全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
!"#$(")(!1
&修改稿收到日期$
!"#$("&(#)
基金项目$国家公益性行业专项资助项目"
!"##"$#",
#
作者简介$张明慧"
#&1&
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物分子生物学研究
2(34.5
$
6740
8
(
371&
!
#,%+9:3
"
通信作者$宋玉霞!硕士!研究员!硕士生导师!主要从事植物生物技术育种研究
2(34.5
$
;:0
8<
=,,,
!
#,%+9:3
冬枣
$
宁梨巨枣的子代
%&(
鉴定
及遗传多样性分析
张明慧#!!宋玉霞#"!赵世华%!丁
!
婕%!张国庆%!张
!
勤$!刘廷俊%
"
#
宁夏农业生物技术重点实验室!银川
*)"""!
&
!
宁夏大学 生命科学学院!银川
*)""!#
&
%
宁夏葡萄花卉产业发展局!银川
*)"""!
&
$
银川市林技中心!银川
*)"""!
#
摘
!
要$应用
;>?@
分子标记方法对冬枣
A
宁梨巨枣的子代进行了分子鉴定及遗传多样性分析采用构建基因池
的方法对
;>?@
分子标记引物进行筛选!从
11
对引物中筛选出
#)
对多态性好)主带清晰的引物!并对子代进行了
真实性鉴定及多态性分析结果表明$"
#
#
)
对引物共产生
&)
个多态性条带!平均每对引物产生
,+%
个多态性条
带!显示了较高的多态性比率"
!
#
1"
个子代中
$$
个具有父本特征带!鉴定为真杂种子代遗传多样性及
B@C(
D?
聚类分析表明!子代个体与亲本间的遗传相似系数在
"+))
"
"+&1
之间!个体差异明显该研究结果为枣树杂
交育种提供了重要的分子证据
关键词$枣&杂交&
;>?@
标记&子代鉴定&遗传多样性分析
中图分类号$
E*1&
文献标志码$
?
)!*+,#-#./,#"+/+!0*+*,#.1#2*34#,
5
+/6
5
4#4"-7
5
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9
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5
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1-2-
3
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7
5
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<
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(
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(
&)*
D.5+7
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ZU.S.0S.\.SI45/40SV7O.U
]
4UO0V455.0O/T:USOVO9V.0
8
VUIO:UT45/O7
<
ZU.S/40SV7O.U
8
O0OV.9\4U.4(
V.:0+W.TVOO0
]
4.U/:T
]
U.3OU/V74V
8
O0OU4VOS95O4U
!
UO
]
U:SI9.Z5O40S
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7.9Z40S/ O^UO/O5O9VOSTU:3
11
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4.U/:T;>?@
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U.3OU/Z
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9:0/VUI9V.0
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4
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::5+R7OUO/I5V//7:^ OSV74V
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#
#
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4.U/40SV7O4\OU4
8
O
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OU
]
U.3OU
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4.U
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$$VUIO7
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ZU.S/ O^UO.SO0V.T.OS43:0
8
1"7
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ZU.S/ .^V7
]
4VOU045974U(
49VOU./V.9/+L.\OU/.V
<
40SB@CD?95I/VOU4045
<
/.//7:^ OS/.
8
0.T.940V
8
O0OV.9\4U.4V.:0:T7
<
ZU.S/+R7O
8
O(
0OV.9/.3.54U.V
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9:OTT.9.O0V/ZOV^OO0.0S.\.SI4540S
]
4UO0V454UOTU:3"+))V:"+&1+R7OUO/I5V/
]
U:\.SOS40
.3
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:UV40V3:5O9I54US4V4T:U9U://ZUOOS.0
8
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5
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(
&)*D.5+
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9U://(ZUOOS.0
8
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7
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ZU.S/.SO0V.T.94V.:0
&
8
O0OV.9S.\OU/.V
<
!!
枣"
!"#"
$
%&
(
&
(
&)* D.5+
#为鼠李科"
>743(
049O4O
#枣属"
!"#"
$
%&D.5+
#植物*#+!含有丰富的
营养物质和多种微量元素!观赏和药用价值俱佳*!+
枣树育种中迫切需要将不同品种的优良性状整合起
来!培育综合性状优良的新品种*%+近年来!全国各
个枣树研究单位相继展开枣树杂交育种相关工作
但枣树花小!人工去雄易伤害花器官!花量大而坐果
率低!存在胚败育现象*%+!且人工去雄不彻底!易使
杂交子代混有自交种!因此!对其杂交子代身份真实
性进行准确鉴定相当必要常规用于杂交子代身份
真实性鉴定的方法有形态学和细胞学等方法枣树
生长周期长!利用常规的形态学及细胞学鉴定耗时
低效!观测结果人为误差大!且形态特征容易受环境
条件影响!难以真实)准确地反映其子代的遗传变异
等问题都制约着枣树杂交育种的发展
随着分子生物学的发展!大量分子标记技术应
用于核果类经济植物的亲缘关系鉴定及遗传多样性
分析等应用中相关序列扩增多态性"
/O
P
IO09O(UO(
54VOS ?3
]
5.T.OS@:5
<
3:U
]
7./3
!
;>?@
#
*
$
+
!是
Q.
等*$+于
!""#
年开发的一种基于
@[>
的新型分子标
记技术
;>?@
技术具有简便稳定)产率高)便于克
隆目标片段且较少的正)反向引物即可组成较多的
引物组合等特点*)+!使其在多种植物分子生物学研
究中得到广泛应用在枣树植物的研究中!随机扩
增多 态 性
LH?
"
U40S:3 43
]
5.T.OS
]
:5
<
3:U
]
7.9
LH?
!
>?@L
#
*
,
+
)
LH?
简单序列重复"
/.3
]
5O/O(
P
IO09OUO
]
O4V/
!
;;>
#
*+
)扩增片段长度多态性"
43(
]
5.T.OSTU4
8
3O0V5O0
8
V7
]
:5
<
3:U
]
7./3
!
?WQ@
#
*
1
+
)
;>?@
*
&
+
)简单序列重复区间扩增"
.0VOU(/.3
]
5O/O(
P
IO09OUO
]
O4V
!
M;;>
#
*
#"(##
+等标记在亲缘关系鉴定及
遗传多样性分析等应用中均有报道快速鉴定出真
杂种是枣树育种工作的一个重要环节!但在其杂交
子代鉴定中仅有
;;>
*+
)
?WQ@
*
1
+标记的报道!未见
;>?@
相关报道
本研究在已有工作的基础上*#!+!应用
;>?@
分
子标记对
1"
个冬枣"
!"#"
$
%&
(
&
(
&)* D.5+9\+
L:0
8
64:
!
#
#
A
宁梨巨枣"
!"#"
$
%&
(
&
(
&)* D.5+
9\+H.0
8
5.
-
I64:
!
$
#子代实生苗进行分子鉴定及遗
传多样性分析!并对子代群体的遗传关系进行聚类
分析研究结果将为后续杂交育种工作和分子标记
辅助育种提供重要的分子数据
#
!
材料和方法
D+D
!
材
!
料
采摘冬枣)宁梨巨枣及子代的幼叶用于
LH?
提取!幼叶于
!"#!
年
,
月取自宁夏贺兰暖泉农场枣
树杂交新品种培育"快繁#及配套栽培技术课题资源
圃!共
1!
份植物基因组
LH?
提取试剂盒购自
RM?HC2H
公司"
RM?HC2H
!
L@%")
#
;>?@
引物参
考
Q.
等*$+文献!由上海捷瑞生物工程有限公司合成
"引物序列见表
#
#
@[>
扩增所用
C:+*
,
#
CUOO0
D4/VOUD.=
购自
@U:3O
8
4
公司"
@U:3O
8
4
!
D*#!!
#
D+E
!
方
!
法
D!
基因组
1>
的提取和检测
!
使用植物基因
组
LH?
提取试剂盒对幼叶材料基因组
LH?
进行
提取!通过
#`
琼脂糖凝胶电泳检测基因组
LH?
的
完整性和纯度!使用超微量分光光度计"
R7OU3:
;9.O0V.T.9H40:LU:
]
!"""
#检测样品
LH?
浓度!并
将样品浓度统一稀释至
%"0
8
%
$
Q
!于
!"a
保存
备用
表
D
!
%&(
引物序列
R4Z5O#
!
@U.3OU/O
P
IO09O/I/OS.0;>?@4045
<
/./
正向引物
W:U^4US
]
U.3OU
名称
H43O
序列
;O
P
IO09O
反向引物
>O\OU/O
]
U.3OU
名称
H43O
序列
;O
P
IO09O
DO# )b(RC?CR[[???[[CC?R?(%b 23# )b(C?[RC[CR?[C??RR??R(%b
DO! )b(RC?CR[[???[[CC?C[(%b 23! )b(C?[RC[CR?[C??RRRC[(%b
DO% )b(RC?CR[[???[[CC??R(%b 23% )b(C?[RC[CR?[C??RRC?[(%b
DO$ )b(RC?CR[[???[[CC?[[(%b 23$ )b(C?[RC[CR?[C??RRRC?(%b
DO) )b(RC?CR[[???[[CC??C(%b 23) )b(C?[RC[CR?[C??RR??[(%b
DO, )b(RC?CR[[???[[CCR??(%b 23, )b(C?[RC[CR?[C??RRC[?(%b
DO* )b(RC?CR[[???[[CCR[[(%b 23* )b(C?[RC[CR?[C??RR[??(%b
DO1 )b(RC?CR[[???[[CCRC[(%b 231 )b(C?[RC[CR?[C??RR[RC(%b
23& )b(C?[RC[CR?[C??RR[C?(%b
23#" )b(C?[RC[CR?[C??RR[?C(%b
23## )b(C?[RC[CR?[C??RR[[?(%b
)&#!
##
期
!!!!!!!!!!!
张明慧!等$冬枣
A
宁梨巨枣的子代
;>?@
鉴定及遗传多样性分析
D!
%&(
扩增
!
;>?@
扩增反应体系
!)
$
Q
!
包括模板
LH?%
$
Q
!
C:+*
,
#
CUOO0D4/VOUD.=
#!+)
$
Q
!
"+)
$
3:5
%
Q
正反向引物各
#
$
Q
!
SSG
!
J
*+)
$
Q

;>?@
反应体系采用复性变温法*#%+!反应程序
为
&$a
预变性
)3.0
&
$a
变性
$)/
!
%%a
退火
$)
/
!
*!a
延伸
1"/
!
)
个循环&
$a
变性
$)/
!
)$a
退
火
$)
!
*!a
延伸
$)/
!
%)
个循环&循环结束后
*!a
延伸
#"3.0
!
$ a
保存
@[>
扩增在
XMJ(>?L
R#""
扩增仪上进行扩增结束后!产物经
EM?=9O5
?S\409OS
毛细管电泳系统检测
D!
%&(
引物的筛选
!
以
1
条正向引物与
##
条反向引物组成的
11
对
;>?@
引物组合进行引物
初筛随机选取
#"
个子代样本
LH?
各
#"
$
Q
混
合!构建基因池!利用混合
LH?
与父母本
LH?
进
行
@[>
扩增从
11
对
;>?@
引物中筛选条带清
晰)多态性丰富和稳定性好的引物组合!每对引物重
复
%
次&在此基础上!筛选出主带清晰)重复性好的
引物对杂交子代身份的真实性进行分子鉴定
D+E+G
!
子代真实性鉴定
!
用筛选出的多态性高)且
具有父本特征条带的引物组合对供检的
1"
个子代
进行杂交子代身份真实性鉴定参照相关文献*
#$(
#1
+的判定标准!子代
@[>
产物中具有父本特征带
的即为真杂种!不具有父本特征带的不能确定其为
假杂种或自交种!需进一步分析
D!
子代
%&(
多态性分析
!
将
;>?@
扩增产
物的每条带视为一个统计位点!按条带有或无分别
赋值!有带记为,
#
-!无带记为,
"
-!统计总条带数)多
态性条带数利用
HR;K;!
]
9
"
cOU/.:0!+#
#软件
处理分析
;>?@
数据!采用
B@CD?
聚类分析并计
算样本之间的遗传相似系数!并据此构建聚类树
!
!
结果与分析
E!
%&(
引物筛选结果
通过构建基因池的方法!本研究从
11
对引物中
筛选出
#)
对"表
!
#扩增条带清晰)多态性条带丰富
且稳定的检测引物"图
#
#!用于对
1"
个子代进行鉴
定
#)
对引物共产生
&)
个多态性条带"表
!
#!平均
每对引物产生
,+%
个多态性条带!多态性比例为
))+),`
!扩增的
LH?
片段大约集中在
)"
"
#)""
Z
]
!显示了较高的多态性比率
E+E
!
子代真实性鉴定分析
根据亲本及子代电泳谱带特征!将子代分为如
下
!
类*#$(#)!#*+$"
#
#子代具有父本特征带的为真杂
种"
!
#子代不具有父本特征带!不能确定其为自交
种还是杂交种!需进一步分析
利用筛选出的
#)
对具父本特征带的引物对
1"
个杂交子代进行鉴定统计电泳结果发现!
)
号引
物检测出
!$
个具有父本特征带的子代"图
!
!
?
#&
,
号引物鉴定出
!!
个真杂种"图
!
!
X
#&
%,
号引物鉴
定出
%)
个真杂种综合统计所有能扩增出父本特
征带的子代!结果表明$
1"
个子代中有
$$
个子代被
初步判定为真杂种子代基本表现为
%
种扩增带
型$母本型"
!#+!)`
#)综合型"
))`
#和其它型
"
!%+*)`
#
E!
子代
%&(
多态性分析
聚类分析显示"图
%
#!大部分材料之间的遗传
相似系数在
"+))
"
"+&1
之间在遗传相似系数为
"+)&$
水平上可以将所有材料分为两大类&在遗传
相似系数为
"+,#,
时!
1!
份材料可分为
)
大类!其
中第
%
类)第
&
与第

类各自只包含
#
个品种!分别
是$父本宁梨巨枣)
$),
与
),#
&第
(
类品种最多!包
含
)1
个材料!其中包括母本冬枣与其他
)*
个子代&
第
)
类包括
!#
个子代此外!不同类间的子代具有
较高的遗传多样性&单独分为一类的材料与其他的
材料具有较大差异!而在同一类间的材料遗传距离
较近杂交子代中部分材料变异丰富!枣实生后代
可能表现出较大的个体差异!为品种选育提供了更
多参考
表
E
!
DH
对
%&(
引物的多态性
R4Z5O!
!
CO0OV.9S.\OU/.V
<
.^V7#)
]
4.U/:T;>?@
]
U.3OU/
引物
@U.3OU
扩增总条带数
R:V45H:+
:TZ40S/
多态性条带数
H:+:T
]
:5
<
3:U
]
7.9
Z40S/
多态性比率
@OU9O0V4
8
O:T
]
:5
<
3:U
]
7.9
Z40S/
%
`
DO%d23# ## , )$+))
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DO!d23## ## ) $)+$)
总和
R:V45 #*# &)
平均
?\OU4
8
O & ) ))+),
,&#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
#
!
部分引物组合筛选的扩增结果
4
)
Z
)
9
)
S
)
O
)
T
)
8
)
7
分别代表引物组合
DO%d23#
)
DO)d23#
)
DO,d23#
)
DO$d23)
)
DO*d23%
)
DO*d23$
)
DO!d23##
)
DO)d23%
&每
%
列为一组!从左到右分别是父本)母本和混合样本
D+D4U_OU
W.
8
+#
!
?3
]
5.T.OSUO/I5V/I/.0
8
/:3O
]
U.3OU9:3Z.04V.:0/
4
!
Z
!
9
!
S
!
O
!
T
!
8
!
7UO
]
UO/O0VV7O
]
U.3OU
]
4.U
$
DO%d23#
!
DO)d23#
!
DO,d23#
!
DO$d23)
!
DO*d23%
!
DO*d23$
!
DO!d23##
!
DO)d23%
&
2\OU
<
%5.0O/4/4
8
U:I
]
!
TU:35OTVV:U.
8
7V4UO345O
!
TO345O40S3.=OS/43
]
5O/
&
D+D4U_OU
图
!
!
引物组合
DO)d23#
"
?
#和
DO,d23#
"
X
#鉴定部分真杂种的电泳结果
箭头所指为父本的特征带&
#+
父本&
!+
母本&
%
"
!%+
鉴定的真杂种
?
泳道
%
"
!%
分别为
"%%
)
"$"
)
",#
)
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"1"
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分子标记技术对植物杂种鉴定具有非常重要
的作用
目前!用于植物杂交子代鉴定的方法主要有形
态学)细胞学)同工酶及分子标记等*#$+传统的枣
树杂交种鉴定多采用枝干性状)叶片性状)果实横纵
径及鲜重)针刺性状等形态标记!具有父本性状的植
株可作为杂交成功的依据*#&+但形态特征容易受
环境条件的影响!不能真实)准确地反映其子代的遗
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##
期
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张明慧!等$冬枣
A
宁梨巨枣的子代
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鉴定及遗传多样性分析
传变异&细胞学观测结果人为误差较大&而同工酶的
试验结果会随植物不同发育时期)器官及环境而变
化*#$+枣树杂交育种周期较长!要想快速)高效地
对其杂交子代身份真实性进行鉴定!还必须从分子
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杂交子代个体的
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分子水平上进行品种鉴
定和分类!准确度高)效率高且信息量大*#"+应用
分子标记技术进行间接选择!将大大缩短枣树育种
年限
;>?@
分子标记技术具有简便)成本低)稳
定)共显性等优点!已应用到多种植物*#$(#1!"(!%+的杂
种鉴定研究在杂种的鉴定过程中发现!有的子代
在
#
对引物扩增结果中不具有父本特征带!而在另
#
对引物中却具有父本特征带用多对引物组合进
行杂种鉴定可以有效弥补单一引物鉴定结果不准确
的误差季杨等*#*+用
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对
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引物组合对
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等*#$+通过
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对
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引物对
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代进行鉴定且子代不具有父本特征带的!无论其
电泳条带与母本有无差异!都不能确定其为自交种
还是杂交种!需进一步分析因为不能排除经过杂
交后父系标记位点发生沉默的可能性苏亚蕊
等*!$+为检测小麦
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易位系
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位点的稳定
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的
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带!但有
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的品种部分标记位点出现特异性带
的丢失或添加!具有不同程度的位点变异!位点变异
率最高达
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本实验子代产生许多新变异类
型!可以看出可能存在这种假设本实验采用
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A
宁梨巨枣的杂交子代进行
鉴定!多对引物结果相互补充!检出率高!结果更可
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!
分子标记技术是枣树杂交种群体遗传多样性
分析的重要手段
本研究通过对
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对
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引物的筛选!最终
得到了
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对条带清晰)多态性丰富)稳定性好的引
物组合!可用于枣树杂交种分子鉴定和后续分子标
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材料本身的遗传多样性不高有关此外!与其它实
验采用电泳琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶检测相比!本
实验采用毛细管电泳系统对扩增产物进行更为精确
的判别分析!扩增产物检测方法的差异也可能是导
致数据统计准确度的重要原因
李继东等*##+利用
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分子标记!对河南主栽
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类本实验在遗传相似
性系数
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水平上可以将所有材料分为两大类!
说明检测材料间具有一定的遗传距离系统进化树
结果显示!超过半数的杂交子代与父本的遗传相似
性系数大于
"+**"
遗传相似性系数越大!表明其
与父本的亲缘关系越近!其获得父本优良性状的可
能性越大此外!杂交子代中部分材料表现出较大
的利用潜力!可进行有目的选育利用且杂交子代
间遗传相似系数变幅相对较大!说明杂交子代分化
较大!在后期品种选育中可能具有更多的表现型!为
选育优良品种提供了更多参考
本研究利用
;>?@
分子标记技术对
1"
份枣树
杂交子代进行鉴定!获得
$*
份真杂种!检出率较高
遗传多样性研究表明!本次杂交获得真杂种与父本
的亲缘关系很近!且子代变异丰富!表现出较大的利
用潜力研究结果为枣树杂交育种提供了重要的分
子数据
参考文献!
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中国枣树学概论*
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