全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４３(６): ５９０￣５９５(２０１３)
收稿日期: ２０１３￣０１￣１７ꎻ 修回日期: ２０１３￣０９￣１８
基金项目: 国家农业行业专项计划 (ｎｙｈｙｚｘ２００９０３０１７￣０８)
通讯作者: 洪 霓ꎬ教授ꎬ主要从事植物病毒学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｈｎｉ＠ｍａｉｌ.ｈｚａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
共同第一作者: 施世明ꎬ男ꎬ湖北省武汉人ꎬ硕士ꎬ研究方向为植物病毒学ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ３５８２８７２４７＠１６３.ｃｏｍꎻ
王彦芬ꎬ女ꎬ河南省濮阳人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为植物病毒学ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｙｆｈｉｓｔ＠１６３.ｃｏｍꎮ
侵染我国芋的杆状 ＤＮＡ病毒分子鉴定及特异性检测
施世明１＃ꎬ 王彦芬１＃ꎬ 王国平１ꎬ２ꎬ 王利平１ꎬ 徐文兴１ꎬ 洪 霓１ꎬ２∗
( １华中农业大学植物科技学院ꎬ 湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室ꎬ 武汉 ４３００７０ꎻ
２ 华中农业大学ꎬ 农业微生物学国家重点实验室ꎬ 武汉 ４３００７０)
摘要:采用已报道杆状 ＤＮＡ病毒属(Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ)的通用检测引物 ＢａｄｎａＦＰ / ＢａｄｎａＲＰꎬ从 ７份芋样品中扩增到 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ病
毒的 ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ基因保守区域ꎬ获得 １２个克隆序列ꎬ长度为 ５７６ ｂｐꎮ 序列分析结果显示ꎬ来自不同样品的克隆间核苷酸
和氨基酸序列相似性分别为 ７８.８％~９９.５％和 ８１.３ ％~９９.５％ꎻ来自同一样品扩增产物的克隆间在序列上也存在较大差异ꎬ
核苷酸和氨基酸序列相似性分别为 ８９.６％~１００％和 ９２.７％ ~ １００％ꎮ 在系统进化树中ꎬ本研究所获序列与 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ 病毒
的亲缘关系相对较近ꎬ聚在同一簇ꎬ表明此病毒为 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ属病毒ꎬ但与芋杆状病毒(Ｔａｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓꎬＴａＢＶ)序列相
似性较低ꎬ核苷酸和氨基酸相似性分别为 ５８.０％~６２.２％和 ５８.５％~６４.１％ꎬ推测为杆状 ＤＮＡ病毒属的一个新种ꎮ 根据所测
定序列设计了用于该病毒检测的引物 Ｐ１９７ / Ｐ４３３ꎬ对 ５１份芋样品检测结果表明ꎬ该引物可有效检测来源于我国芋的 Ｂａｄｎａ￣
ｖｉｒｕｓ病毒ꎮ
关键词:芋ꎻ 杆状 ＤＮＡ病毒ꎻ ＰＣＲꎻ 序列分析
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｔａｒｏ ｇｒｏｗｎ ｉｎ
Ｃｈｉｎａ 　 ＳＨＩ Ｓｈｉ￣ｍｉｎｇ１＃ꎬ ＷＡＮＧ Ｙａｎ￣ｆｅｎ１＃ꎬ ＷＡＮＧ Ｇｕｏ￣ｐｉｎｇ１ꎬ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｌｉ￣ｐｉｎｇ１ꎬ ＸＵ Ｗｅｎ￣ｘｉｎｇ１ꎬ
ＨＯＮＧ Ｎｉ１ꎬ２ 　 ( １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ Ｈｕｂｅｉꎬ
Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７０ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ａｇｒｏｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ＢａｄｎａＦＰ / ＢａｄｎａＲＰ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｄｎａｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ
ｔａｒｏ ｇｒｏｗｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ５７６ ｂｐꎬ ｃｏｖｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ (ＲＴ) ａｎｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈ (ＲＮａｓｅ Ｈ)ꎬ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅｖｅｎ ｓａｍｐｌｅｓ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １２
ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｏｓｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｈａｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｏｆ
７８􀆰 ８％－９９.５％ ａｎｄ ８１.３％－９９.５％ ａｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ (ｎｔ) ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ (ａａ) ｌｅｖｅｌｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ
ｓａｍｐｌｅ ｈａｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｏｆ ８９.６％－１００％ ａｎｄ ９２.７％－１００％ ａｔ ｎｔ ａｎｄ ａａ ｌｅｖｅｌｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｈａｒｅｄ ｏｎｌｙ
５８.０％－６２.２％ ｎｔ ａｎｄ ５８.５％－６４.１％ ａａ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔａｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓꎬ ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｉｔ
ｍｉｇｈｔ ｂｅ ａ ｎｅｗ ｔｅｎｔａｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ. Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐ１９７ / Ｐ４３３ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｉｓ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ５１ ｔａｒｏ ｓａｍｐｌｅｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ
ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｄｎａｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｔａｒｏ ｇｒｏｗｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｔａｒｏꎻ Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓꎻ ＰＣＲꎻ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
中图分类号: Ｓ４３２.４１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０６￣０５９０￣０６
　
　 ６期 　 　 施世明ꎬ等:侵染我国芋的杆状 ＤＮＡ病毒分子鉴定及特异性检测
　 　 芋[Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ(Ｌ.) Ｓｃｈｏｔｔ]是天南星
科(Ａｒａｃｅａｅ)芋属(Ｃｏｌｏｃａｓｉａ)多年生宿根草本植
物ꎬ在长期的无性繁殖过程中ꎬ病毒不断积累而加
重危害ꎬ导致芋产量和品质下降[１ꎬ２]ꎮ Ｙａｎｇ 等[３]
报道巴布亚新几内亚等太平洋岛国种植的芋上广
泛分布着一种杆状 ＤＮＡ 病毒ꎬ命名为芋杆状病毒
(Ｔａｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓꎬＴａＢＶ)ꎮ ＴａＢＶ 为花椰菜
花叶病毒科 (Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ)杆状 ＤＮＡ 病毒属
(Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ)成员[３~５]ꎮ 目前 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ 有 １８ 个
正式种和 １２个暂定种[６]ꎬ代表种是鸭跖草黄斑驳
病毒(Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓꎬＣｏｍＹＭＶ)ꎮ
该属病毒的基因组为单分子不完全环状双链 ＤＮＡ
(Ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡꎬｄｓＤＮＡ)ꎬ大小为 ７􀆰 ５ ｋｂ ~
８􀆰 ０ ｋｂꎬ含有 ３ ~ ７ 个开放阅读框 (Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅꎬ ＯＲＦ)ꎮ 基因组的逆转录酶(ＲＴ)和 ＲＮＡ
酶 Ｈ(ＲＮａｓｅ Ｈ)编码区相对保守ꎬ其序列特征可用
于该属各病毒种的鉴定[７~１０]ꎮ ＴａＢＶ 的基因组序
列全长为 ７ ４５８ ｂｐꎬ正义链包含 ４ 个 ＯＲＦꎬ已有研
究表明该病毒存在高度分子变异[１１~１３]ꎬ不仅使该
病毒在生物学和血清学上具有多样性ꎬ也导致常规
ＰＣＲ检测技术的检测效果不稳定ꎮ
我国芋产业发展迅速ꎬ芋病毒病的危害已引起
人们的高度重视ꎬ但相关研究仍较薄弱ꎮ 本研究通
过收集田间表现病毒病症状的芋样品ꎬ进行了杆状
ＤＮＡ病毒分子鉴定和 ＰＣＲ 检测的改进ꎬ研究结果
对深入了解芋杆状 ＤＮＡ 病毒的分子特性提供了
有用信息ꎬ同时为芋无病毒种质培育提供了有效的
病毒检测技术ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 供试材料
从湖北武汉、黄石、仙桃和山东临沂共采集芋
叶片样品 ５１份ꎬ多数采样植株的叶片表现花叶或
羽状斑驳等症状ꎮ
１.２　 总核酸的提取
取待检材料嫩叶 ０.１ ｇꎬ加液氮研磨成粉状ꎬ快
速转入 ２ ｍＬ 离心管中ꎬ加入 ８００ μＬ １.５％ＣＴＡＢ
提取缓冲液ꎬ剧烈混匀ꎬ６５℃水浴 ３０ ｍｉｎ 后离心ꎬ
上清液经氯仿抽提 ２次后ꎬ加入 ２ / ３体积的异丙醇
沉淀核酸ꎬ沉淀物经 ７５％乙醇洗涤 ２次ꎬ风干后ꎬ溶
于 ５０ μＬ无菌水ꎬ－２０℃保存ꎮ
１.３　 引物设计与合成
用于扩增杆状 ＤＮＡ病毒部分 ＲＴ 和 ＲＮａｓｅ Ｈ
基因的引物为 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ 属通用引物 ＢａｄｎａＦＰ /
ＢａｄｎａＲＰ:ＡＴＧＣＣＩＴＴＹＧＧＩＡＡＲＡＡＹＧＣＩＣＣ / ＣＣＡ￣
ＹＴＴＲＣＡＩＡＣＩＳＣＩＣＣＣＣＡＩＣＣ[３]ꎮ
根据本研究所获得的杆状 ＤＮＡ 病毒 ＲＴ /
ＲＮａｓｅ Ｈ基因保守序列设计了该病毒的检测引物
Ｐ１９７ / Ｐ４３３: ＴＧＡＡＡＡＴＨＧＣＲＧＴＡＣＣＡＷＣＣＡＴ /
ＲＧＣＣＣＡＲＴＣＹＴＧＴＴＫＲＴＴＣＡＴ(Ｈ ＝ Ａ / Ｃ / ＴꎬＲ ＝
Ａ / ＧꎬＷ＝Ａ / Ｔꎬ Ｙ＝Ｃ / Ｔꎬ Ｋ＝Ｇ / Ｔ)ꎮ 引物均由上
海生工生物技术有限公司合成ꎮ
１.４　 ＰＣＲ
以提取的芋叶片总核酸为模板ꎬＰＣＲ反应总体
系为 ２５ μＬꎬ含 １０×ＰＣＲ 溶液 ２.５ μＬ、 ｄＮＴＰｓ (２.５
ｍｍｏｌ / Ｌ) ０.５ μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶(５ Ｕ / μＬ)(宝生
物工程(大连)有限公司) ０.２ μＬ、正向和反向引物
各 ０.５ μＬ(１０ μｍｏｌ / Ｌ)、总核酸 １ μＬ和灭菌的去离
子水 １９.８ μＬꎮ 扩增条件为:９４℃预变性 ３ ｍｉｎꎻ９４℃
变性 ３０ ｓꎬ５０℃ (引物 ＢａｄｎａＦＰ / ＢａｄｎａＲＰ)和 ５５℃
(引物 Ｐ１９７ / Ｐ４３３)退火 ３０ ｓꎬ７２℃延伸 ４５ ｓꎬ３５个循
环后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ产物在 １.２％琼脂糖凝
胶上电泳后在 ＥＢ 中染色 １０ ｍｉｎꎬ将其置于凝胶成
像系统上观察并记录结果ꎮ
１.５　 扩增产物克隆及测序
ＰＣＲ产物经 １.２％琼脂糖凝胶电泳后ꎬ按琼脂糖
凝胶 ＤＮＡ纯化回收试剂盒 Ｖ３.０(北京道普生物科
技有限公司)说明回收目标 ＤＮＡꎬ连接至 ｐＭＤ１８￣Ｔ
载体(宝生物工程(大连)有限公司)ꎬ转化大肠杆菌
(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)ＤＨ５α菌株感受态细胞后ꎬ涂布在
含 １００ ｍｇ / Ｌ 氨苄青霉素(ＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎꎬＡｍｐ)的 ＬＢ
固体培养基上ꎬ待菌落长出后随机挑取一定数量的
白色单菌落ꎬ在含 １００ ｍｇ / Ｌ Ａｍｐ的 ＬＢ液体培养基
中振荡培养ꎬＰＣＲ鉴定为阳性克隆后ꎬ将菌液送由南
京金斯瑞生物科技有限公司进行测序ꎮ
１.６　 序列分析
序列比对采用生物学软件 Ｃｌｕｓｔａｌｘ (１.８１)和
ＤＮＡＭＡＮ(５. ２. ２) 完成ꎬ系统发育树构建采用
ＭＥＧＡ４.１软件中的邻接法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇꎬ ＮＪ)
进行ꎮ 采用已报道的花椰菜花叶病毒科的 ６ 属病
毒参照序列见表 １ꎮ
１９５
　
植物病理学报 ４３卷
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｍｅｍｂｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｇｅｎｕｓ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ａｃｒｏｎｙｍ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ.
Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ Ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｅｔｃｈｅｄ ｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ＣＥＲＶ ＮＣ００３４９８
Ｄａｈｌｉａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ＤａＭＶ ＡＹ３０９４７９
Ｆｉｇｗｏｒｔ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ＦＭＶ ＮＣ００３５５４
Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ ＨＲＬＶ ＡＹ５３４７３２
Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ＭｉＭＶ ＡＦ４５４６３５
Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｖｅｉｎ ｂａｎｄｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ＳＶＢＶ ＮＣ００１７２５
Ｐｅｔｕｖｉｒｕｓ Ｐｅｔｕｎｉａ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ＰＶＣＶ ＮＣ００１８３９
Ｓｏｙｍｏｖｉｒｕｓ Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｒｅｄ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ ＢＲＲＳＶ ＡＦ４０４５０９
Ｐｅａｎｕｔ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ ＰＣＳＶ ＮＣ００１６３４
Ｓｏｙｂｅａｎ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ ＳｂＣＭＶ Ｘ１５８２８.２
Ｃａｖｅｍｏｖｉｒｕｓ Ｔｏｂａｃｃｏ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ＴＶＣＶ ＡＦ１９０１２３
Ｃａｓｓａｖａ ｖｅｉｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ＣｓＶＭＶ Ｕ２０３４１
Ｔｕｎｇｒｏｖｉｒｕｓ Ｒｉｃｅ ｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓ ＲＴＢＶ ＡＦ２２０５６１
Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ Ｂａｎａｎａ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ∗ ＢＳＶ ＦＪ５９４９１０
Ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂａｃｉｌｌｉｆｒｏｍ ｖｉｒｕｓ ＳＣＢＶ ＦＪ８２４８１４
Ｐｉｐｅｒ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ ＰＹＭＶ ＤＱ８３６２３７
Ｔａｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓ ＴａＢＶ ＡＹ１８６６１５
Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓ ＤＢＶ ＡＭ５０３４０２
“∗ ”: Ｔｈｅ ｎａｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｒｅｖｉｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｔｅｓｔ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｒｅｐｏｒｔ. Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｉｓ ｍｏｓｔｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ
Ｂａｎａｎａ ｓｔｅａｋ ＯＬ ｖｉｒｕｓ (ＡＪ００２２３４) .
２　 结果与分析
２.１　 杆状 ＤＮＡ病毒的 ＲＴ/ ＲＮａｓｅ Ｈ基因分子鉴定
所采集芋样品中随机取 ２６ 份样品ꎬ以所提取
总核酸为模板ꎬ用 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ 属病毒通用引物
ＢａｄｎａＦＰ / ＢａｄｎａＲＰ进行 ＰＣＲ扩增ꎬ其中 １３ 份样品
获得了预期大小的扩增条带ꎬ同时存在 ２ ~ ３ 条非
目标条带(图 略)ꎬ对目标产物进行回收纯化、克隆
和测序ꎬ来自每个样品的测序克隆数为 １ ~ ３ 个ꎬ结
果显示来自湖北武汉蔬菜所 ７ 个样品的扩增片段
为 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ病毒 ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ基因保守区ꎬ共获
得 １２个克隆的序列(表 ２)ꎬ经测序可得目标片段
大小均为 ５７６ ｂｐꎮ 序列比对结果显示ꎬ来自不同样
品的克隆间核苷酸和氨基酸序列相似性分别为
７８􀆰 ８％ ~ ９９􀆰 ５％和 ８１􀆰 ３％ ~ ９９􀆰 ５％ꎻ来自同一样品
(样品 Ｔ￣２和 Ｔ￣４)扩增产物的克隆间在序列上也
存在较大差异ꎬ核苷酸和氨基酸序列相似性分别为
８９􀆰 ６％~１００％和 ９２􀆰 ７％~１００％ꎮ
　 　 本研究所获得的病毒序列与 ＮＣＢＩ 上登录的
Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ属病毒序列相似性相对较高ꎬ与我国报
道的登录号为 ＦＪ５９４９１０ 的 ＢＳＶ 相似性最高ꎬ核苷
酸和氨基酸相似性分别为 ７０.３％~７４.１％和 ７２􀆰 ９％~
７７.０％ꎻ与报道的巴布亚新几内亚芋上分离的 ＴａＢＶ
(登录号:ＡＦ３５７８３６)核苷酸和氨基酸相似性分别为
５８.０％~６２.２％和 ５８.５％~６４.１％ꎮ
对本研究所获序列与花椰菜花叶病毒科的 ６
属代表病毒种的序列(表 １)进行系统进化分析ꎬ结
果显示ꎬ 所获得病毒序列与 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ 属的
ＰＹＭＶ、ＢＳＶ、ＤＢＶ、ＳＣＢＶ 和 ＴａＢＶ 亲缘关系相对
较近ꎬ在系统进化树中聚在一簇ꎬ与其他属的病毒
亲缘关系较远(图 １)ꎬ表明此病毒为 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ属
病毒ꎮ 而在 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ 病毒中ꎬ来自我国芋上的
ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ基因序列与已报道的该属病毒相应
序列存在较大差异ꎬ单独聚为一个亚簇ꎮ
２９５
　
　 ６期 　 　 施世明ꎬ等:侵染我国芋的杆状 ＤＮＡ病毒分子鉴定及特异性检测
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｅｒｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ (ｂｅｌｏｗ ｄｉａｇｏｎａｌ) ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ (ａｂｏｖｅ ｄｉａｇｏｎａｌ)
ｏｆ ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ａ ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔａｒｏ ｐｌａｎｔｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ
Ｉｓｏｌａｔｅ Ｔ￣１ Ｔ￣２￣１ Ｔ￣２￣２ Ｔ￣２￣３ Ｔ￣３ Ｔ￣４￣１ Ｔ￣４￣２ Ｔ￣４￣３ Ｔ￣５ Ｔ￣６￣１ Ｔ￣６￣２ Ｔ￣７
Ｔ￣１ ￣￣ ９６.３ ９３.２ ９３.２ ９３.７ ９６.９ ９９.５ ９９.５ ８３.８ ９５.３ ９５.３ ８３.８
Ｔ￣２￣１ ９１.０ ￣￣ ９４.８ ９２.７ ９３.２ ９８.４ ９６.９ ９６.９ ８２.３ ９４.８ ９４.８ ８３.３
Ｔ￣２￣２ ８９.２ ８９.９ ￣￣ ９７.９ ９５.３ ９４.３ ９３.７ ９３.８ ８１.８ ９６.９ ９６.９ ８２.８
Ｔ￣２￣３ ８８.５ ８９.６ ９８.６ ￣￣ ９４.３ ９３.２ ９２.７ ９２.７ ８１.８ ９５.８ ９５.８ ８１.８
Ｔ￣３ ８９.２ ８７.０ ９３.１ ９２.４ ￣￣ ９２.７ ９４.２ ９４.３ ８１.３ ９６.４ ９６.４ ８２.３
Ｔ￣４￣１ ９１.１ ９９.５ ８９.８ ８９.８ ８６.８ ￣￣ ９６.３ ９６.４ ８３.３ ９４.３ ９４.３ ８３.３
Ｔ￣４￣２ ９７.７ ９１.７ ８９.９ ８９.２ ９０.５ ９１.５ ￣￣ １００.０ ８３.２ ９５.８ ９５.８ ８４.３
Ｔ￣４￣３ ９８.１ ９２.０ ９０.３ ８９.６ ９０.５ ９１.８ ９９.７ ￣￣ ８３.３ ９５.８ ９５.８ ８４.４
Ｔ￣５ ８１.１ ８１.８ ８０.２ ７９.７ ７８.８ ８１.９ ８０.４ ８０.７ ￣￣ ８１.８ ８１.８ ９９.０
Ｔ￣６￣１ ８８.５ ８８.５ ９２.９ ９２.２ ９２.２ ８８.４ ８８.７ ８９.１ ８０.０ ￣￣ １００.０ ８２.８
Ｔ￣６￣２ ８８.５ ８８.５ ９２.９ ９２.２ ９２.２ ８８.４ ８８.７ ８９.１ ８０.０ １００.０ ￣￣ ８２.８
Ｔ￣７ ８０.９ ８２.３ ８０.４ ７９.９ ７９.３ ８２.１ ８０.９ ８１.３ ９９.５ ８０.６ ８０.６ ￣￣
Ｎｏｔｅ:Ｓａｍｐｌｅ ＩＤ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｃｌｏｎｅ ｎｕｍｂｅｒ.
Ｆｉｇ. １　 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｊｏｉｎｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｏｆ ｐａｒｔｉａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ(Ａ) ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ(Ｂ)
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ａｎｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ
“▲”: Ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ.
２.２　 来源于芋的杆状 ＤＮＡ病毒的 ＰＣＲ检测
根据所获得的来源于我国芋的 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ 病
毒 ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ基因的部分保守区域序列设计了
该病毒的特异性检测引物 Ｐ１９７ / Ｐ４３３ꎬ结合位点为
引物 ＢａｄｎａＦＰ / ＢａｄｎａＲＰ 扩增所获 ５７６ ｂｐ 片段的
１９６~２１７ ｂｐ和 ４３２~４５２ ｂｐꎮ 采用引物 Ｐ１９７ / Ｐ４３３
对采自湖北和山东的 ５１ 份样品进行了 ＰＣＲ
检测(图２) ꎬ从３８份样品中扩增到２５７ ｂｐ的目标
３９５
　
植物病理学报 ４３卷
Ｆｉｇ. ２　 １.２％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｏｆ ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ￣ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｓｏｍｅ ｔａｒｏ ｐｌａｎｔｓ
Ｌａｎｅ Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ Ⅱꎻ Ｌａｎｅ １￣１７: Ｔａｒｏ ｓａｍｐｌｅｓꎻ ＣＫ: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
产物ꎬ且目标产物的电泳条带单一ꎬ无非特异性条
带ꎬ检出率为 ７４.５％ꎮ 其中来自武汉蔬菜所的 １０
个样品中 ８ 个扩增结果为阳性ꎬ较引物 ＢａｄｎａＦＰ /
ＢａｄｎａＲＰ扩增效率高 １０％ꎻ而其他来源的样品的
扩增阳性率达 ５０％~１００％(表 ３)ꎮ 对来自部分样
品的目标片段进行回收克隆测序ꎬ序列分析表明所
获扩增片段为杆状 ＤＮＡ病毒 ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ基因的
保守序列ꎮ
３　 结论与讨论
本研究首次从中国大陆的芋头上检测到一种
杆状 ＤＮＡ 病毒ꎬ对其 ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ 基因序列进行
分析的结果显示ꎬ该病毒的 ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ基因核苷
酸和氨基酸序列在系统进化树中均与花椰菜花叶
病毒科的 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ属的病毒聚在一簇ꎬ确认其为
Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ属病毒ꎮ 同时发现来自我国种植芋的
杆状 ＤＮＡ病毒的 ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ基因的核苷酸和氨
基酸序列相似性较高ꎬ而与已报道病毒的 Ｂａｄｎａ￣
ｖｉｒｕｓ属各病毒的核苷酸及氨基酸序列相似性均低
于 ８０％ꎬ并形成独立的一个亚簇ꎮ ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ 基
因为 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ属病毒的保守基因[３ꎬ７~１０]ꎬ根据国
际病毒分类委员会有关 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ 属不同种的划
分标准ꎬ即不同种的 ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ 序列差异大于
２０％[６]ꎬ结合本研究所获得序列的系统进化关系ꎬ
以及与已知 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ属的各病毒序列比较结果ꎬ
推测此病毒可能为 Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ 属的一个新种ꎮ 有
关该病毒的起源、生物学和分子特性及分类地位
等ꎬ还有待深入研究ꎮ
采用简并引物对来自我国种植芋的杆状 ＤＮＡ
病毒的 ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ 基因扩增及序列分析结果显
示ꎬ所用引物扩增效率较低ꎬ且存在非特异性条带ꎬ
在 １３份具有目标产物的样品中仅有 ７份样品的扩
增产物来自 ＤＮＡ 病毒的 ＲＴ / ＲＮａｓｅ Ｈ 基因ꎬ由于
该病毒序列与已报道序列存在较大变异ꎬ已报道的
引物[１１]不适合来源于我国芋的该病毒的检测ꎮ 而
所设计的针对本研究所分析病毒设计的检测引物ꎬ
Ｔａｂｌｅ ３　 ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔａｒｏ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｉｅｌｄｓ
Ｓａｍｐｌｅ ｓｏｕｒｃｅｓ Ｓａｍｐｌｅ ＩＤ
Ｎｏ. ｏｆ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ
Ｎｏ. ｏｆ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ
Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ / ％
Ｈｕｂｅｉ Ｃａｉｄｉａｎ Ｍａｊｉａｄｕ ＭＪＤ ５ ５ １００.０
Ｈｕｂｅｉ Ｘｉａｎｔａｏ ＸＴ ８ ５ ６２.５
Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＨＮ ４ ２ ５０.０
Ｗｕｈａｎ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＳＣＳ １０ ８ ８０.０
Ｈｕｂｅｉ Ｈｕａｎｇｓｈｉ ＨＳ ２１ １５ ７１.４
Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｌｉｎｙｉ ＬＹ ３ ３ １００.０
Ｔｏｔａｌ ５１ ３８ ７４.５
４９５
　
　 ６期 　 　 施世明ꎬ等:侵染我国芋的杆状 ＤＮＡ病毒分子鉴定及特异性检测
具有特性高、检测效果稳定的特点ꎬ可用于我国种
植芋的杆状 ＤＮＡ病毒的批量检测ꎮ
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ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｐａｃｉfiｃ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｔａｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｖｉ￣
ｒｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＰＣＲ￣ｂａｓｅｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔ
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[１３] Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ Ｋ ＳꎬＥｇｅｓｋｏｖ Ｎ ＭꎬＳｍｉｔｈ Ｇ Ｒ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
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责任编辑:于金枝
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