全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(2): 154-163(2012)
收稿日期: 2011-01-08; 修回日期: 2011-11-29
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30971887; 30600399); 广东省自然科学基金资助项目(10151064201000008; 07006683)
通讯作者: 李云锋,博士,副教授,主要从事植物与病原物相互作用及植物蛋白质组学方向研究; Tel: 020-85281469, E-mail: yunfengli@
scau. edu. cn
第一作者: 张智慧(1985 - ),女,山东泰安人,硕士研究生,主要研究方向为植物与病原物相互作用。
外源茉莉酸甲酯诱导的水稻叶片蛋白质差异表达分析
张智慧1,2, 聂燕芳3, 何 磊1,2, 高元媛1,2, 李云锋1,2*, 王振中1,2
( 1 华南农业大学植物病理生理学研究室, 广州 510642; 2教育部生物防治工程研究中心, 广州 510642;
3华南农业大学制药工程系, 广州 510642)
摘要:以抗稻瘟病水稻近等基因系 C101LAC及 CO39 为材料,应用差异蛋白组学技术对外源茉莉酸甲酯(MeJA)诱导 8 h
和 12 h后的水稻叶片蛋白质差异表达变化进行了分析。 采用 PEG-4000 预沉淀法提取水稻叶片总蛋白,经双向电泳、凝胶
染色和图像分析,结果表明:与对照相比 MeJA处理后的 2 个水稻品系中共有 21 个蛋白质表现为 2 倍以上的表达差异。 其
中,MeJA处理 8 h后,CO39 中的差异表达蛋白质点有 5 个,C101LAC中有 8 个,U5 为 2 个品系中均新增的蛋白质点。 Me-
JA处理 12 h后,CO39 中有 6 个差异表达蛋白质点,C101LAC中则有 5 个。 经胶内酶解、MALDI-TOF / TOF质谱分析及数
据库检索,成功对 21 个差异表达蛋白质进行了鉴定,其中新增的蛋白质点 U5 被鉴定为内切 β-1,3-1,4-葡聚糖酶。 依据
GO数据库和 UniProtKB数据库提供的蛋白质注释信息,按照功能可将 21 个差异表达蛋白质分为 8 类,分别在植物抗性、
氨基酸代谢、信号转导、光合作用、光呼吸、糖代谢、蛋白质合成与分解及细胞代谢等方面发挥作用。
关键词:水稻; 茉莉酸甲酯; 蛋白组学
Proteomic analysis of differentially expressed proteins induced by methyl jas-
monate in rice leaves 　 ZHANG Zhi-hui1,2, NIE Yang-fang3, HE Lei1,2, GAO Yuan-yuan1,2, LI
Yun-feng1,2,WANG Zhen-zhong1,2 　 ( 1Laboratory of Physiological Plant Pathology, South China Agricultural University,
Guangzhou 510642, China; 2Engineering Research Center of Biological Control, Ministry of Education, Guangzhou 510642,
China; 3Dept. of Pharmaceutical Engineering, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)
Abstract: Proteomic approaches using two-dimensional electrophoresis (2-DE) were conducted to identify
the differentially expressed proteins in rice leaves in response to methyl jasmonate (MeJA) . Proteins were ex-
tracted from rice leaves at 8 h and 12 h after treatment with 0. 1 mmol / L MeJA and then fractionated using
PEG 4000-mediated prefractionation technique before separation by 2-DE. In total, twenty-one proteins re-
solved in the 2-DE gels were up-regulated or down-regulated in the inoculated rice leaves compared with the
controls. At 8 h after treatment with MeJA, 5 and 8 differentially expressed proteins in CO39 and C101LAC
were identified, respectively. Among them, U5 protein spot was specifically induced in both two rice
cultivars. At 12 h, changes of 6 proteins and 5 proteins were detected in CO39 and in C101LAC, respective-
ly. These differentially displayed proteins were successfully identified by in-gel digestion, MALDI-TOF / TOF
analysis and database searching. The protein spot U5 was identified as endo-1, 3-1, 4-beta-D-glucanase.
According to protein annotations from GO database and UniProtKB database, the 21 MeJA-responsive proteins
were classified into eight categories based on their putative function reported: 1) plant defense response, 2)
amino-acid biosynthesis, 3) signal transduction, 4) photosynthesis, 5) photorespiratory, 6) carbohydrate
metabolism, 7) protein biosynthesis and proteolysis and 8) metabolic process.
　
　 2 期 　 　 张智慧,等:外源茉莉酸甲酯诱导的水稻叶片蛋白质差异表达分析
Key words: rice; methyl jasmonate; proteomics
中图分类号: S435. 111. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)02-0154-10
　 　 茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)作为一
种外源信号分子,已被证实可以广泛诱导植物的抗
病反应[1 ~ 3]。 MeJA由于不被离子化,易透过细胞
膜,外源施用时活性较强,因而是茉莉酸类物质使
用的首选形式。 目前研究表明其主要通过诱导植
物防卫基因的表达及相关防御酶活性的增强等,来
提高植物对病原菌的抗性[4 ~ 6]。 但是,迄今为止人
们对其诱导的植物抗性分子机理的认识仍不全面,
许多参与抗性反应相关途径的蛋白质仍有待发掘。
蛋白质组学作为生理和遗传学研究的一种有
效方法,可通过高通量和高分辨率的蛋白质鉴定技
术研究在特定条件下的植物蛋白质表达谱,因而在
外源信号分子诱导的植物抗病性机理研究方面日
益引起众多研究者的关注。 Rakwal 等[7, 8]用蛋白
质组学方法先后对外源茉莉酸(JA)诱导水稻叶片
和茎的蛋白质差异表达进行了分析,结果表明 0. 1
mmol / L 的 JA 处理后,2 个组织中的核酮糖-1,5-
二磷酸羧化酶 /加氧酶(RuBisCO)各亚基表达量明
显降低,并发现叶片中新增了病程相关蛋白 PR-5
和 β-1,3-葡聚糖酶前体蛋白,茎中新增了一个 17
kD的病程相关蛋白(PR-1),并认为外源 JA 诱导
的植物自我防御机制相关基因在茎、叶组织中的表
达具有特异性。 Mahmood 等[9]用 0. 1 mmol / L 的
JA处理水稻 48 h后,通过差异蛋白质组学方法发
现有 12 个蛋白质表达量上调,2 个蛋白质表达量
下调,并认为 PR-5 和噻菌灵诱导蛋白的表达量上
调是 JA诱导水稻抗性的重要原因。
对外源 MeJA诱导的水稻抗瘟性研究发现,其
可以提高水稻叶片病程相关蛋白及相关防御酶的
活性,显著减轻稻瘟病的发生,提高水稻幼苗的抗
瘟性[10]。 本研究利用差异蛋白质组学技术,对外
源 MeJA诱导早期的水稻叶片蛋白质的差异表达
变化进行了研究,并结合质谱技术和生物信息学技
术对这些蛋白进行了鉴定和功能分析,以期从蛋白
质整体水平进一步挖掘 MeJA 诱导水稻抗性反应
相关的蛋白质,为更全面了解其诱导的水稻抗性机
制提供参考。
1　 材料与方法
1. 1　 供试材料
抗稻瘟病近等基因系水稻品系 C101LAC(含
Pi-1 抗稻瘟病基因)及背景品系 CO39(不含已知
抗病基因,感病对照)为本实验室保存。 水稻播种
在盛有稻田土的塑料盆中,在 24 ~ 26℃、14 h 光照
(约 250 μmol·m -2·s -1)的生长室中生长。 按常
规方法管理,于第 4 片叶完全展开时进行处理。
1. 2　 主要试剂与设备
18 cm pH 4-7 线性 IPG预制胶条、IPG缓冲液
(pH4-7)、硫脲、低分子量标准蛋白质、尿素购自
Amersham Pharmacia Biotech公司;茉莉酸甲酯、聚
乙二醇(PEG-4000)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、
三氯乙酸(TCA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨
酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、蛋白酶抑制剂(cock-
tail)购自 Sigma 公司;30%聚丙烯酰胺凝胶储液、
低熔点琼脂糖封胶液购自 Bio-Rad 公司;苯甲基磺
酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺购自
Promega 公司;其余均为国产分析纯试剂。 IPG-
phorⅢ电泳单元、灌胶模具、垂直电泳单元购自
Amersham Pharmacia Biotech公司。
1. 3　 水稻叶片的处理与取样
参考 Zhang 等[10]方法,用 0. 1 mmol / L MeJA
溶液( pH 6. 7,含 0. 05% Tween 20)喷雾接种水
稻,直至全部叶片湿润为止;以含 0. 05% Tween 20
的灭菌双蒸水为对照。 分别于接种后 8 h 和 12 h
取第 4 片叶。 每处理设重复 3 次。
1. 4　 水稻叶片总蛋白提取
水稻叶片总蛋白的提取参考 Kim 等[11] 的
PEG-4000 预沉淀法,并稍作修改。 称取 1 g 水稻
叶片,加入预冷的 5 mL Mg / NP-40 溶液(含 0. 5
mol / L Tris-HCI pH 8. 8、2% NP-40、1% PVPP、20
mmol / L MgCl2、2% β-巯基乙醇、1 mmol / L PMSF
和 5 μL cocktail),充分研磨成匀浆,于 4℃ 下
551
　
植物病理学报 42 卷
13 000 × g 离心 20 min;在上清液中加入 PEG-
4000,使其终浓度为 15% ;冰上孵育 30 min 后,
13 000 × g离心 20 min,取上清;加入 4 倍体积预冷
的 10% TCA /丙酮, - 20 ℃沉淀 3 h;8 500 × g 离
心 15 min,取沉淀;用 3 倍体积预冷的 90%丙酮重
新悬浮, - 20℃沉淀 30 min; 10 000 × g 离心 15
min,弃上清;将蛋白质沉淀风干后,加入增溶缓冲
液(含 7 mol / L Urea、2 mol / L硫脲、2% NP-40、1%
IPG buffer、80 mmol / L DTT),于 4 ℃下 20 000 × g
离心 5 min,取上清, -70 ℃保存。
1. 5　 蛋白质定量
蛋白质定量参考 Lowry 等[12]的方法进行,标
准蛋白质溶液配制中加入等体积的样品增溶缓冲
液,以消除样品中增溶缓冲液物质的干扰。
1. 6　 双向电泳
取水稻叶片蛋白质样品(550 μg)于增溶缓冲
液(含 0. 002%溴酚蓝)中水化 16 h,进行第一向固
相梯度等电聚焦电泳( Isoelectric focusing,IEF),按
照 Amersham Pharmacia Biotech 公司产品说明书
操作。 IEF 聚焦参数为:300 V 慢速升压 0. 5 h;
500 V慢速升压 0. 5 h;1 000 V 慢速升压 0. 5 h;
5 000 V快速升压 1. 5 h; 8 000 V 快速升压聚焦
60 000 Vh,水化和聚焦温度均为 20℃。 等电聚焦
结束后取出胶条,在平衡液Ⅰ(含 50 mmol / L Tris-
HCl pH 8. 8,6 mol / L 尿素,30%甘油,2% SDS,
2% DTT)中振荡平衡 15 min,再于平衡液Ⅱ(含
50 mmol / L Tris-HCl pH 8. 8,6 mol / L尿素,30%甘
油,2% SDS,2. 5%碘乙酰胺)中平衡 15 min。 第
二向 SDS-PAGE 浓度为 12% ,电泳参数为 16
mA / gel。
1. 7　 凝胶染色
凝胶染色参照 Neuhoff等[13]的胶体考染法。
1. 8　 图像扫描与分析
用 UMAX 2100XL 光密度扫描仪扫描凝胶,
并用 PDQuest 8. 0 图像分析软件(Bio-Rad 公司)
对 2-DE 图谱进行分析,为了消除因蛋白质上样和
染色等导致的分析误差,按照软件说明对所有分析
凝胶进行了标准化 ( normalization)的内部校准。
以不同处理间相同蛋白质点的丰度变化为 2 倍或
以上时,认为具有显著性差异,标记为差异表达蛋
白质。 试验以 3 次分别提取的蛋白质样品作为
重复。
1. 9　 质谱(MALDI-TOF / TOF)分析
从凝胶上切取差异蛋白质点,用胰蛋白酶进行
胶内酶解,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质
谱(MALDI TOF / TOF,质谱仪器型号:ABI 4800
Proteomics Analyzer,Applied Biosystems, USA)对
蛋白质进行鉴定。 数据库检索软件为 GPS Explor-
er(version 3. 6,Applied Biosystems) 和 MASCOT
(version 2. 1,Matrix Science),检索数据库为 Uni-
protKB和 SwissProt数据库。
1. 10　 生物信息学分析
依据 GO ( gene ontology ) 数据库 ( http: / /
www. geneontology. org / ) 和 UniProtKB 数据库
(http: / / www. uniprot. org / )提供的蛋白质注释
信息,对蛋白质进行功能分类。
2　 结果与分析
2. 1 　 MeJA 接种后水稻叶片总蛋白双向电泳
图谱的获得
用 PEG-4000 预沉淀法提取水稻叶片总蛋白,
经 IEF / SDS-PAGE、胶体考染和图像扫描,获得了
MeJA接种 8 h 和 12 h 后的水稻叶片双向电泳图
谱。 用 PDQuest 8. 0 软件对其进行分析,并结合人
工识别去除杂点,结果表明在 pH4-7 的 2-DE 图谱
上,平均可识别 789 ± 11 个蛋白质点,图谱蛋白质
点的匹配率达 90%以上,具有良好的重复性,可用
作进一步的分析。 图 1 为 MeJA 和水处理后水稻
叶片总蛋白的代表性 2-DE图谱。
2. 2 　 外源 MeJA 处理后水稻叶片蛋白质差异
表达比较分析
利用 PDQuest 8. 0 软件对 2-DE图谱分析的结
果表明,一些蛋白质在不同处理间的表达丰度存在
明显的差异。 以蛋白质丰度变化在 2 倍以上作为
检测阈值,比较对照和处理的 2-DE 凝胶图谱,结
果表明在MeJA处理8 h和12 h后的水稻叶片中
651
　
　 2 期 　 　 张智慧,等:外源茉莉酸甲酯诱导的水稻叶片蛋白质差异表达分析
Fig. 1　 Representative 2-DE patterns of proteins from rice leaves (4 th leaves of seedlings)
inoculated with MQ water (as the control) (A) or MeJA (0. 1 mmol / L) (B)
Total proteins (550 μg) were loaded on an 18 cm IPG strip with a linear gradient of pH 4-7 for IEF, following
electrophoresis of 12% SDS-PAGE and Neuhoff’s colloidal stain. Arrows indicate the positions of
differentially expressed proteins compared with proteins in the control.
共有 21 个蛋白质差异表达(表 1),这些蛋白质点
在 2-DE图谱上表现为上调、下调(蛋白点的丰度
变化在 2 倍或以上)或新增加。 其中感病品系
CO39 中的差异表达蛋白质点有 11 个(U1、U2、
U5、U6、U7、U8、D1、D2、D6、N3、N4),抗病品系
C101LAC 中的差异表达蛋白有 13 个 (U1、U3、
U4、U5、U9、U10、D3、D4、D7、N1、N2、N3、N5)。 图
2 为 MeJA 处理 8 h 和 12 h 后各差异表达蛋白质
点在不同水稻品系中的表达情况。 图 3 为 MeJA
处理 8 h和 12 h后不同水稻品系中差异表达蛋白
质点的光密度值。
2. 2. 1　 MeJA 处理 8 h 后的水稻叶片差异表达蛋
白质比较分析　 MeJA处理 8 h后,与对照相比,感
病品系 CO39 中有 5 个蛋白质表现为 2 倍以上的
差异表达(图 2、图 3),其中 U1、U2 表现为上调,
D1、D2 表现为下调,U5 为新增的蛋白质点。 抗病
品系 C101LAC中共有 8 个蛋白质表现为 2 倍以上
的差异表达,其中 U1、U3、U4 和 N1 表现为上调,
D3、D4 和 N2 表现为下调,U5 为新增的蛋白质点
(图 2、图 3)。
2. 2. 2　 MeJA处理 12 h的水稻叶片差异表达蛋白
质比较分析　 MeJA 处理 12 h 后,与对照相比,感
病品系 CO39 中有 6 个蛋白质表现为 2 倍以上的
差异表达(图 2、图 3),其中 U6、U7、U8、N3、N4 表
现为上调,D6 表现为下调。 抗病品系 C101LAC
中共有 5 个蛋白质表现为 2 倍以上的差异表达,其
中 U9、U10 和 N5 表现为上调,N3、D7 表现为下调
(图 2、图 3)。
2. 3　 水稻叶片差异表达蛋白质的质谱鉴定
通过胶内酶解、MALDI-TOF / TOF 质谱分析
及数据库检索,成功对 21 个差异表达蛋白质进行
了鉴定。 图 4 为蛋白质点 U5 的一级质谱图和二
级质谱图,表 1 为各差异表达蛋白质点的质谱鉴定
结果。
依据 GO 数据库和 UniProtKB 数据库提供的
蛋白质注释信息,除 1 个蛋白质(N1)功能未知外,
可将表 1 中其他蛋白质按照功能分为 8 类(图 5)。
这些蛋白质分别在植物抗性(推定的肉桂酰辅酶
A还原酶,U1;内切 β-1,3-1,4-葡聚糖酶,U5)、氨
基酸代谢(乙酮醇酸还原异构酶,U9)、信号转导相
关(二磷酸核苷激酶 1,U4)、光合作用(叶绿体丙
酮酸磷酸双激酶前体,U3 ;叶绿体PSII23 kDa多
751
Table 1　 Identification of differentially expressed proteins from rice leaves treated with MeJA by MALDI-TOF / TOF
Spot
No.
Protein
Name
NCBI
Accession No.
Molecular weight
(Theo. / Exp. ) (kD)
Isoelectric point
(Theo. / Exp. )
Pep.
count
Protein
score
Biological
processa)
U1 putative cinnamoyl-CoA reductase gi | 125556115 36 / 35 5. 7 / 5. 6 7 237 lignin biosynthesis
U2 malate dehydrogenase gi | 115438875 36 / 38 8. 7 / 6. 2 9 455 carbohydrate metabolism
U3
pyruvate orthophosphate dikinase
precursor, chloroplastic
gi | 115463815 94 / 93 5. 4 / 5. 2 23 206 photosynthesis
U4 nucleoside diphosphate kinase 1 gi | 223635304 17 / 15 6. 3 / 5. 4 9 332 signal transduction
U5 endo-1,3-1,4-beta-D-glucanase gi | 115464039 22 / 35 5. 3 / 4. 5 12 397 stress response
U6 EF-G, chloroplastic gi | 38567873 82 / 84 5. 7 / 4. 8 24 567 protein biosynthesis
U7
putative precursor chloroplastic
glutamine synthetase
gi | 19387272 50 / 47 6. 2 / 5. 1 23 989 photorespiratory
U8
chloroplast 23 kDa polypeptide of
photosystem II
gi | 164375543 20 / 24 5. 6 / 6. 1 11 376 photosynthesis
U9 Ketol-Acid reductoisomerase gi | 226887786 58 / 57 5. 5 / 5. 2 13 585 amino-acid biosynthesis
U10 triosephosphate isomerase gi | 553107 28 / 31 6. 6 / 5. 6 8 258 carbohydrate metabolism
D1
2,3-bisphosphoglycerate-independ-
ent phosphoglycerate mutase
gi | 115440691 61 / 63 5. 4 / 5. 1 20 442 carbohydrate metabolism
D2 putative glycine dehydrogenase gi | 51090904 112 / 95 6. 4 / 6. 1 40 871 photorespiratory
D3
sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase
precursor
gi | 27804768 43 / 36 5. 8 / 4. 5 20 789 photosynthesis
D4
plastid-specific 30S ribosomal
protein 2, chloroplast precursor
gi | 115478330 27 / 28 8. 5 / 4. 8 14 897 primary metabolic process
D6 putative inorganic pyrophosphatase gi | 46805452 32 / 36 5. 8 / 4. 7 12 213 phosphate metabolic process
D7 phosphoglucomutase gi | 62733435 66 / 59 6. 2 / 5. 2 16 320 carbohydrate metabolism
N1 conserved hypothetical protein gi | 115450485 41 / 38 5. 8 / 4. 5 11 275 unkown
N2
photosystem I reaction center sub-
unit IV, chloroplast
gi | 255677718 11 / 25 7. 0 / 5. 5 5 211 photosynthesis
N3
haloacid dehalogenase-like hydro-
lase domain containing protein
gi | 116310328 40 / 33 6. 2 / 4. 7 11 246 proteolysis
N4
ribulose bisphosphate carboxylase
large chain precursor
gi | 108862318 57 / 26 9. 0 / 5. 1 11 468 photorespiratory
N5 putative aminopeptidase N gi | 42408435 99 / 87 5. 4 / 5. 2 35 826 proteolysis
a: Biological process of each protein was according to protein annotations from GO database and UniProtKB database.
　
　 2 期 　 　 张智慧,等:外源茉莉酸甲酯诱导的水稻叶片蛋白质差异表达分析
Fig. 2　 Close-up views of the regions of 2-DE gels that show significant differences
in protein expression between C101LAC and CO39 at 8 h and 12 h
after inoculation with MeJA (0. 1 mmol / L) and MQ water
Arrows indicate proteins whose expression changed in response to MeJA treatment.
The numbers correspond to the numbers in Fig. 1.
Fig. 3　 Relative expression of differentially expressed proteins in rice leaves
at 8 h and 12 h after inoculation with MeJA (0. 1 mmol / L) and MQ water
Changes in protein spots were calculated with PDQuest 8. 0 software and plotted as the relative spot intensities of 21 spots
indicated in Fig 2. Values are the means ( ± SE) of protein volumes from three independent experiments.
“CK” indicates a control treatment. “MeJA” indicates a MeJA treatment.
951
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 4　 Identification of spot U5 by MALDI-TOF / TOF
The protein excised from CBB-staining gels was digested with trypsin, and the resulting peptides were analyzed using
the 4700 Proteomic Analyzer. A: MS spectra. The ion 1236. 66 marked with an asterisk was analyzed by MS / MS.
B: MS / MS spectra of ion 1869. 89. The protein was indentified as endo-1,3-1,4-beta-D-glucanase after database searching.
Fig. 5　 The putative functional category distribution of the 21 identified proteins
肽,U8;景天庚酮糖 1,6-二磷酸酯酶前体,D3;叶绿
体前体光系统 I 反应中心亚基 IV,N2)、光呼吸
(推定的叶绿体谷氨酰胺合成酶前体,U7;推定的
甘氨酸脱氢酶,D2;二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶
大亚基前体,N4)、糖代谢(苹果酸脱氢酶,U2;磷
酸丙糖异构酶,U10;2,3-二磷酸甘油酸的磷酸甘油
变位酶,D1;磷酸葡萄糖变位酶,D7)、蛋白质合成
与分解(叶绿体翻译延伸因子 EF-G,U6;Haloacid
dehalogenase-like hydrolase domain containing pro-
tein,N3;推定的氨肽酶 N,N5)和细胞代谢(质体
特异性 30S核糖体蛋白质 2 前体,D4;推定的焦磷
酸酶,D6)等方面发挥作用。
3　 讨论
MeJA作为一种非生物类激发子,可以诱导植
物的抗病反应[10, 14];但植物对于外源信号分子所
做出的抗病反应非常复杂,涉及多种代谢过程[15]。
通过差异蛋白质组学技术,对 MeJA诱导的水稻差
异表达蛋白质进行了分析,结果表明这些蛋白质涉
及氨基酸、碳水化合物和蛋白质等多种物质的代谢
过程,分别参与光合作用、光呼吸、糖酵解、TCA 循
环、信号转导等生理反应,表明在分子水平上MeJA
061
　
　 2 期 　 　 张智慧,等:外源茉莉酸甲酯诱导的水稻叶片蛋白质差异表达分析
诱导的水稻抗性反应是多方面的,初级代谢的改变
是植物在胁迫条件下的整体反应[16]。
植物体内 PR 蛋白的积累和活性增加被认为
是 MeJA 诱导植物系统获得抗性的重要原因之
一[17, 18]。 已证实 MeJA可以诱导不同抗性水稻品
系中 β-1,3-葡聚糖酶活性的升高[10]。 本研究结果
表明,MeJA处理 8 h后,2 个抗瘟性近等基因系水
稻品系中均出现了新增的蛋白质点 U5(内切 β-1,
3-1,4-葡聚糖酶),进一步证实了 MeJA 诱导的水
稻抗瘟性可能与其诱导的水稻系统获得抗性有关;
与感病品系 CO39 相比,MeJA 诱导的抗性品系
C101LAC中 U5 的表达量更高(为 CO39 的 2. 11
倍),是否暗示 PR 蛋白表达量的差异是不同水稻
品系抗瘟性差异的重要原因,仍有待进一步的证
实。
木质素的合成与积累被普遍认为是植物抗病
反应的重要标志之一。 其中,肉桂酰-辅酶 A 还原
酶(CCR)为木质素特异合成途径的下游关键酶
类,催化羟基肉桂酰-辅酶 A 硫酯向其相应醛的转
化,该反应被认为是潜在的碳向木质素分配的控制
关节点,从而对木质素的合成与代谢起着关键作
用[19, 20]。 本研究结果表明,MeJA处理 8 h后,2 个
水稻品系中 U1(推定的肉桂酰辅酶 A 还原酶)的
表达量均显著上调,说明 MeJA诱导的抗病性可能
与水稻叶片木质素的合成与积累有关。
MeJA诱导的差异表达蛋白质点 U6 和 N5 主
要参与蛋白质的合成与分解。 其中蛋白质点 U6
为叶绿体翻译延伸因子 EF-G,在叶绿体蛋白质合
成中起着重要作用[21, 22]。 Hashimoto 等[23]研究表
明,水稻幼苗在低温胁迫下,EF-G 表达量下降,并
推测可能与低温引起的叶绿体降解有关。 Afroz
等[24] 研究表明, 在青枯菌 ( Pseudomonas so-
lanacearum)接种后,不同抗性番茄品系中 EF-Tu
均有不同程度的表达,其中在抗性番茄品系中表达
量高于感病品系,并认为这可能与抗病品种中蛋白
质的合成效率更高有关。 本研究结果表明,MeJA
处理 12 h后,感病品系 CO39 中 EF-G的表达量出
现显著上调(为其对照的 3. 34 倍),而抗病品系
C101LAC中 EF-G 的表达量仅出现微量上调(为
其对照的 1. 36 倍),其原因仍有待进一步的研究。
氨肽酶 N(N5)作为一种重要的蛋白质水解酶
类,能催化多肽链的游离 N 端,并在植物的抗性反
应中起着重要作用[25, 26]。 Hildmann 等[27]用脱落
酸和 JA处理马铃薯,发现氨肽酶 mRNA表达量也
获得了显著增加。 Pautot 等[28]用细菌性斑点病菌
(Pseudomonas syringae pv. tomato)接种番茄及伤
处理番茄,发现氨肽酶 mRNA表达量显著增加,推
断氨肽酶通过激活或失活蛋白质(或多肽),从而
参与植物的抗性反应。 本研究结果表明,MeJA 处
理 12 h后,与对照相比,抗病品系中氨肽酶 N的表
达量显著上升,而感病品系中的表达量则略有上
升,氨肽酶是否参与了 MeJA诱导的水稻抗性或这
种变化是否与 2 个水稻品系的抗性差异有关,仍有
待进一步研究。
蛋白质点 U4 被鉴定为二磷酸核苷激酶 1
(NDPK1);NDPKs 在植物中具有高度的保守性,
主要催化 ATP和 NDP之间高能磷酸基团的转移,
同时具有 NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性。
大量研究表明,NDPKs 除了参加植物的初始代谢
功能以外,还参与植物对 UV-B、光敏色素、氧化胁
迫及激素等的反应,并认为 NDPKs 可能参与了植
物中 H2O2 介导的MAPK信号转导途径、光敏色素
介导的信号转导途径等[29, 30]。 Cho 等[31]研究发
现,在接种水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae
pv. oryzae)后,水稻叶片中的 NDPK1 mRNA表达
量显著表达;同时 NDPK1 基因表达也受到了 SA、
ABA、JA和 BTH(benzo (1,2,3) thiadiazole-7-car-
bothioic acid S-methyl ester)的强烈诱导,并进一步
推断 NDPK1 可能参与了植物的抗病反应。 本研
究结果表明,在 MeJA 处理 8 h 后,抗病品系中
NDPK1 的表达量显著上调,而感病品系中的表达
量也只出现了微量上调(为其对照的 1. 36 倍),这
可能与 NDPK1 参与了MeJA诱导的水稻抗病信号
转导途径有关。
MeJA处理后,水稻叶片中有 4 个与光合作用
相关的蛋白质和 3 个与光呼吸相关的蛋白质具有
明显的表达差异,这表明 MeJA诱导的水稻抗性伴
随着积极的物质和能量代谢变化。 其中叶绿体丙
酮酸磷酸双激酶(PPDK,U3)是 C4 植物光合途径
中的专一性酶,在 C4 植物光合作用中起着重要作
用,但 PPDK在 C3 植物中的功能尚缺乏统一的认
识。 Moons等[32]研究发现 ABA 和环境胁迫可以
诱导 PPDK在水稻根中的表达。 Chastain 等[33]分
析了水稻种子发育过程中的 PPDK 含量和翻译后
161
　
植物病理学报 42 卷
调节,并认为 PPDK 在 C3 植物中没有光合功能。
但本研究发现在 MeJA 处理水稻 8 h 后,PPDK 在
抗病品系中的表达量显著上调,而在感病品系中没
有明显变化;PPDK在不同抗性水稻品系间变化差
异的原因、及 PPDK是否参与了光合作用等仍有待
进一步的研究。
本研究发现 MeJA 诱导的差异表达蛋白质在
不同抗性水稻中表现出一定的异同,表明 MeJA诱
导不同品系水稻的抗性途径可能也存在一定的变
化。 如 MeJA均诱导了感病和抗病水稻品系中木
质素和 PR蛋白的合成和积累、氨肽酶 N活性的升
高等共同的途径;但一些蛋白质的特异性变化(如
叶绿体翻译延伸因子 EF-G 仅在感病品系中表现
为上调、PPDK 仅在抗病品系中上调、Haloacid de-
halogenase- like hydrolase domain containing protein
在感病品系中显著上调,而在抗病品系中显著下调
等),是否暗示了 MeJA 诱导不同抗性水稻品系的
抗病性途径存在差异,也有待进一步的分析。
参考文献
[1] 　 Li H L, Sun Z Y, Zhao L J, et al. Effect of jasmonic
acid and methyl jasmonate on the plant development
and resistance ( in Chinese) [ J] . Chin. Agric. Sci.
Bull. (中国农学通报), 2009, 25(16): 167 -172.
[2] 　 Liechti R, Farmer E E. The jasmonate pathway [ J] .
Science, 2002, 296(5573): 1649 -1650.
[3] 　 Zou Z Y, Wang Z Z. Effect of jasmonic acid on in-
duced resistance of rice seedlings to Magnaporthe
grisea ( in Chinese) [J] . Acta Phytopathologica Sini-
ca (植物病理学报), 2006, 36(5): 432 -438.
[4] 　 Wu G Z, Xie L J, Song Y Y, et al. The physiological
and biochemical mechanisms of disease resistance of
Oryza rufipogon griff. indigenous to gaozhou, guang-
dong against Pyricularia grisea induced by exogenous-
ly applied plant signal compounds ( in Chinese) [ J] .
Acta Agricultrlterae Boreali-occidentalis Sinica (西北
农业学报), 2009, 18(3): 254 -258.
[5] 　 Santamaria M, Thomson C J, Read N D. The promo-
ter of a basic PR1-like gene, AtPRB1, from Arabidop-
sis establishes an organ-specific expression pattern and
responsiveness to ethylene and methyl jasmonate [ J] .
Plant Mol. Biol. , 2001, 47(5): 641 -652.
[6] 　 Penninckx I A M A, Eggermont K, Terras F R G,
et al. Pathogen-induced systemic activation of a plant
defensin gene in Arabidopsis follows a salicylic acid in-
dependent pathway [ J] . Plant Cell, 1996, 8:2309 -
2323.
[7] 　 Rakwal R, Agrawal G K, Yonekura M. Separation of
proteins from stressed rice (Oryza sativa L. ) leaf tis-
sues by two-dimensional polyacrylamide gel electro-
phoresis: induction of pathogenesis-related and cellular
protectant proteins by jasmonic acid, UV irradiation
and copper chloride [ J] . Electrophoresis, 1999, 20
(17): 3472 -3478.
[8] 　 Rakwal R, Komatsu S. Role of jasmonate in the rice
(Oryza sativa L. ) self-defense mechanism using pro-
teome analysis [ J] . Electrophoresis, 2000, 21: 2492
-2500.
[9] 　 Mahmood T, Kakishima M, Komatsu S. Proteomic
analysis of jasmonic acid-regulated proteins in rice leaf
blades [J] . Protein Pept. Lett. , 2007, 14(4): 311 -
319.
[10] Zhang Z H, Nie Y F, He L, et al. Resistance-related
defense enzymes and endogenous salicylic acid induced
by exogenous methyl jasmonate in rice against blast
disease ( in Chinese) [J] . Acta Phytopathologica Sini-
ca (植物病理学报), 2010, 40(4): 395 -403.
[11] Kim S T, Kim S G, Hwang D H, et al. Proteomic
analysis of pathogen-responsive proteins from rice leav-
es induced by rice blast fungus, Magnaporthe grisea
[J] . Proteomics, 2004, 4: 3569 -3578.
[12] Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L, et al. Protein
measurement with the Folin-Phenol reagents [ J] . J.
Biol. Chem. , 1951, 193: 265 -275.
[13] Neuhoff V, Arold N, Taube D, et al. Improved stai-
ning of proteins in polyacrylamide gels including isoe-
lectric focusing gels with clear background at nanogram
sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and
R-250[J] . Electrophoresis, 1988, 9(6): 255 -262.
[14] Durrant W E, Dong X. Systematic acquired resistance
[J] . Annu. Rev. Phytopathol. , 2004, 42: 185 -
209.
[15] Wasternack C. Jasmonates: an update on biosynthesis,
signal transduction and action in plant stress response,
growth and development [J] . Ann. Bot. , 2007, 100:
681 -697.
[16] Ingram J, Bartel D. The molecular basis of dehydra-
tion tolerance in plant [ J] . Plant Mol. Biol. , 1996,
47: 377 -403.
[17] Wu C T, Bradford K J. Class I chitinase and beta-1,
261
　
　 2 期 　 　 张智慧,等:外源茉莉酸甲酯诱导的水稻叶片蛋白质差异表达分析
3-glucanase are differentially regulated by wounding,
methyl jasmonate, ethylene, and gibberellin in tomato
seeds and leaves [J] . Plant Physiol. , 2003, 133(1):
263 -273.
[18] Liao M, Li Y F, Wang Z Z. Identification of elicitor-
responsive proteins in rice leaves by a proteomic ap-
proach [J] . Proteomics, 2009, 9(10): 2809 -2819.
[19] Laskar D D, Jourdes M, Patten A M, et al. The Ara-
bidopsis cinnamoyl CoA reductase irx4 mutant has a
delayed but coherent (normal) program of lignification
[J] . Plant J. , 2006, 48:674 -686.
[20] Patten A M, Cardenas C L, Cochrane F C, et al. Re-
assessment of effects on lignification and vascular de-
velopment in the irx4 Arabidopsis mutant [ J] . Phyto-
chemistry, 2005, 66: 2092 -2107.
[21] Ciferri O, Di Pasquale G, Tiboni O. Chloroplast elon-
gation factors are synthesized in the chloroplast [ J] .
Eur. J. Biochem. , 1979, 102(2): 331 -335.
[22] Akkaya M S, Breitenberger C A. Light regulation of
protein synthesis factor EF-G in pea chloroplasts [ J] .
Plant Mol. Biol. , 1992, 20(5): 791-800.
[23] Hashimoto M, Komatsu S. Proteomic analysis of rice
seedlings during cold stress [ J] . Proteomics, 2007,
7: 1293 -1302.
[24] Afroz A, Khan M R, Ahsan N, et al. Comparative
proteomic analysis of bacterial wilt susceptible and re-
sistant tomato cultivars [J] . Peptides, 2009, 30(9):
1600 -1607.
[25] Yamauchi Y, Ejiri Y, Tanaka K. Purification of an
aminopeptidase preferentially releasing N-terminal ala-
nine from cucumber leaves and its identification as a
plant aminopeptidase N [J] . Biosci. Biotechnol. Bio-
chem. , 2001, 65(12): 2802 -2805.
[26] Giglione C, Serero A, Pierre M, et al. Identification
of eukaryotic peptide deformylases reveals universality
of N-terminal protein processing mechanisms [ J ] .
EMBO J. , 2000, 19(21): 5916 -5929.
[27] Hildmann T, Ebneth M, Peña-Cortés H, et al. Gene-
ral roles of abscisic and jasmonic acids in gene activa-
tion as a result of mechanical wounding [ J] . Plant
Cell, 1992, 4(9): 1157 -1170.
[28] Pautot V, Holzer F M, Reisch B, et al. Leucine
aminopeptidase: an inducible component of the defense
response in Lycopersicon esculentum ( tomato) [ J] .
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90(21): 9906 -
9910.
[29] Moon H, Lee B, Choi G, et al. NDP kinase 2 inte-
racts with two oxidative stress-activated MAPKs to
regulate cellular redox state and enhances multiple
stress tolerance in transgenic plants [ J] . Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 2003, 100(1): 358 -363.
[30] Fankhauser C. Phytochromes as light-modulated pro-
tein kinase [ J] . Semin. Cell Dev. Bio. , 2000, 11
(6): 467 -473.
[31] Cho S M, Shin S H, Kim K S, et al. Enhanced ex-
pression of a gene encoding a nucleoside diphosphate
kinase 1 (OsNDPK1 ) in rice plants upon infection
with bacterial pathogens [ J] . Mol. Cells, 2004, 18:
390 -395.
[32] Moons A, Valcke R, Van Montagu M. Low-oxygen
stress and water deficit induce cytosolic pyruvate ortho-
phosphate dikinase ( PPDK) expression in roots of
rice, a C3 plant [ J] . Plant J. , 1998, 15(1): 89 -
98.
[33] Chastain C J, Heck J W, Colquhoun T A, et al. Post-
translational regulation of pyruvate, orthophosphate
dikinase in developing rice (Oryza sativa) seeds [ J] .
Planta, 2006, 224(4): 924 -934.
责任编辑:于金枝
361