全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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%修改稿收到日期$
!"#$)##)!+
基金项目$国家转基因专项"
!"##,-"."##)""!
#%兵团青年科技创新资金专项"
!"#$/0"#"
#
作者简介$沈海涛"
#%."
#!男!硕士!助理研究员!主要从事植物基因工程研究&
1)2345
$
6
789:&!#
!
#!*;/82
"
通信作者$祝建波!研究员!主要从事植物基因工程研究&
1)2345
$
!+(.$#!#$
!<<
;/82
转
,1234%!%
基因陆地棉鉴定
及其对水分渗透胁迫的分析
沈海涛#!!冯玉杰#!!王爱英#!!李予霞#!胡鸢雷$!祝建波#!"
"
#
石河子大学 生命科学学院!新疆石河子
.$!""$
%
!
石河子大学 农业生物技术重点实验室!新疆石河子
.$!""$
%
$
北京大学 生
命科学学院!北京
#"".+#
#
摘
!
要$通过花粉管通道技术!以该实验室自育陆地棉品系
=>
#
和
=>
!
为材料!将诸葛菜"
!"
#
$%&

%"(
)
*+,-./(0
$1+,
#抗逆转录因子
!-2345!5
基因构建到植物表达载体后!导入棉花基因组!经卡那霉素筛选和分子鉴定表明目
的基因已整合到棉花基因组中并表达&将
=
#
代转基因植株和受体对照在温室中栽培!待植株生长至四叶一心时!
用不同渗透势的
?1@)*"""
水溶液进行渗透胁迫处理!分析探讨转基因植株的抗旱效果及其抗旱机理&结果显示$
当渗透势为
"
和
";&A?3
处理时!转基因植株和对照无明显差异%当渗透势为
";.A?3
和
#;#A?3
处理时转基因
植株较对照抗旱性明显提高&当渗透势为
#;#A?3
处理
%*7
时!对照植株
6
B

6
2
降至
";!
左右!而转基因植株仍
正常生长!
6
B

6
2
值约为
";&#
!而且初始荧光"
6
"
#值(净光合速率"
7
C
#(胞间
DE
!
浓度"
8
4
#(蒸腾速率"
9
F
#等一系
列参数转基因植株都明显优于对照!表明
2345!5
基因能够提高棉花对水分胁迫的耐受性&
关键词$二月兰%
!-2345!5
%棉花%抗旱%
?1@)*"""
中图分类号$
G+.%
%
G%(&;+.
文献标志码$
H
"#$%&(
)
*%#+%*,
)
--.(/0*%-
1
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4
,*%#5.&&.%6&7
,1234%!%8$%$9%#$0:-;.&2<&0$--
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6
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6
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N
43C
6
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6
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X4C
N
43C
6
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^
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6
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6
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6
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8:OC:4353:9OO\54C
6
9:3
6
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Q
\4WWOFOC:8928:4/
^
8:OC:435
"
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#
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809OFBO\4C:F3C9
6
OC4/54CO93C\/8C:F85
^
53C:9;>8]OBOF
!
:7O:F3C9
6
OC4/54CO9O-
^
89O\:874
6
7OF8928:4/
^
8)
:OC:435
"
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^
53
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6
C4W4/3C:5
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6
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!
:7O:F3C9
6
OC4/
^
53C:9978]O\:7O94
6
C4W4/3C:5
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74
6
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^
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2345!5
6
OCOFO9M5:O\4C:7O\OBO58
^
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6
OC4/54CO9FO949:3C::8\F8M7
6
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!:2345!5
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#
.+*%.",+<+*
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\F8M
6
7:FO949:3C/O
%
?1@)*"""
!!
2345
类转录因子是植物所特有的一类在非
生物逆境胁迫应答中起重要作用的蛋白分子&此类
转录因子含有一个由
&.
个氨基酸组成的
H?!

1_1Z?
保守结构域!该结构域能与耐逆基因启动子
中的
_`1

D_=
顺式原件特异结合!启动基因表
达!因而
2345
转录因子被认为可能与植物对干
旱(高盐和低温应答的基因调控有重要关系)#*&目
前!已从拟南芥(水稻(玉米(小麦(黑麦(大豆(西红
柿和油菜等几十种植物中分离并鉴定出调控干早(
高盐及低温耐性的
2345
基因!并利用这些基因得
到了抗逆性增强的拟南芥(油菜(西红柿(小麦以及
杨树等转基因植株&转基因结果表明
2345
转录
因子家族在双子叶植物(单子叶植物(草本植物及木
本植物抗逆品种改良中均具有重要的应用价值)!*&
拟南芥中
2345
类基因分为
2345#
和
2345!
两
类!
2345#
类基因被低温胁迫诱导!但不被干旱和
高盐胁迫诱导!而
2345!
类基因可被干旱和高盐
胁迫诱导!不被低温胁迫诱导)$*&
Y3,M8J3[3974)
23
在拟南芥中利用拟南芥
2345!=
和
2345!5
启动子融合
;>?
基因在拟南芥中表达!发现干旱胁
迫后
2345!=
启 动 子 驱 动
;>?
表 达 量 高 于
2345!5
!说明
2345!=
可能对提高植物干旱胁
迫更 有 效)(*&然 而!
A3:9M[MF3
等 利 用 启 动 子
F\!%H
驱动水稻
!,2345!5
和
!,2345!=
转化
拟南芥!转基因拟南芥经水分胁迫后
!,2345!5
表达量显著增加)&*!而
!,2345!=
未被检测到!这
可能是拟南芥中基因转录后修饰系统与水稻不同!
导致水稻的
!,2345!=
在转化拟南芥后不能正常
表达)**&所以!外源
2345!5
转化植株后受植株本
身的转录后修饰导致基因沉默的风险可能小于
2345!=
&
植物在水分胁迫下!植物叶片荧光参数和光合
速率是反映植物抗旱性的重要指标&植物受水分胁
迫后!羧化反应相关酶的活性和中间产物的合成受
到抑制!导致光合机构的光抑制!严重时还可引起光
破坏)+).*!干旱胁迫加重时放氧复合体
E1D
会受到
损害!随之
?I
"
活性降低会导致激发能的上升!活
性氧自由基
_EI
浓度升高!伤害
?I
"
与
?I
#
之间
的电子传递链以及
?I
"
供(受体侧和反应中心!使
活性氧代谢失调!破坏生物膜结构!最终引起光合作
用下降)%)#"*&所以!植物在水分胁迫下测定光合参
数和荧光参数是反映植物抗旱性的重要指标&本研
究将来源于耐旱(耐寒的诸葛菜"
!"
#
$%&

%"(
)
*+,
-./($1+,
#的转录因子基因
!-2345!5
导入新疆陆
地棉品系
=>
#
和
=>
!
!使其能够表达并稳定遗传&
采用
?1@)*"""
作为水分渗透胁迫剂处理转基因植
株和对照植株!利用
R4)*(""
和
>3CQ
?1H
检测处
理植株的光合及荧光各项指标!分析转
!-2345!5
基因棉花抗旱性!以期为新疆陆地棉抗旱育种提供
新材料!创造新种质资源&
#
!
材料和方法
?;?
!
材
!
料
诸葛菜
!-2345!5
基因由北京大学生命科学
学院林忠平教授提供&转基因受体为本实验室自育
陆地棉品系
=>
#
和
=>
!
&大肠杆菌
=E?#"
(农杆
菌
@a$#"#
(植物表达载体
^
DHAZSH)!$""
由本实
验室保存&
9(
@
J`H
聚合酶(
=
(
J`H
连接酶(限
制性内切酶(
J`H A3F[OF
(
^
@A)=
载体和
J`H
片
段回收试剂盒均购自大连
=3Y3_3
公司%大肠杆菌
感受态细胞
=E?#"
和反转录试剂盒购自天根物技
术有限公司%基因序列测定由华大基因公司完成%卡
那霉素(高纯度质粒大提试剂盒购自天根生化科技
有限公司%其他化学试剂为国产分析纯产品&
?;!
!
方
!
法
?;!;?
!
植物表达载体构建及鉴定
!
根据
!:2345!5
基因序列设计引物!上游引物
?
#
"
&b)HH=D=H@@D)
D=D@H@DH@HD@)$b
#!下游引物
?
!
"
&b)=HDH@=H)
H@D@@D=DD@HD@)$b
#&
!"
$
R?D_
体系包含克隆
载体质粒
J`H!
$
R
(
#"c0MWOF!
$
R
(
\J=?
"
!&
2285

R
#
";$
$
R
(
A
6
D5
!
"
!&2285

R
#
$
R
(上游引物
"
!"2285

R
#
";&
$
R
(下游引物"
!"2285

R
#
";&
$
R
(
9(

酶
";$
$
R
"
!;&
%
&T

$
R
#(
\\>
!
E#$;(
$
R
&反
应程序$
%(d
预变性
&24C
!
%(d
变性
$"9
!
&&d
退火
(&9
!
+!d
延伸
$"9
!
$"
个循环后延伸
+24C
!琼脂糖
凝胶电泳分离后!获得
*%"0
^
左右的
J`H
片段!回
收目的片段&将回收的目的片段与克隆载体
^
@A)=
连接!将连接产物转化
=E?#"
感受态细胞&通过抗
生素及
&
)
互补筛选!挑取阳性克隆!用
I` I
碱裂解法
小量提取质粒!
?D_
检测&利用
4$&_
#
和
5(*>
#
双
酶切克隆载体和植物表达载体
^
DHAZSH)!$""
!并进
行 连 接!获 得 植 物 表 达 载 体
^
DHAZSH)!$"")
!-2345!5
"图
#
#!利用电转化法将该载体转化农杆
菌
@a$#"#
!挑取阳性克隆进行
?D_
鉴定&
*%$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
?;!;!
!
花粉管通道法转化棉花
!
花粉管通道法参
照马盾等采用的方法)##*&在棉花植株开花受精后
#!7
内!将外源基因溶液涂抹在柱头上!或用微量
注射器顺着花粉管通道注射进入卵细胞&
图
#
!
质粒
^
DHAZSH)!$"")!-2345!5
构建图
K4
6
;#
!
I:FM/:MFO8W
^
53924^
DHAZSH)!$"")!-2345!5
?;!;@
!
转基因棉花卡那霉素筛选
!
将部分收获的
棉花种子在石河子大学试验场进行田间种植!种植密
度为
$"
株
2
!
&待植株第二片真叶展开时进行第一
次卡那霉素抗性筛选!检测浓度为
!&""2
6

R
&
#
周
后观察检测结果!拔除卡那霉素检测呈阴性即叶片表
面出现黄色斑点的植株!余下植株每隔
#
周重复上一
次卡那霉素检测操作!连续
$
次!检测浓度依次为
$"""
(
&"""
和
+"""2
6

R
&将
(
次卡那霉素检测呈
阳性的植株挂牌标记&利用
?D_
和
_=)?D_
技术
对卡那霉素检测阳性植株进行分子检测!分子检测
为阴性植株去牌淘汰&
?;!;A
!
分子检测
!
?D_
检测$取卡那霉素检测呈
阳性的植株幼嫩叶片!参照
D=HZ
法提取叶片总
J`H
!用
!-2345!5
基因特异性引物
?
#
和
?
!
进
行
?D_
和
_=)?D_
检测&
拷贝数检测$随机选取一部分独立来源的经
?D_
验证的
=
"
转基因植株和非转化对照植株大量
提取基因组
J`H
&取转基因植株
J`H
!用
A.B
酶切后!在
";.e
琼脂糖凝胶上电泳分离!然后转
移到
>
Q
08C\)Jf
尼龙膜上&根据
!-2345!5
基
因序列设计引物制备探针(
?D_
扩增体系及程序见
?;!;?
&分子杂交和信号检测采用
H2OF9732
?73F23/43Z48:O/7
公司生产的
1DR
试剂盒!方法依
照操作手册&
?;!;B
!
转基因棉花渗透胁迫处理
!
用
";#e
>
6
D5
!
溶液处理供试棉种
&24C
!自来水冲洗干净
后!置于
!.d
培养箱催芽!选发芽程度一致的种子!
播种于装有河沙的塑料盆中!在生长室内培养&幼
苗出土后用
#

!
浓度
>83
6
53C营养液浇灌&每天
光照时间
#(7
!
R4)!&"H
光照计测得为
#"+(5-
!昼
夜温度
!.d

!"d
&幼苗生长至四叶一心时!选取
长势一致的转基因幼苗和受体对照!用
?1@)*"""
配成
"A?3
"
6

R
#(
";&A?3
"
#%$
6

R
#(
";.A?3
"
!&#
6

R
#和
#;#A?3
"
!%.
6

R
#
(
种不同水势的
#

!
浓度
>83
6
53C溶液进行水分胁迫处理!每个处
理
%
个重复&处理后
"
(
!(
(
.
和
%*7
测定各处理
植株倒四叶的光合参数和荧光特性&
?;!;C
!
光合特性和荧光特性分析
!
天气晴朗的正
午
#!
$
""
%
#*
$
""
!气温在
!!d
%
!(d
之间!将待测
植株从生长室移至室外!光适应
$"24C
!利用调整
好的光合仪
R4)*(""
进行相关光合参数的测定&将
待测植株暗适应处理
!"24C
后!用
>3CQ
?1H
荧
光测定仪"英国
>3C93:O/7
公司#测定荧光特性&
?;!;D
!
数据分析
!
利用
I?II#.;"
对实验数据进
行单变量多因素曲线图分析&
!
!
结果与分析
!;?
!
分子检测
利用特异性引物进行
?D_
扩增提取北京大学林
忠平教授提供的
!-2345!5
基因载体!连接克隆载
体
^
@A)=
!转化感受态细胞
=E?
#"
并测序&将测序
正确的目的基因连接到植物表达载体
^
DHAZSH)
!$""
!通过花粉管通道技术将
!-2345!5
基因导入
本实验室自育陆地棉品系
=>
#
和
=>
!
&后代植株经
卡那霉素筛选获得转
!-2345!5
基因的
=>
#
植株
+
株和转
!-2345!5
基因的
=>
!
植株
*
株&用
D=HZ
法提取
#$
个转基因植株基因组
J`H
!并进行
?D_
扩增&结果表明!转基因受体
=>
#
和
=>
!
各有
(
个转基因植株"
=>
#
)E
#
%
=>
#
)E
(
和
=>
!
)E
#
%
=>
!
)E
(
#与质粒对照"
^
DHAZSH)!$"#)!-2345!5
#
一致!在
*%"0
^
左右有目的条带"图
!
#&选取其中
!
个农艺性状和产量性状较好的转基因株系"
=>
#
)
E
!
和
=>
!
)E
(
#为研究材料!在温室中进行种植!待
图
!
!
转
!-2345!5
基因棉花
?D_
检测
A$;A3F[OF

%
#
%
+;
转
!-2345!5
基因
=>
#
植株%
.;=>
#
非转基因植株%
%
#(;=>
!
转
!-2345!5
基因植株%
#&;
质粒
^
DHAZSH)!$"")!-2345!5
%
#*;=>
!
非转基因植株
K4
6
;!
!
?D_:O9:8W:F3C9
6
OC4//8::8C
^
53C:9
A$;A3F[OF

%
#
%
+;=F3C9
6
OC4/!-2345!5/8::8C=>
#
%
.;D8::8C
=>
#
%
%
#(;=F3C9
6
OC4/!-2345!5/8::8C=>
!
%
#&;?53924^
DHAZSH)!$"")!-2345!5
%
#*;D8::8C=>
!
+%$!
#!
期
!!!!!!!!!
沈海涛!等$转
!-2345!5
基因陆地棉鉴定及其对水分渗透胁迫的分析
植株生长至四叶一心时!提取顶部新叶总
_JH
!进
行
_=)?D_
检测鉴定"图
$
#!表明
!-2345!5
基
因在转基因植株中成功表达&利用
I8M:7OFC
杂交
技术对转基因植株拷贝数进行分析!结果显示!转基
因株系
=>
#
)E
!
和
=>
!
)E
(
各有
!
个杂交条带!说
明
!-2345!5
基因为双拷贝插入"图
(
#&
!E!
!
FG8
胁迫下转
,1234%!%
基因对棉花叶片
最大光化学效率与初始荧光的变化
在不同浓度
?1@)*"""
胁迫处理不同时间!棉
花荧光动力学参数
6
B

6
2
影响线性关系!随着渗透
势和处理时间的增加
6
B

6
2
值逐渐降低"图
&
%
*
#&
渗透势为
"A?3
和
";&A?3
时!转基因植株与对照
在处理不同时间的差异并不明显!为
";*
左右%当渗
透势为
";.A?3
和
#;#A?3
胁迫
!(7
!转基因株系
荧光动力学参数下降幅度明显低于对照&渗透势
#;#A?3
处理
%*7
!对照植株已严重脱水萎蔫!
6
B

6
2
降至
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左右!而转基因植株仍正常生长!
6
B

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2
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图
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基因棉花
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和
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基因棉
花叶片光合性能及蒸腾速率的影响
!E@E?
!
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!
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速 率随胁迫时间的延长逐渐降低!当渗透势为
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图
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和
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胁迫
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后!
7
C
降低至
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因植株
7
C
变化趋势与对照相似!但降低幅度明显
小于对照!渗透势
#;#A?3
胁迫转基因植株
%*7
!
转基因植株
7
C
仍维持在
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以上"图
.
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!
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!
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!
经
";.A?3
和
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水分渗透胁迫处理后!对照植株随胁迫时间的增加
8
4
呈逐渐降低趋势&说明对照植株短时间水分胁
迫后气孔关闭!导致
8
4
降低!当处理
!(7
后!由于
持续水分胁迫导致叶绿体受到损伤!
?I
"
系统受到
破 坏!
8
4
持续下降!处理
%*7
后!
8
4
达到
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左右&
转基因植株随胁迫时间的增加
8
4
一直呈缓慢下降
趋势!下降速率明显小于对照!胁迫处理
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后
8
4
处于
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和
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!
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!
转基因植株和对照经水分渗透
胁迫处理后!
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F
的变化趋势与
7
C
相似!都随渗透势
的增大胁迫时间的增加而降低&对照植株
9
F
降低
速率明显高于转基因植株!当渗透势为
#;#A?3
处
理对照植株
%*7
后!
9
F
降至
"
!而转基因植株
9
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仍
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#&
$
!
讨
!
论
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对转
!-2345!5
基因
棉花植株及对照植株进行渗透胁迫处理!研究
!-2345!5
基因提高棉花抗旱方面的功能&结果
显示$转基因植株受水分渗透胁迫后荧光参数和光
合参数明显优于对照植株&当植株受水分胁迫!初
始荧光
6
"
显著上升!
6
B

6
2
陡然降低意味着干旱
胁迫对棉花叶片光系统
"
"
?I
"
#的活性中心产生
伤害!破坏了对照植株
?I
"
的反应中心和部分蛋白
复合体的结构)#!*!抑制光合作用的原初反应!这对
光合速率的下降起着非常重要的影响&而且!植株
受水分胁迫后导致气孔关闭!胞间
DE
!
浓度降低!
蒸腾速率也随之降低!从而进一步影响植株的光合
效率)#$*&对照植株经渗透势
#;#A?3
处理
%*7
后!光合速率几乎为
"
!光合作用基本停滞!而转基
因植株经渗透胁迫处理后!荧光参数和光合参数的
各项指标变化明显小于对照!即使渗透势为
#;#
A?3
处理
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!转基因植株光合效率只降低
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%
&"e
&
!-2345!5
基因提高植物抗旱性的机理可
能是由于在逆境胁迫下
2345!
类基因不仅有转录
因子的作用!而且可能还具有应急激活调节作用"如
磷酸化酶#)$*&
2345!5
基因转录产物是植物受水
分胁迫下激活
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和其他
234

839
调节的靶
基因所必需)(*!从而提高植物对水分胁迫的耐受性&
%%$!
#!
期
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沈海涛!等$转
!-2345!5
基因陆地棉鉴定及其对水分渗透胁迫的分析
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驱动
2345!5
基因在转基因植株受水分胁
迫后会在叶(根和茎中大量表达!脯氨酸(可溶性糖(
甜菜碱等渗透调节物质明显增加)(!#()#**!从而减轻
在轻度或中度水分胁迫对植物叶肉细胞的伤害!降
低水分胁迫对叶片
?I
"
系统的伤害!维持正常的细
胞代谢活动&
参考文献!
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