全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４３(３): ３１８￣３２２(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣０６￣１５ꎻ 修回日期: ２０１３￣０２￣１６
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项(２００９０３０４９￣０６)
通讯作者: 郑小波ꎬ教授ꎬ主要从事植物病原真菌分子生物学研究ꎻ Ｔｅｌ:０２５￣８４３９５３０２ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｘｂｚｈｅｎｇ＠ｎｊａｕ. ｅｄｕ. ｃｎꎮ
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研究简报
尖镰孢菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)的快速分子检测
王健生ꎬ 王佳妹ꎬ 李 潇ꎬ 董莎萌ꎬ 张正光ꎬ 郑小波∗
(南京农业大学植物保护学院 /农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室ꎬ 南京 ２１００９５)
Ｒａｐｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｂｙ ＰＣＲ 　 ＷＡＮＧ Ｊｉａｎ￣ｓｈｅｎｇꎬ ＷＡＮＧ
Ｊｉａ￣ｍｅｉꎬ ＬＩ Ｘｉａｏꎬ ＤＯＮＧ Ｓｕｏ￣ｍｅｎｇꎬ ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ￣ｇｕａｎｇꎬ ＺＨＥＮＧ Ｘｉａｏ￣ｂｏ　 (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ / Ｋｅｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｐｅｓｔ Ｉｎｓｅｃｔｓꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｓｔｅｒｏｌ １４α￣ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ (ＣＹＰ５１Ｃ) ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｅｎｕｓꎬ ｔｗｏ
ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓꎬ Ｃ１ / Ｃ２ ａｎｄ Ｃ３ / Ｃ４ ｗｅｒｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｂｙ
ＰＣＲ. Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ４５ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｒｉｍｅｒｓꎻ Ｃ１ / Ｃ２ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｏｎｌｙ ａｎ ｕｎｉｑｕｅ ６９９ ｂｐ ｂａｎｄ ｆｒｏｍ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ. Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｃ１ /
Ｃ２ ｗａｓ １００ ｎｇ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ａｎｄ １００￣ｍｉｃｒｏｃｏｎｉｄｉａ / ｇ ｓｏｉｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｏｉｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ. Ｉｎ ｃｏｎ￣
ｔｒａｓｔꎬ ｔｈｅ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ (Ｃ３ / Ｃ４ ａｎｄ Ｃ１ / Ｃ２) ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ １ ｐｇ ｆｏｒ
ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ａｎｄ １￣ｍｉｃｒｏｃｏｎｉｄｉａ / ｇ ｓｏｉｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｏｉｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ. Ａｎｄ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｃｏｕｌｄ ｂｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ Ｃ１ / Ｃ２ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ ＰＣＲꎻ ＣＹＰ５１Ｃ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０３￣０３１８￣０５
　 　 由尖镰孢菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ Ｓｃｈｌｅｃｈｔ. )
引起的大豆枯萎病是危害大豆生产的主要土传病
害[１]ꎮ 该菌在土壤和病残体上均可长期生存造成
危害ꎮ 快速准确地在发病初期植株和带病土壤中
进行鉴定和检测对防治该病害至关重要ꎮ
甾醇 １４α￣去甲基化酶基因 ( Ｓｔｅｒｏｌ １４α￣ｄｅ￣
ｍｅｔｈｙｌａｓｅꎬ ＣＹＰ５１Ｃ)序列在 Ｆｕｓａｒｉｕｍ 种内不同菌
株间高度保守ꎬ种间存在丰富变化ꎬ相比 ｒＤＮＡ￣
ＩＴＳ、β￣ｔｕｂｕｌｉｎ序列为更好的分子检测靶标[２]ꎮ 本
研究通过新的分子靶标序列 ＣＹＰ５１Ｃ 探索尖镰孢
菌(Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)的分子检测技术ꎬ以期为新靶标
在其他病原菌的检测应用提供参考ꎮ
１　 材料与方法
１. １　 供试菌株培养及基因组 ＤＮＡ提取
供试菌株见表 １ꎮ 供试菌株在液体完全培养
基中ꎬ２５℃ 振荡培养 ４ ｄꎬ过滤收集菌丝ꎬ采用
ＣＴＡＢ法[３]提取基因组 ＤＮＡꎮ
１. ２　 土壤中病原菌 ＤＮＡ的提取
将 ８ ×１０７ 个分生孢子与 １ ｇ 灭菌土混匀ꎮ 用
ＦａｓｔＤＮＡ􀅺 ＳＰＩＮ ＫＩＴ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ (ＭＰＢｉｏꎬ土壤基因组
ＤＮＡ提取试剂盒)提取土壤基因组 ＤＮＡꎬ将终产物
以 ８０ μＬ灭菌水溶解(相当于浓度为 １０６ 个孢子的
ＤＮＡ)ꎮ 未接种灭菌土壤 ＤＮＡ作为空白对照ꎮ
　
　 ３ 期 　 　 王健生ꎬ等:尖镰孢菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)的快速分子检测
Ｔａｂｌｅ １　 Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｇｉ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｈｏｓｔ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｎｏ. ｏｆ
ｉｓｏｌａｔｅ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒ Ｔ１ / Ｔ２
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｎｉｖｅｕｍ Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ ＋
Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｆｕ Ｊｉａｎ(Ｃｈｉｎａ) １ ＋
Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｕｂｅｎｓｅ Ｍｕｓａ ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ ＋
Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｌｙｃｏｅｒｓｉｃｉ Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ Ｆｕ Ｊｉａｎ(Ｃｈｉｎａ) １ ＋
Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｍｅｌｏｎｉｓ Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ Ｆｕ Ｊｉａｎ(Ｃｈｉｎａ) １ ＋
Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｍｏｍｄｉｃａｅ Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｆｕ Ｊｉａｎ(Ｃｈｉｎａ) １ ＋
Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ ＋
Ｆ. ｓｏｌａｎｉ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｆ. ｅｑｕｉｓｅｔｉ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｆ. ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｆ. ｍｏｎｉｆｏｒｍｅ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｆ. ｃｕｌｍｏｒｕｍ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｆ. ｎｉｖａｌｅ Ｔｒｉｔｉｃｕｍａ ｅｓｔｉｖｕｍ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｆ. ａｖｅｎａｃｅｕｍ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｆ. ｇｒａｍｉｎｅｒｕｍ Ｔｒｉｔｉｃｕｍａ ｅｓｔｉｖｕｍ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍｅｌｏｎｉｓ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｒｕｎｃａｔｕｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｌａｗｓｏｎｉａｎａ ＵＳＡ １ －
Ｐ. ｓｏｊａｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｐ. ｉｎｆｅｓｔａｎｓ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｊｉａｎｇ ｓｕ (Ｃｈｉｎａ) １ －
“ ＋ ”: ６９９ ｂｐ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒ Ｃ１ / Ｃ２ꎻ “ － ”: Ｎｏ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ.
１. ３　 发病植株组织 ＤＮＡ的提取
参考Ｗａｎｇ等[４]的 ＮａＯＨ法提取健康、发病植
株组织 ＤＮＡꎮ
１. ４　 引物设计及 ＰＣＲ扩增验证
特异性引物 Ｃ１ / Ｃ２ 的设计:对 ＧｅｎＢａｎｋ 中的
Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ和其他相关病原真菌的 ＣＹＰ５１Ｃ 序
列进行比较分析ꎬ设计了一对特异性引物 Ｃ１ / Ｃ２:
Ｃ１ (５′￣ＡＡＧＡＡＧＴＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＡＴＣＧＣＴ￣３′)和
Ｃ２(５′￣ＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＡＴＧＡＧＡＣＧＧＣ￣３′)ꎮ 设计
的引物重新在 ＧｅｎＢａｎｋ 中 ＢＬＡＳＴ 分析验证其特
异性ꎮ
巢式 ＰＣＲ外引物 Ｃ３ / Ｃ４ 的设计:根据尖镰孢
菌的 ＣＹＰ５１Ｃ序列ꎬ使此引物在特异性引物外侧ꎬ
设计一对外引物 Ｃ３ / Ｃ４:Ｃ３(５′￣ＧＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴ￣
ＣＡＧＡＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧ￣３′)和 Ｃ４(５′￣ＧＴＡＧＡＴＡＴ￣
ＧＧＧＣＴＧＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴＴ￣３′)ꎮ
常规 ＰＣＲ扩增体系:ＰＣＲ 反应混合液总体积
为 ２５ μＬ:２. ５ μＬ １０ × ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒꎬＭｇＣｌ２ ２ ｍｍｏｌ /
Ｌꎬ０. ５ μＬ ２. ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ｄＮＴＰꎬ引物 Ｃ１ / Ｃ２ (２０
μｍｏｌ / Ｌ)各 ０. ２５ μＬꎬ０. ２５ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 酶(５ Ｕ /
μＬ )ꎬ相应浓度的模板 ＤＮＡꎬ用灭菌水补足体积ꎮ
所有试剂均购于 ＴａＫａＲａ 公司ꎮ 在 ＴａＫａＲａ ＰＣＲ
扩增仪上进行扩增反应ꎬ反应程序为:９４℃预变性
５ ｍｉｎꎻ９４℃变性 ３０ ｓꎬ６５℃退火 ３０ ｓꎬ７２℃延伸 １
ｍｉｎꎬ共 ３５ 个循环ꎻ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ 取 ５ μＬ扩增
９１３
　
植物病理学报 ４３ 卷
产物于 １. ０％琼脂糖凝胶中电泳(电压 ５ Ｖ / ｃｍ)ꎬ
在凝胶成像系统上检测并拍照ꎮ
巢式 ＰＣＲ扩增体系:以 Ｃ３ / Ｃ４ 作为第一轮反
应引物ꎬ进行常规 ＰＣＲ扩增ꎮ 取 １ μＬ ＰＣＲ反应产
物为模板与引物 Ｃ１ / Ｃ２ 进行第二轮常规 ＰＣＲ 扩
增ꎮ 所有试剂均购于 ＴａＫａＲａ公司ꎮ 取 ５ μＬ 扩增
产物于 １. ０％琼脂糖凝胶中电泳(电压 ５ Ｖ / ｃｍ)ꎬ
在凝胶成像系统上检测并拍照ꎮ
荧光定量 ＰＣＲ 扩增体系:反应混合液总体积
为 ２０ μＬ:１０. ０ μＬ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ(２ × )ꎬ
０. ４ μＬ ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ＩＩ (５０ × )ꎬ引物(１０
μｍｏｌ / Ｌ)各 ０. ４ μＬꎬ模板 ２ μＬꎬ用灭菌水补足体
积ꎮ 优化后的反应程序为:９５℃预变性 ３０ ｓꎻ ９５℃
变性 ５ ｓꎬ６５℃退火 ３４ ｓꎬ４０ 个循环ꎻ９５℃ １５ ｓꎬ６０℃
１ ｍｉｎꎬ９５℃ １５ ｓꎬ６０℃ １５ ｓꎮ 荧光定量 ＰＣＲ仪器为
７５００ Ｒｅａｌ￣Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍꎮ
１. ５　 ＰＣＲ扩增灵敏度检测
将 Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ 基因组 ＤＮＡ 从 １００ ｎｇ / μＬ
依次 １０ 倍梯度稀释至 １００ ａｇ / μＬꎬ分别取 １ μＬ 为
模板进行常规 ＰＣＲ反应和巢式 ＰＣＲ反应ꎮ
１. ６　 土壤中病原菌的检测
将土壤中病原菌 ＤＮＡ 浓度从 １０６ 个孢子 / μＬ
依次 １０ 倍梯度稀释至 １ 个孢子 / μＬꎬ分别取 １ μＬ
为模板进行常规 ＰＣＲ反应和巢式 ＰＣＲ反应ꎮ
１. ７　 发病植株组织的快速检测
以健康和发病组织中病原菌基因组 ＤＮＡ 为
模板进行常规 ＰＣＲ反应ꎮ
２　 结果与分析
２. １　 引物特异性及灵敏度检测
用引物 Ｃ１ / Ｃ２ 对供试菌株进行常规 ＰＣＲ 扩
增ꎬ结果表明:只能从 Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ 菌株中特异性
地扩增出一条 ６９９ ｂｐ 左右的条带ꎬ而其他供试菌
株及空白对照均无扩增条带(图 １)ꎮ 表明该对引
物具有种的特异性ꎮ 引物 Ｃ１ / Ｃ２ 对 Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
基因组 ＤＮＡ的检测灵敏度为 １００ ｎｇ(图 ２￣ａ)ꎮ 而
利用巢式 ＰＣＲ 可稳定地检测到 １ ｐｇ 的基因组
ＤＮＡ(图 ２￣ｂ)ꎬ检测灵敏度提高了 １０５ 倍ꎮ
２. ２　 土壤中病原菌的检测
引物 Ｃ１ / Ｃ２ 对土壤中病菌孢子的检测灵敏度
为 １０２ 个孢子 /克土 (图 ２￣ｃ)ꎻ而在 ２５ μＬ 巢式
ＰＣＲ反应体系中可在 １ ｇ 土中检测到 １ 个分生孢
子(图 ２￣ｄ)ꎬ灵敏度提高了 １０２ 倍ꎮ
２. ３　 发病植株组织的快速检测
对发病组织中病原菌 ＤＮＡ 进行常规 ＰＣＲ 扩
增ꎬ发病样品均扩增出 ６９９ ｂｐ 的特异性条带(图
３)ꎬ而健康植株未扩增出该条带ꎮ 说明该套技术
能够用于植物病组织中尖镰孢菌的快速分子检测ꎮ
２.４　 基因组 ＤＮＡ实时定量 ＰＣＲ及标准曲线建立
用引物 Ｃ１ / Ｃ２ 对 Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ 基因组 ＤＮＡ
的 １０ 倍梯度稀释液进行 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ＰＣＲ扩增ꎮ
结果表明ꎬ该体系的检测下限为 １ ｐｇ / μＬ 基因组
ＤＮＡꎮ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ基因组 ＤＮＡ 的 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
Ⅰ ＰＣＲ标准曲线显示ꎬＤＮＡ量(ｐｇ)的对数(ｘ)和
Ｆｉｇ. １　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ￣ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｃ１ / Ｃ２
Ｌａｎｅ Ｍ: ２ ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅ １￣２３: Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｔｒａｉｎｓ ａｓ Ｔａｂｌｅ １ꎻ Ｌａｎｅ ２４: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
０２３
　
　 ３ 期 　 　 王健生ꎬ等:尖镰孢菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)的快速分子检测
Ｆｉｇ. ２　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ａｎｄ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
(ａ) ａｎｄ (ｂ): Ｌａｎｅ Ｍꎬ ２ ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅ １￣１０ꎬ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ １００ ｎｇꎬ １０ ｎｇꎬ １ ｎｇꎬ １００ ｐｇꎬ １０ ｐｇꎬ
１ ｐｇꎬ １００ ｆｇꎬ １０ ｆｇꎬ １ ｆｇ ａｎｄ １００ ａｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡꎻ Ｌａｎｅ１１ꎬ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ１２: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
(ｃ) ａｎｄ (ｄ): Ｌａｎｅ Ｍꎬ ２ ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅ １￣７ꎬ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｍｉｃｒｏｃｏｎｉｄｉａ ｗａｓ １０６ꎬ １０５ꎬ
１０４ꎬ １０３ꎬ １０２ꎬ １０ꎬ １ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｌａｎｅ ８ꎬ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ９ꎬ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
Ｆｉｇ. ３　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｃ１ / Ｃ２
Ｌａｎｅ Ｍ: ２ ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ２￣４: Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ
ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ.
对应的 Ｃｔ值(ｙ)之间呈线性关系:
Ｙ ＝ －３. ５８ｘ ＋３１. ６５ Ｒ２ ＝０. ９７(图 ４)ꎮ
３　 讨论
本研究分析比较了 Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ 与其他病原
真菌的 ＣＹＰ５１Ｃ 序列ꎬ设计出对 Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ 基
因组 ＤＮＡ具有高度特异性的引物ꎬ结合 ＰＣＲ 技
术ꎬ建立了一套快速、高灵敏度、稳定可靠的检测尖
镰孢菌的分子检测体系ꎮ 该检测体系可以在病害
侵染初期鉴定出病原物ꎬ为枯萎病的防治提供参
考ꎮ 更重要的是ꎬ基于新的靶序列 ＣＹＰ５１Ｃ 建立
的检测体系为其他病原菌检测新靶标的应用提供
了技术指导和理论依据ꎬ也为病原菌的分子检测研
究奠定了方法基础ꎮ
该检测体系对 Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ 基因组 ＤＮＡ 检
测灵敏度为 １００ ｎｇ(图 ２￣ａ)ꎬ相比其他病原菌的分
子检测灵敏度水平较低ꎬ但通过巢式 ＰＣＲ 可将检
测灵敏度至少提高 １０５ 倍ꎬ灵敏度达到 １ ｐｇ
(图 ２￣ｂ)ꎬ可以满足实际需求ꎮ 引物亦能从土壤中
直接检测到枯萎病病菌的分生孢子ꎬ灵敏度达到
１ ｇ土中检测到 １００ 个分生孢子(图 ２￣ｃ)ꎬ通过巢
式 ＰＣＲ灵敏度达到１ ｇ土中检测到１个分生孢子
１２３
　
植物病理学报 ４３ 卷
Ｆｉｇ. ４ 　 Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｌｏｇ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ａｎｄ ｃｙｃｌｅ
ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ( Ｃｔ ) ｆｒｏｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ａｓｓａｙ
(图 ２￣ｄ)ꎮ 但条带的亮度与模板分生孢子的数目
并不成线性关系ꎬ可能是提取的土壤中病原菌
ＤＮＡ含有 ＰＣＲ抑制物ꎮ
另外ꎬ本试验还对实时定量检测体系进行了摸
索ꎬ可以对土壤和发病植物中病原菌精确定量ꎬ这
对尖镰孢菌引起枯萎病的实时监测和制定防治策
略具有指导意义ꎮ
参考文献
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责任编辑:于金枝
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