignment of the NBS-LRR-type RGA of foxtail millet
Ⅰ: P-loop; Ⅱ: RNBS-A; Ⅲ: Kinase-2; Ⅳ: Kinase-3; Ⅴ: HD.
　 　 本研究共克隆谷子 2 类 RGA。 第一类 NBS-
LRR类 RGA 得到了 25 个,这些基因在 Kinase-2
保守结构域中最后一个氨基酸均为色氨酸,并且都
含有 RNBS -A- nonTIR (FDLxA WV CV SQxF),
因此克隆得到的 NBS-LRR RGA都为 non-TIR类,
这与 Pan 等[3]和 Zhou 等[4]的研究结果一致。 目
前单子叶植物中所发现的 NBS-LRR 抗病基因均
为 non-TIR-NBS-LRR。
另一类 STK 类 RGA,主要为丝氨酸 /苏氨酸
蛋白激酶家族,该家族基因直接参与跨膜信号传
递、病原识别应答等过程[5]。 小麦抗叶锈基因
Lr10 和水稻抗病基因 Xa21 编码的抗病蛋白均属
于这一类。 经在 NCBI上进行蛋白比对,发现克隆
的 11 个 STK类 RGA 与 Lr10 和 Xa21 抗病基因同
源性很高,并且都具有 Lr10 与 Xa21 同样的保守结
构域,说明这 11 个 RGA也有可能参与谷子抗病信
号传递。
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植物病理学报 41 卷
Fig. 2　 Phylogenetic tree for foxtail millet NBS-LRR-type RGA based on amino acid sequences
Fig. 3　 Multiple amino acid sequence alignment of the STK-like RGAs of foxtail millet
Ⅰ: FGK / V / L / SVYK / RG; Ⅱ: VAVK; Ⅲ: FXXE; Ⅳ: L / V / IVXI / V / L; Ⅴ: ALV;
Ⅵ: DL / I / VK; Ⅶ: DFG; Ⅷ: GT / SXGYL / I / APE.
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　 1 期 董志平,等:谷子抗病基因同源序列的克隆与分析
　 　 谷子抗锈亲本材料“十里香”是一个优良的谷
子材料,目前我们正在利用 Northern杂交技术研究
各个 RGA接种后的表达特征,并鉴定与抗病相关
的 RGA,进而通过 RACE 方法获得抗锈相关的
RGA基因全长,通过转基因技术明确基因的功能,
寻找与“十里香”抗锈病连锁的 RGA,为“十里香”
抗锈基因的克隆与分子辅助育种奠定基础。
参考文献
[1] 　 Fenillet C, Schachermayr G, Keller B. Molecular clo-
ning of a new receptor-like gene encoded at the Lr10
disease resistance locus of wheat[ J] . The Plant Jour-
nal, 1997, 11: 45 -52.
[2] 　 Meyers B C, Kozik A, Griego A, et al. Genome-
wide analysis of NBS-LRR-encoding genes in Arabi-
dopsis [J] . Plant Cell, 2003, 15: 809 -834.
[3] 　 Pan Q L, Wendel J, Fluhr R. Divergent evolution of
plant NBS-LRR resistance gene homologues in dicot
and cereal genomes[ J] . Journal of Molecular Evolu-
tion, 2000, 50: 203 -213.
[4] 　 Zhou T, Wang Y, Chen J Q, et al. Genome-wide
identification of NBS genes in japonica rice reveals sig-
nificant expansion of divergent non-TIR NBS-LRR
genes[J] . Molecular Genetics Genomics, 2004, 271:
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[5] 　 Cui L L, Han X X, Xing J J, et al. Cloning and analy-
sis of STK resistance gene analog in Oryza minuta( in
Chinese) [ J] . Life Science Research (生命科学研
究), 2009, 13(2): 95 -98.
责任编辑:
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于金枝
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