全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(2): 176-185(2012)
收稿日期: 2011-08-01; 修回日期: 2011-12-18
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(31000071)
通讯作者: 陈功友, 教授, 主要从事分子植物病理学研究; Tel: 021-34205873, Fax: 021-34205873, E-mail: gyouchen@sjtu. edu. cn
第一作者: 邹丽芳 (1980 - ) , 女, 湖北天门人, 讲师, 主要从事分子植物病理学研究。
水稻黄单胞菌致病相关基因插入突变体系的建立
邹丽芳1, 周 丹2, 刘之洋1, 邹华松1, 陈功友1,2*
( 1上海交通大学农业与生物学院, 上海 200240; 2南京农业大学植物保护学院农业部病虫监测与治理重点开放实验室, 南京 210095)
摘要:水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)是水稻
上的模式病原菌,分别引起水稻白叶枯病(bacterial blight, BB)和细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS)。 为了精确和高
效地实现目的基因的突变,本研究利用 pK18mobGⅡ载体,建立了一套适于 Xoo和 Xoc目的基因定点插入的突变体系。 通
过同源片段与目的基因间的同源重组,成功获得了 Xoo 和 Xoc 的 hrcV 和 hrpF 突变体。 PCR 和 Southern 杂交证实:
pK18mobGⅡ携带不同大小的同源片段,能够整合于 hrcV和 hrpF的特定位点;200 ~ 400 bp的同源片段能够获得最佳的突
变效率;两亲接合的转化效率是电转化的 5 ~ 100 倍。 毒性测定结果显示,hrcV基因决定着 Xoo 在水稻上的致病性。 致病
相关基因插入突变体系的建立为研究水稻黄单胞菌与水稻互作中致病相关基因的功能奠定了遗传学研究基础。
关键词:水稻黄单胞菌; 插入突变; hrpF基因; hrcV基因
Insertion mutagenesis in pathogenicity-associated genes of Xanthomonas
oryzae　 ZOU Li-fang1, ZHOU Dan2, LIU Zhi-yang1, ZOU Hua-song1, CHEN Gong-you1,2 　 ( 1 Department
of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2 Key Laboratory for Monitoring and
Management of Plant Diseases and Insets, Ministry of Agriculture College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University,
Nanjing 210095, China)
Abstract: Two pathovars, Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) and X. oryzae pv. oryzicola (Xoc),
cause bacterial blight (BB) and bacterial leaf streak (BLS) of rice (Oryza sativa), respectively. In order to
realize mutation in interesting genes of two pathovars accurately and efficiently, an insertion mutagenesis sys-
tem was successfully established here with pK18mobGⅡ vector. The hrcV and hrpF mutants both of Xoo and
Xoc were generated by allelic exchange between homologous fragments of the hrcV and hrpF genes, respec-
tively. The pK18mobGⅡ, harboring different homologous fragments of hrcV or hrpF, was integrated into
hrcV and hrpF gene loci. These events were verified by PCR amplification and Southern blot. 200- 400 bp ho-
mologous fragments for targeted genes by pK18mobGⅡ would lead to the higher mutation efficiency. Moreo-
ver, transformation efficiency of the recombined DNA plasmids to the recipient strain by conjugation was five
to hundred times of that by electroporation. Virulence assay demonstrated that the insertion mutagenesis in
hrcV gene led the complete loss of pathogenecity in host rice. Therefore, this mutagenesis system would facili-
tate the understanding of pathogenicity-associated genes when Xanthomonas oryzae interact with rice.
Key words: Xanthomonas oryzae; inserted mutagenesis; hrpF gene; hrcV gene
中图分类号: S432. 42　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)02-0176-10
　 　 水稻白叶枯病菌 (Xanthomonas. oryzae pv.
oryzae, Xoo)和细菌性条斑病菌(X. oryzae pv.
oryzicola, Xoc)是稻黄单胞菌种下的致病变种,可
危害模式植物水稻,分别引起水稻白叶枯病(bac-
　
　 2 期 　 　 邹丽芳,等:水稻黄单胞菌致病相关基因插入突变体系的建立
terial blight, BB)和细菌性条斑病 ( bacterial leaf
streak, BLS) [1]。 目前,5 种黄单胞菌(X. oryzae
pv. oryzicola、X. oryzae pv. oryzae、X. campestris
pv. vesicatoria、X. campestris pv. campestris和 X.
axonopodis pv. citri)的全基因组序列已公布[2 ~ 6]。
黄单胞菌 -水稻互作的功能基因组学研究对于揭
示病菌的致病性机理和设计病害防治策略具有重
要科学价值[2]。 功能基因组学要求简单和高效的
遗传操作技术来实现目的基因的突变,以揭示基因
功能。
目前为止,主要有 3 种策略来实现目的基因的
突变。 第一种是携带同源片段的载体或线性片段
整合到染色体上实现基因的定点突变[7 ~ 8],第二种
是在含有负选择标记(如 sacB、 tetAR 等)的载体
中,克隆 2 个同源片段,通过 2 次同源重组,获得目
的基因的缺失突变体[9]。 第三种在第二种策略上
进行了改进,在同源片段间插入 1 个选择标记基因
(如抗生素或转座子基因),从而简化了筛选程序;
或者在标记基因两端加 1 段 FRT(Flp recombinase
target)序列,在 FLP 重组酶(FLP recombinase)的
作用下,标记基因能够被删除掉,同样实现无标记
的缺失突变[10 ~ 11]。 高效的基因突变体系还需要稳
定的转化载体,能够克服宿主菌严格的修饰系统,
在外加选择压力的作用下整合入宿主菌的染色体
上。
pK18mobGⅡ载体已证实能够实现 Xcc 的基
因突变[12],是一个高拷贝的质粒载体,含有来源于
pUC载体的复制子,宿主菌只局限于大肠杆菌;含
有 mobRK2 转录起始子,能够通过接合的方式导入
受体菌中;含有 gusA报道基因,能够通过蓝色反应
来检测载体是否整合到受体菌的染色体中[12]。
本研究利用 pK18mobGⅡ成功实现了 Xoo
(PXO99A)和 Xoc(RS105)的 hrpF 和 hrcV 基因的
定点插入突变体,同时证明外源片段的长度和转化
方式影响突变效率。
1　 材料与方法
1. 1　 菌株和质粒
本研究所用的质粒和菌株见表 1。 黄单胞菌
株于 NA或者 NB培养基中生长,最适生长温度为
28℃。 大肠杆菌 DH5α 和 S17-1 置于 LB 培养基
中生长,最适宜生长温度为 37℃。 相应的抗生素
浓度如下:ampicillin (Ap100 μg·mL -1 ), kana-
mycin (Km 20 μg·mL -1), spectinomycin (Sp 25
μg·mL -1), rifampicin (Rif 50 μg·mL -1),先锋
霉素(Cep 20 μg·mL -1)。 本研究所用的限制性
内切酶、 EX-Taq 酶和 T4-DNA 连接酶均购于
TaKaRa公司(Dalian, China)。
1. 2　 引物设计与合成
根据 p6 质粒所含的 hrp 基因簇(Xoc RS105)
序列设计(GenBank: AY875714) hrpF 和 hrcV 基
因的引物,所有引物的合成均在上海赛百胜公司进
行[16]。 引物序列见表 2。
1. 3　 pBhrpF和 pBhrcV载体的构建
以 p6 质粒为模板, 分别通过 hrcVF1 和
hrcVR1 以及 hrpFF 和 hrpFR 2 对引物扩增得到
hrpF和 hrcV 基因片段。 这 2 个片段经 ApaⅠ +
SpeⅠ酶切纯化之后,连接到经过相同酶处理的
pBluescript Ⅱ SK ( -)载体上,转化到大肠杆菌
DH5α中,获得载体 pBhrcV和 pBhrpF。
1. 4　 hrcV、hrpF基因插入突变载体的构建
Clone Manager 7 DNA软件分析,hrcV 基因经
SphⅠ / SmaⅠ酶切可以获得 268 bp的 SphⅠ-SphⅠ
片段、917 bp的 SphⅠ-SmaⅠ片段和 106 bp 的 Sph
Ⅰ-SphⅠ片段;经 SmaⅠ / PstⅠ酶切可以获得 452
bp的 SmaⅠ-PstⅠ片段。 对 pBhrcV提取质粒分别
进行 SphⅠ / SmaⅠ和 SmaⅠ / PstⅠ的酶切消化处
理,获得以上 4 个片段,并连接在经过相同酶切处
理的 pK18mobGⅡ载体上,获得相应的载体命名:
pK18mobV268、 pK18mobV917、 pK18mobV106 和
pK18mobV452。 根据片段与 lacZ启动子方向是否
一致,判断外源片段的连接分别为顺连、反连、反连
和顺连。
同理,对已构建的载体 pBhrpF 提取质粒分别
进行 SalⅠ和 BamHⅠ / PstⅠ的酶切消化处理,获得
436、322 和 744 bp的 SalⅠ-SalⅠ片段和 410 bp 的
BamHⅠ-PstⅠ片段,各自连接在经过相同酶切处
理的 pK18mobGⅡ载体上,获得相应的载体命名:
pK18mobF436、 pK18mobF322、 pK18mobF744 和
pK18mobF410,判断连接方向为反连、反连、顺连和
顺连。
771
　
植物病理学报 42 卷
Table 1　 Strains and plasmids used in the study
Strains and plasmids Relevant characteristics Sources
Xanthomonas oryzae
　 PXO99A wild type, Philippine race 6; Rif [13]
　 RS105 Wild type, Chinese race 2; Rifr This lab
　 PXV268 hrcV insert mutant of strain PXO99A; Rifr, Kmr This study
　 PXV917 hrcV insert mutant of strain PXO99A; Rifr, Kmr This study
　 PXV106 hrcV insert mutant of strain PXO99A; Rifr, Kmr This study
　 PXV452 hrcV insert mutant of strain PXO99A; Rifr, Kmr This study
　 RSF436 hrpF insert mutant of strain PXO99A; Rifr, Kmr This study
　 RSF322 hrpF insert mutant of strain PXO99A; Rifr, Kmr This study
　 RSF410 hrpF insert mutant of strain PXO99A; Rifr, Kmr This study
　 RSF744 hrpF insert mutant of strain PXO99A; Rifr, Kmr This study
Escherichia coli
　 DH5α φ901ac ZΔM15 , recA1 Invitrogen
　 S17-1 294 recA , chromosomally integrated RP4 derivative; Tpr, Spr [14]
Plasmids
　 pBluescript Ⅱ SK ( -) Phagemid, pUC derivative; Apr Stratagene
　 pK18mobGⅡ 5. 9 kb, pUC derivative, pUC18 polylinker, mob, oriV; Kmr [15]
　 p6 a 23. 3 kb hrp cluster of strain RS105 ligated in pUFR034; Kmr [16]
　 pBhrpF A 2409 bp hrpF gene ligated into pBluescriptⅡSK ( -) at the ApaⅠand SpeⅠsites; Apr This study
　 pBhrcV A 1938 bp hrcV gene ligated into pBluescriptⅡSK ( -) at the ApaⅠand SpeⅠsites; Apr This study
　 pK18mobV268 268 bp fragement ligated in pK18mobGⅡ for insert of hrcV gene; Kmr This study
　 pK18mobV917 917 bp fragement ligated in pK18mobGⅡ for insert of hrcV gene; Kmr This study
　 pK18mobV106 106 bp fragement ligated in pK18mobGⅡ for insert of hrcV gene; Kmr This study
　 pK18mobV452 452 bp fragement ligated in pK18mobGⅡ for insert of hrcV gene; Kmr This study
　 pK18mobF436 436 bp fragement ligated in pK18mobGⅡ for insert of hrpF gene; Kmr This study
　 pK18mobF322 322 bp fragement ligated in pK18mobGⅡ for insert of hrpF gene; Kmr This study
　 pK18mobF410 410 bp fragement ligated in pK18mobGⅡ for insert of hrpF gene; Kmr This study
　 pK18mobF744 744 bp fragement ligated in pK18mobGⅡ for insert of hrpF gene; Kmr This study
1. 5　 hrcV和 hrpF基因突变体的获得
通过电转化的方法(电压 1. 8 kV,BioRad),将
1. 4 获得的相应质粒(约 50 ~ 100 ng·μL -1)分别
导入 Xoo(PXO99A)和 Xoc(RS105)的感受态细胞
中,在 NA + Km(20 μg·mL -1)的平板上,28℃培
养 3 ~ 4 d,筛选抗性菌落,用于后续验证。
通过两亲接合的方法获得突变体。 将 1. 4 获
得的质粒转入大肠杆菌 S17-1 中,活化待用。 单菌
落接菌 Xoo 和 Xoc 菌株,在液体 NB 培养基中,
28℃培养 24 ~ 36 h,以 10%比例转接入新鲜的 40
mLNB培养基中,相同条件培养 24 h。 离心收集菌
体,分别是 0. 85%的 Nacl溶液和 NB洗涤菌体,以
1 mL NB 定容菌体,作为感受态细胞。 用牙签挑
取新活化的大肠杆菌,与 20 μL的感受态细胞在细
菌滤膜上混合均匀,置于 28℃培养箱中过夜培养。
将混合菌稀释涂布于 NA + Km(20 μg·mL -1)的
平板上,筛选抗性菌落。
1. 6　 X-Gluc的染色实验
将待测黄单胞菌的单菌落,用灭菌的牙签,划
线在含有 X-Gluc(50 μg·mL -1 )的 NA 平板上,
28℃培养 2 ~ 3 d,观察蓝色菌落的形成。
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Table 2　 Primers used in the study
Primer Sequence ( restriction sites underlined) Description
hrcVF1
hrcVR1
5′-TG ACTAGTATGCTAGGAGATCGCATGC-3′
5′- CTT GGGCCCTCACACCACCACTCTACC-3′
A 1 938 bp hrcV gene fragement with ApaⅠ and SpeⅠ sites ligated in pBluescript Ⅱ KS( - )
hrpFF
hrpFR
5′-GG ACTAGTATGTCGCTCAACATGCTTT-3′
5′-CTT GGGCCCTTATCTGCGACGTATCCT-3′
A 2 409 bp hrpF gene fragement with ApaⅠ and SpeⅠ sites ligated in pBluescript Ⅱ KS( - )
RV-M
M13-47
5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′
5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′
universal primer of pK18mobGⅡ
　
植物病理学报 42 卷
1. 7　 Southern杂交分析
提取 Xoo 野生型和 hrcV 突变体的基因组
DNA,经过 EcoRI 酶切;提取 Xoc 野生型和 hrpF
突变体的基因组 DNA,经过 ApaⅠ酶切,酶切产物
低压电泳,胶变性、复性、转膜后进行预杂交、杂交、
洗膜和显色程序,参见 Dig DNA Labeling and De-
tection Kit (Roche)。 以 1. 3 中获得的 hrcV 和 hr-
pF基因片段,标记探针,步骤参见 DIG DNA Labe-
ling Kit (Roche) 。
1.8　 水稻上毒性测定及细菌在水稻组织中的生长
待测菌株的单菌落接种于含有相应抗生素的
NB培养基中,28℃培养 12 ~ 24 h,1%转接入新鲜
的 NB培养基中,培养至 OD600值为 0. 8。 采用剪
叶接种法,无菌的剪刀蘸取少量菌液,在成株期水
稻叶片顶端,剪一个平行的伤口即可,每株水稻剪
5 ~ 10 长叶片。 15 d 后观察发病情况并拍照。 利
用无针头的注射器将菌液注入感病水稻品种 IR24
的叶片中。 每张叶片注射 3 个点,共注射 3 张叶
片,3 d后观察水渍病斑的形成。 接种后,每天剪
下接种部位的叶片,用 70%乙醇和 15%次氯酸溶
液依次消毒后,捣碎叶片,悬浮在 1 mL 的无菌水
中,稀释合适的浓度,涂布在含有相应抗生素的
NA平板上,3 d后计算菌落数量,统计总的细菌个
数。 连续统计 5 d,每次设 3 个病斑的重复。
2　 结果
2. 1　 水稻白叶枯病菌 hrcV 基因定点插入突变体
的构建
pK18mobGⅡ载体含有来源于 pUC18 载体的
复制子,宿主菌只局限于大肠杆菌,故不能在黄单
胞菌中自主复制[12]。 为了验证 pK18mobGⅡ是否
能够实现 Xoo的基因突变,我们以 Xoo(PXO99A)
的 hrcV 作为突变的目的基因。 hrcV 基因分别经
SphⅠ / SmaⅠ和 SphⅠ / PstⅠ酶切能够获得 4 个不
同的片段 V268、V917、V106 和 V452(图 1-A),将
这 4 个 片 段 构 建 在 经 过 相 同 酶 切 处 理 的
pK18mobG Ⅱ 上, 分 别 获 得 pK18mobV268、
pK18mobV917、 pK18mobV106 和 pK18mobV452
重组载体 (图 1-A )。 将这些重组载体导入
PXO99A 中,与其染色体上的 hrcV 基因发生同源
重组。 结果显示,在含有卡那霉素的 NA平板上能
够筛选到转化子,分别命名为 PXV268、PXV917、
PXV106 和 PXV452, 在含有 X-gluc ( 50 μg ·
mL -1)底物的平板上,这些转化子均呈现蓝色反应
(图 2)。 这证明 pK18mobGⅡ能够成功整合于
Xoo的染色体上。
2. 2　 水稻条斑病菌 hrpF 基因定点插入突变体的
构建
以 Xoc (RS105)的 hrpF 作为突变的目的基
因。 利用相似的策略,获得重组质粒 pBhrpF,其经
SalⅠ酶切分别获得 F436、F322 和 F744 的片段(图
1-B),经 BamHⅠ / PstⅠ酶切获得片段 F410(图 1-
B)。 将这 4 个片段构建在 pK18mobGⅡ上,分别
获得重组载体 pK18mobF436 、 pK18mobF322、
pK18mobF410 和 pK18mobF744(图 1-B)。 将这些
重组载体导入 RS105 中,在含有卡那霉素的 NA
平板上也能够获得相应的转化子 RSF436 、
RSF322、RS F410 和 RSF744。 这些转化子在含有
X-gluc底物的平板上也显示蓝色反应,而野生型菌
株没有出现蓝色反应(图 2)。 这证明 pK18mobG
Ⅱ也能够成功整合于 Xoc的染色体上。
2. 3　 突变体的分子验证
我们利用 Southern 杂交进一步验证突变体。
提取野生型和突变体的基因组 DNA,Xoo 的 hrcV
突变体和野生型经过 EcoRⅠ酶切,Xoc 的 hrpF 突
变体和野生型经过 ApaⅠ酶切,分别以 hrcV 和 hr-
pF基因片段为探针进行 Southern 杂交分析,杂交
结果显示:信号条带的大小与预期的一致(图 3-A
和 3-B),这表明 pK18mobGⅡ已成功插入到 Xoo
的 hrcV基因和 Xoc的 hrpF基因位点。
为了进一步验证在所获得的转化子中,
pK18mobGⅡ定点整合入目的基因的不同位点,我
们利用两对引物组合进行 PCR 扩增,一对引物组
合的上游引物位于目的基因的 5′端,下游引物为
pK18mobGⅡ上的通用引物(如图 1-A中的 hrcVF1
和 M13-47 ),另一对引物组合的上游引物为
pK18mobGⅡ上的另一端通用引物 ,下游引物位于
目的基因的 3′端 (如图 1-A 中的 hrcVR1 + RV-
M)。 根据外源片段连接入 pK18mobGⅡ上的方
向,引物组合的下游引物作相应的更改。 Xoo 的
hrcV 突变体 PXV268、PXV917、PXV106 以及 Xoc
的hrpF突变体PXV452RSF436、RSF322、RSF410
081
　
　 2 期 　 　 邹丽芳,等:水稻黄单胞菌致病相关基因插入突变体系的建立
Fig. 1　 Schematic map of the constructions of hrcV and hrpF inserted mutants
A: Sketch map of the constructions of the four hrcV inserted mutants; B: Sketch map of the constructions of the four
hrpF inserted mutants. Crossover cables indicate single recombination between hrcV or hrpF fragments ligated in
pK18mobGⅡ and Xoo or Xoc chromosome. Primers used for PCR are shown as black arrows. The filled boxed
represent the homologous fragments of hrcV and hrpF genes. Black box, black arrow, gray box and gray arrow
indicate target gene in chromosome as well as gusA gene, mob gene, Kanamycin resistant gene, individually.
和 RSF744 2 种引物组合分别扩增出来的 PCR 片
段大小都与预期的大小一致(图 3-C、D) (可以根
据图 1 推算不同引物组合扩增的 PCR 片段
大小)。
2. 4　 转化方式和同源片段的长度影响突变效率
Xoo和 Xoc的 hrcV 基因具有 99%的序列同
源性(Similarity),hrpF 基因具有 98% 的序列同
源性 [16] 。 我们利用已连有外源片段的重组载
体,构建了 Xoo 的 hrpF 突变体 PXF410、PXF322
和 PXF744 以及 Xoc 的 hrcV 突变体 RSV268、
RSV917、 RSV106 和 RSV452。 通 过 PCR 和
Southern验证了突变体的正确性(未显示)。
181
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 2　 Phenotypes of Xoo hrcV mutants and Xoc hrpF mutants
grown on medium containing X-gluc
Fig. 3　 Molecular verification of Xoo hrcV mutants and Xoc hrpF mutants
A: Southern blot analysis of hrcV gene in Xoo hrcV mutants and the parental strain PXO99A .
Genomic DNA was digested by EcoRⅠ, separated and fixed on a nylon membrane.
The membrane was hybridized to hrcV probe labeled by DIG DNA Labeling Kit (Roche) .
B: Southern blot analysis of hrpF gene of Xoc hrpF mutants and the parental strain RS105.
Genomic DNA was digested by ApaⅠ, separated and fixed on a nylon membrane.
The membrane was hybridized to hrpF probe labeled by DIG DNA Labeling Kit (Roche) .
C: PCR analysis of Xoo hrcV gene in the hrcV mutants and the parental strain PXO99A .
“F” indicates the PCR production using hrcVF1 and the universal primer (M13-47 or RV-M) in pK18mobGⅡ;
“R” indicates the PCR production using hrcVR1 and the universal primer (M13-47 or RV-M) .
D: PCR analysis of Xoc hrpF gene in the hrpF mutants and the parental strain RS105.
“F” indicates the PCR production using hrpFF and the universal primer (M13-47 or RV-M);
“R” indicates the PCR production using hrpFR and the universal primer (M13-47 or RV-M) .
CK indicates water as PCR template.
281
　
　 2 期 　 　 邹丽芳,等:水稻黄单胞菌致病相关基因插入突变体系的建立
　 　 我们比较了电转化和两亲接合的转化方式对
突变效率的影响,发现每 108 个感受态细胞通过电
转化能获得 1 ~ 50 个转化子,电转化频率为 1. 0 ×
10 -7 ~ 2. 0 × 10 -6;两亲接合能够获得 20 ~ 300 个
转化子,接合实验的转化效率是电转化的 5 ~ 100
倍,因此,大大提高了突变效率。
比较同源片段的长度与遗传转化效率的关系
(表 3),结果显示:利用 pK18mobGⅡ载体,Xoc
(RS105)的遗传转化效率与 Xoo(PXO99A)相近,
约每 108 个感受态细胞,获得 9 个转化子;同源片
段长度在 200 ~ 400 bp左右,同源重组后获得的转
化效率最高(表 3),如 V452 片段的转化效率可以
达到 1. 5 ×10 -6,突变体的正确率可以达到 100% ;
利用 100 ~ 200 bp的同源片段转化效率最低,突变
体的正确率也降低。
2. 5　 hrcV决定 Xoo在寄主水稻上的致病性
为了验证突变体的表型,我们选取 Xoo 的
hrcV 突 变 体 PXV268、 PXV917、 PXV106 和
PXV452,在感病水稻品种 IR24 上进行致病性测
定,发现 PXV917、PXV106 和 PXV452 丧失了在苗
期水稻上引起水渍症状和在成株期水稻上形成叶
枯病斑的能力(图 4),同时也丧失了在水稻组织中
的生长能力;但是,PXV268 突变体在水稻上仍具
有致病性,注射接种苗期水稻后,仍能够形成水渍
状病斑(图 4-A);剪叶接种成株期水稻,也能形成
典型的白叶枯病斑,但比野生型菌引起的病斑弱
(图 4-B)。 在水稻组织中也具有生长能力。 以上
结果暗示, hrcV 决定 Xoo 在寄主水稻上的致病
性,但其不同的功能域对致病性的影响也发挥着重
要的作用。
3　 讨论
　 　 本研究利用 pK18mobGⅡ载体,成功获得了
Xoo和 Xoc的 hrcV和 hrpF突变体,证明 200 -400
bp的外源片段能够获得最佳的突变效率,建立了
一套适用于 Xoo 和 Xoc 的基因定点插入突变体
系。
植物病原黄单胞菌存在严格的限制性修饰系
统,限制外源质粒的导入。 成功实现目的基因的
突变(插入或者缺失),必须寻找到合适的外源载
体。 pBluescript KS、pCR2. 1-TOPO 和 pKNG101
载体已成功应用于 Xoo 和 Xoc 基因突变[7, 17]。 利
用 pBluescript KS 和 pCR2. 1-TOPO 载体,通过单
次同源重组,成功获得了 Xoo(PXO99A)的 recA 和
hrpF突变体[7 ~ 8, 17];但 pBluescript KS 含有 Cb 抗
性基因,而大多数 Xoc 菌株(如 RS105)携带 Cb 抗
性基因;pCR2. 1-TOPO 含有 Cb 和 Km 抗性基因,
但在Xoc中的成功应用未见报道。Long等[18]利用
Table 3　 Effciencies of transformants and mutants with different homologous
fragements for single exchange event in targeted genes in Xoc (RS105) and Xoo
(PXO99A) using plasmid vector pK18mobGⅡ
Target
gene
Enzyme
digesting
target gene
Homologous
fragement
length / bp
Xoc (RS105) Xoo (PXO99A)
Trans / 108
cella
Mutant
examined / Colonyb
Trans / 108
cella
Mutant
examined / Colonyb
hrcV
SphⅠ 268 8 3 / 5 10 8 / 10
SphⅠ,SmaⅠ 917 10 2 / 5 2 1 / 2
SphⅠ 106 5 1 / 5 20 1 / 20
PstⅠ,SmaⅠ 452 15 5 / 5 9 5 / 9
hrpF
SalI 436 11 3 / 11 21c N
SalⅠ 322 13 2 / 13 4 2 / 4
BamHⅠ, PstⅠ 410 5 5 / 5 5 4 / 5
SalⅠ 744 9 1 / 9 6 2 / 6
a indicates number of single exchange transformations per 107 -108 cell;
b indicating numbers in the total colonies examined by PCR detection and Southern blot assay;
c indicates number of transformations of two experiments;
N indicates not acquired the right number mutant for PXF436.
381
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 4　 Phenotypes of Xoo hrcV mutants in host rice
A: 1:Water soaked symptoms in leaves of the susceptible rice cultivar IR24 after inoculation with PXO99;
2:PXV268; 3:PXV917; 4:PXV452; 5:PXV106; The picture was taken 3 d after
inoculation with bacterial suspensions (OD600 =0. 8).
B: 1:Lesion length of of the susceptible rice leaves of the IR24 after inoculation with PXO99A; 2:PXV268;
3: PXV917; 4:PXV452; 5:PXV106; The picture was taken 14 d after inoculation at
the leaf tips with bacterial suspensions (OD600 =0. 8) .
C: Bacterial number of the Xoo hrcV mutants and the wild type strain PXO99A grown in leaves of the IR24.
pKNG101 成功实现了 Xoc(RS105)基因的突变,但
是 pKNG101 为低拷贝载体,DNA遗传操作难度较
大。 pK18mobGⅡ弥补了以上载体的缺陷,而且携
带的 gusA 报道基因和 mobRK2 转录起始子,简化
了操作程序,提高了转化效率,通过两亲交配获得
的转化效率较电转化提高了 5 ~ 100 倍。
我们分别选择 hrcV 和 hrpF 不同区域和大小
的片段,进行同源重组,发现外源片段在 200 ~
400bp能够获得最高的突变效率,延长片段长度为
917 bp以及缩短片段长度为 106 bp,突变效率随之
降低。 这暗示,200 ~ 400 bp 的长度可能与 DNA
同源重组双链的断裂长度有关。 但是,以 Xoc 436
bp的 hrpF作为同源片段,与 Xoo 的 hrpF 进行同
源重组,获得了 21 个转化子,却没有验证得到正确
的突变体,这些证据暗示:除了片段长度,同源片段
位于目的基因的区域以及该片段是否与宿主菌其
他区域的片段具有较高的同源性有关。
本研究的 4 个 Xoo hrcV突变体在水稻和烟草
上呈现不同的表型(图 4),暗示 hrcV 不同功能域
的突变,引起不同的致病表型,随着 4 个外源片段
的不同,pK18mobGⅡ载体会整合入 hrcV 的不同
区域(图 1),可以利用这个优势来进行蛋白功能域
的分析。
随着功能基因组学的发展,多个基因在致病性
中的协同作用越来越受关注究,因而多基因同时敲
除的技术越来越受重视[8],这就要求发展一种不
引入抗生素基因、可一次敲除多个基因或能进行多
次遗传操作的突变技术[9]。 在本研究的基础上,
我们在 pK18mobGⅡ载体上引入负选择标记基因,
成功实现了 Xoc 单基因和多基因的敲除[19],建立
了稳定的基因敲除体系,加快了功能基因的挖掘。
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