全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(５): ５５６￣５６０(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣１２￣０５ꎻ 修回日期: ２０１４￣０６￣２８
基金项目: 现代农业产业技术体系建设专项资金资助(ＣＡＲＳ￣２０￣２￣２)ꎻ云南省现代农业产业技术体系建设专项资金资助
通讯作者: 黄应昆ꎬ研究员ꎬ主要从事甘蔗病害防控研究ꎻＴｅｌ:０８７３￣７２２７０１７ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｈｕａｎｇｙｋ６４＠１６３􀆰 ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０５.０１６
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研究简报
云南蔗区发现由植原体引起的检疫性病害甘蔗白叶病
李文凤ꎬ 王晓燕ꎬ 黄应昆∗ꎬ 单红丽ꎬ 申 科ꎬ 罗志明ꎬ 张荣跃ꎬ 尹 炯
(云南省农业科学院甘蔗研究所ꎬ云南省甘蔗遗传改良重点实验室ꎬ 开远 ６６１６９９)
Ａ ｑｕａｒａｎｔｉｎｉｎｇ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｗｈｉｔｅ ｌｅａｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｓｕｇａｒ￣
ｃａｎｅ ｆｉｅｌｄ ｉｎ Ｙｕｎｎａｎ　 ＬＩ Ｗｅｎ￣ｆｅｎｇꎬ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ￣ｙａｎꎬ ＨＵＡＮＧ Ｙｉｎｇ￣ｋｕｎꎬ ＳＨＡＮ Ｈｏｎｇ￣ｌｉꎬ ＳＨＥＮ Ｋｅꎬ
ＬＵＯ Ｚｈｉ￣ｍｉｎｇꎬ ＺＨＡＮＧ Ｒｏｎｇ￣ｙｕｅꎬ ＹＩＮ Ｊｉｏｎｇ 　 ( Ｓｕｇａｒｃａｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＳｃｉｅｎｃｅꎬＹｕｎｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｕｇａｒｃａｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔꎬ Ｋａｉｙｕａｎ ６６１６９９ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｂｙ ｕｓｅｄ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲꎬ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｗｈｉｔｅ ｌｅａｆ
(ＳＣＷＬ) ｉｎ ４８ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ＳＣＷＬ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ Ｂａｏｓｈａｎ ａｎｄ Ｌｉｎｃａｎｇ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｐｒｉｍｅｒ
ｐａｉｒｓ ＭＬＯＸ/ ＭＬＯＹ ａｎｄ Ｐ１ / Ｐ２􀆰 Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｉｚｅ ｏｆ １７ Ｂａｏｓｈａｎ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ＳＣＷＬ
ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ２１０ ｂｐ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ (ＧｅｎＢａｎｋ: ＫＣ６６２５０９)ꎻ ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｉｚｅ ｏｆ １０
Ｌｉｎｃａｎｇ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ＳＣＷＬ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ２０２ ｂｐ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ (ＧｅｎＢａｎｋ: ＫＦ４３１８３７) .
Ｔｈｅ Ｂｌａｓｔ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗｅｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ １６Ｓ￣２３Ｓ ＩＳＲ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ
ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｔｈａｔ ｃａｕｓｅｓ ＳＣＷＬ ａｎｄ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ (９９􀆰 ０５％－１００％ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ) ｔｏ ｔｈｅ
ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｇｉｏｎ ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ􀆰 Ｐｌａｎｔ ｈｅｉｇｈｔꎬ ｓｔａｌｋ ｄｉａｍｅｔｅｒꎬ ｍｉｌｌａｂｌｅ ｓｔａｌｋ ｒａｔｅ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ
ｓｔａｌｋ ｗｅｉｇｈｔ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＣＷＬꎬｗｈｉｃｈ ｃａｕｓｅｄ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｓｕｇａｒｃａｎｅ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｙｕｎｎａｎ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｆｉｅｌｄꎻ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｗｈｉｔｅ ｌｅａｆ ｄｉｓｅａｓｅꎻ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａꎻ ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲꎻ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０５￣０５５６￣０５
　 　 甘蔗白叶病(Ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｗｈｉｔｅ ｌｅａｆꎬ ＳＣＷＬ)是
由植原体引起的甘蔗重要病害之一ꎬ１９５４ 年首次
在泰国北部南邦府发现ꎬ我国台湾 １９５８ 年报道了
该病的发生情况[１]ꎮ 该病在印度、巴基斯坦、斯里
兰卡、日本、老挝、缅甸、越南、菲律宾、泰国等地均
有大面积发生ꎬ造成甘蔗和制糖产业巨大经济损
失[２]ꎮ ＳＣＷＬ植原体存在于病株韧皮部筛管中ꎬ
可通过带病蔗种进行远距离传播ꎮ 此外ꎬ在田间还
可通过叶蝉 Ｍａｔｓｕｍｕｒａｔｅｔｔｉｘ ｈｉｒｏｇｌｙｐｈｉｃｕｓ和 Ｙａｍａ￣
ｔｏｔｅｔｔｉｘ ｆｌａｖｏｖｉｔｔａｔｕｓ 传播[２]ꎮ １９８７ 年 Ｚｈｏｕ 等[３]通
过电镜检测发现我国福建、广西和云南蔗区的部分
栽培品种中有 ＳＣＷＬ植原体的存在ꎮ 随后ꎬ福建、
广东、广西和云南等地先后建立了甘蔗检疫制度ꎮ
虽然电镜检测可以确定 ＳＣＷＬ 病原的存在ꎬ但受
经费和条件所限很难在生产中推广应用ꎮ 本研究
采用巢式 ＰＣＲ 方法ꎬ对采集的疑似 ＳＣＷＬ 甘蔗植
株样品进行了检测鉴定ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 疑似 ＳＣＷＬ甘蔗样品采集
　 　 ２０１２ ~ ２０１３ 年ꎬ从云南保山施甸县、隆阳区和
临沧耿马县、镇康县、双江县、临翔区采集 ４８ 份疑
似 ＳＣＷＬ 甘蔗植株(表 １)ꎮ 症状均表现为叶质柔
　
　 ５期 李文凤ꎬ等:云南蔗区发现由植原体引起的检疫性病害甘蔗白叶病
软、白化ꎬ分蘖明显增多ꎬ株高、茎径、成茎率和单茎
重明显降低或减少ꎮ 阳性对照 ＤＮＡ 由云南省甘
蔗遗传改良重点实验室提供ꎬ阴性对照为健康甘蔗
叶片基因组 ＤＮＡꎬ空白对照为灭菌双蒸水ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ４８ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ＳＣＷＬ ｓａｍｐｌｅｓ
Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉｅｔｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｃｅ Ｐｌａｎｔｉｎｇ ｙｅａｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
ＢＳ１ ＰＹ３１２０ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＳ２ ＰＹ３１２０ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＳ３ ＰＹ３１２０ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＳ４ ＰＹ３１２０ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ５ ＰＹ３１２０ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ６ ＰＹ３１２０ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ７ Ｙｕｎｚｈｅ ８６￣１６１ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＳ８ Ｙｕｎｚｈｅ ８６￣１６１ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＳ９ Ｙｕｎｚｈｅ ８６￣１６１ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＳ１０ Ｙｕｎｚｈｅ ８６￣１６１ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ１１ Ｙｕｎｚｈｅ ８６￣１６１ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ１２ Ｙｕｎｚｈｅ ８６￣１６１ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ１３ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＳ１４ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＳ１５ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＳ１６ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＳ１７ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＳ１８ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ１９ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ２０ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ２１ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ２２ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ２３ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＳ２４ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ３ ＋
ＢＳ２５ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ３ ＋
ＢＳ２６ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ３ ＋
ＢＳ２７ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｓｈｉｄｉａｎꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ３ ＋
ＢＬ１ Ｙｕｎｚｈｅ ０３￣１９４ Ｌｏｎｙａｎｇꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＬ２ Ｙｕｎｚｈｅ ０３￣１９４ Ｌｏｎｙａｎｇꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＬ３ Ｙｕｎｚｈｅ ０３￣１９４ Ｌｏｎｙａｎｇꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＬ４ Ｙｕｎｚｈｅ ０３￣１９４ Ｌｏｎｙａｎｇꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＬ５ Ｙｕｎｚｈｅ ０３￣１９４ Ｌｏｎｙａｎｇꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＬ６ Ｙｕｎｚｈｅ ０３￣１９４ Ｌｏｎｙａｎｇꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ２ ＋
ＢＬ７ Ｙｕｅｔａｎｇ ９３￣１５９ Ｌｏｎｙａｎｇꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
７５５
　
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ １　 Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ４８ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ＳＣＷＬ ｓａｍｐｌｅｓ (Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ)
Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉｅｔｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｃｅ Ｐｌａｎｔｉｎｇ ｙｅａｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
ＢＬ８ Ｙｕｅｔａｎｇ ９３￣１５９ Ｌｏｎｙａｎｇꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＢＬ９ Ｙｕｅｔａｎｇ ９３￣１５９ Ｌｏｎｙａｎｇꎬ Ｂａｏｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ １ ＋
ＬＧ１ Ｙｕｅｔａｎｇ ９３￣１５９ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ Ｇｅｎｇｍａ １ ＋
ＬＧ２ ＲＯＣ２２ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ Ｇｅｎｇｍａ ２ ＋
ＬＧ３ ＲＯＣ２２ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ Ｇｅｎｇｍａ ２ ＋
ＬＧ４ ＲＯＣ２２ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ Ｇｅｎｇｍａ １ ＋
ＬＧ５ Ｇｕｉｔａｎ １２ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ Ｇｅｎｇｍａ ２ ＋
ＬＧ６ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ Ｇｅｎｇｍａ ３ ＋
ＬＺ１ Ｙｕｅｔａｎｇ ００￣２３６ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ ＺｈｅｎＫａｎｇ ３ ＋
ＬＺ２ ＲＯＣ２５ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ ＺｈｅｎＫａｎｇ ２ ＋
ＬＳ１ ＲＯＣ２５ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ Ｓｈｕａｎｇｊｉａｎｇ ２ ＋
ＬＳ２ Ｙｕｅｔａｎｇ ９３￣１５９ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ Ｓｈｕａｎｇｊｉａｎｇ ３ ＋
ＬＬ１ Ｙｕｅｔａｎｇ ８６￣３６８ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ Ｌｉｎｘｉａｎｇ ２ ＋
ＬＬ２ ＲＯＣ２２ Ｙｕｎｎａｎ Ｌｉｎｃａｎｇ Ｌｉｎｘｉａｎｇ ３ ＋
ＰＣ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＋
ＮＣ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ –
ＣＫ Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ –
　 “＋”: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ＳＣＷＬꎻ “－”: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ＳＣＷＬ.
１􀆰 ２　 植物总 ＤＮＡ提取
　 　 各检测样品称取叶片 ０􀆰 ２ ｇꎬ采用改进的
ＣＴＡＢ法提取植物总 ＤＮＡꎮ
１􀆰 ３　 巢式 ＰＣＲ检测
１􀆰 ３􀆰 １　 引物设计与合成　 参照文献[４]合成 ＳＣ￣
ＷＬ植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ扩增引物(上海生物工程公
司合成)ꎬ其序列为:ＭＬＯＸ:５′￣ ＧＴＴＡＧＧＴＴＡＡＧＴＣ￣
ＣＴＡＡＡＡＣＧＡＧＣ￣３′ꎬ ＭＬＯＹ: ５′￣ ＧＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＴＣ￣
ＣＡＣＴＧＴＡＴＧＣＣ￣３′ꎻ Ｐ１: ５′￣ ＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＴＣ￣
ＣＣＴＡＣＣＧＧ￣３′ꎬ Ｐ２: ５′￣ ＧＧＴＧＧＧＣＣＴＡＡＡＴＧＧＡＣＴＴ￣
ＧＡＡＣＣ￣３′ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ２　 巢式 ＰＣＲ反应　 参考文献[５]建立的甘蔗
白叶病植原体巢式 ＰＣＲ 检测方法ꎬ将待测样品进
行巢式 ＰＣＲ扩增ꎮ 第一次 ＰＣＲ 反应体系 ２０ μＬ:
模板总基因组 ＤＮＡ １ μＬꎬ１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２􀆰 ５ μＬꎬ
ＭＬＯＸ(２０ μｍｏｌ / Ｌ) １ μＬꎬＭＬＯＹ(２０ μｍｏｌ / Ｌ) １
μＬꎬＭｇＣｌ２(２５ ｍｍｏｌ / Ｌ)０􀆰 ５ μＬꎬｄＮＴＰｓ(１０ ｍｍｏｌ /
Ｌ) １ μＬꎬＴａｑ 酶(５ Ｕ / μＬ) ０􀆰 ２ μＬꎬｄｄＨ２ Ｏ １２􀆰 ８
μＬꎮ 第一次 ＰＣＲ扩增程序为:９４℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ
９４℃变性 １ ｍｉｎꎬ５５℃退火 １ ｍｉｎꎬ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ
２５个循环ꎻ最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ 第二次 ＰＣＲ反
应体系 ２０ μＬ:取 １ μＬ 第一次 ＰＣＲ 扩增产物(稀
释 １００倍)作为模板 ＤＮＡꎬＰ１(２０ μｍｏｌ / Ｌ)１ μＬꎬ
Ｐ２(２０ μｍｏｌ / Ｌ)１ μＬꎬ其他试剂用量同第一次 ＰＣＲ
扩增ꎮ 第二次 ＰＣＲ 扩增程序为: ９４℃ 预变性
５ ｍｉｎꎻ９４℃变性 １ ｍｉｎꎬ６２℃退火 １ ｍｉｎꎬ７２℃延伸
１ ｍｉｎꎬ３５个循环ꎻ最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
１􀆰 ３􀆰 ３　 电泳检测　 取 １０ μＬ ＰＣＲ 产物点进 １􀆰 ５％
琼脂糖凝胶胶孔里ꎬ在 ０􀆰 ５×ＴＢＥ 和 １４０Ｖ 的电压
下电泳 ２０ ｍｉｎ 后ꎬ用 ＢＩＯ￣ＲＡＤ 凝胶成像系统观
察ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ４　 巢式 ＰＣＲ产物克隆、测序及序列分析　 巢
式 ＰＣＲ产物用爱思进生物技术 (杭州) 有限公司
的 Ａｘｙ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收纯化后ꎬ送
北京六合华大基因公司进行序列测定ꎮ 所得序列
在 ＧｅｎＢａｎｋ 中进行 ＢＬＡＳＴ 检索ꎬ应用 ＤＮＡＭＡＮ
６􀆰 ０和 Ｃｌｕｓｔａｌ ２􀆰 ０软件进行分析ꎮ
８５５
　
　 ５期 李文凤ꎬ等:云南蔗区发现由植原体引起的检疫性病害甘蔗白叶病
２　 结果与分析
２􀆰 １　 疑似 ＳＣＷＬ甘蔗样品 Ｎｅｓｔ￣ＰＣＲ检测结果
　 　 对 ４８ 份疑似 ＳＣＷＬ 甘蔗样品的 Ｎｅｓｔ￣ＰＣＲ
检测结果表明(表 １)ꎬ４８ 份疑似样品及阳性对
照ꎬ均能扩增出目的条带ꎬ而健康蔗株阴性对照
和双蒸水空白对照均未扩增出目的条带(图 １)ꎮ
说明 ４８ 份疑似 ＳＣＷＬ 甘蔗样品中均存在 ＳＣＷＬ
植原体ꎮ
２􀆰 ２　 Ｎｅｓｔ￣ＰＣＲ扩增产物测序结果及序列分析
　 　 从检测阳性的样品中随机选取 ２７ 个 Ｎｅｓｔ￣
ＰＣＲ产物进行测序ꎬ保山的 １７ 条片段大小均为
２１０ ｂｐꎬ序列完全一致(登录号 ＫＣ６６２５０９)ꎻ临沧的
１０条片段大小均为 ２０２ ｂｐꎬ序列完全一致(登录号
ＫＦ４３１８３７)ꎮ 经 ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ 比对ꎬ保山、临沧 ＳＣ￣
ＷＬ致病分离物核苷酸序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中水稻黄
萎组(１６Ｓｒ ＸＩ)的 ＳＣＷＬ 植原体基因组序列同源
性高达 ９９􀆰 ０５％~１００％ꎬ而与其他组植原体基因组
序列同源性低于 ８７􀆰 ８％ꎮ 通过 ＤＮＡＭＡＮ 多重序
列比对ꎬ保山分离物与临沧分离物存在 ８个碱基缺
失ꎬ同源性为 ９９􀆰 ５１％ꎻ与泰国分离物 (登录号
ＨＱ９１７０６８)不存在碱基差异ꎬ 同源性为 １００％ꎻ与
夏威夷分离物(登录号 ＪＮ２２３４４８)存在 ２个碱基缺
失和 １个碱基替换ꎬ同源性为 ９９􀆰 ０５％ꎻ与斯里兰卡
分离物(登录号 ＪＦ７５４４４７)存在 １ 个碱基缺失ꎬ同
源性为 ９９􀆰 ５２％ꎮ 临沧分离物与泰国分离物存在
８个碱基缺失ꎬ同源性为 ９９􀆰 ５１％ꎻ与夏威夷分离物
存在 ８ 个碱基缺失和 １ 个碱基替换ꎬ同源性为
９８􀆰 ５３％ꎻ与斯里兰卡分离物虽然存在 ７ 个碱基缺
失ꎬ但同源性为 １００％ꎮ
２􀆰 ３　 系统进化树构建与分析
　 　 下载 ＧｅｎＢａｎｋ中植原体 １６Ｓｒ各组中的代表性
植原体 １６Ｓ￣２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＳＲ 序列ꎬ与保山、临沧
ＳＣＷＬ植原体 １６Ｓ￣２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＳＲ 序列进行同源性
分析ꎬ利用 Ｍｅｇａ４􀆰 １软件构建系统进化树ꎬ在构建
中选择 Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ (ＡＹ９７４０６０)为外
群(图 ２)ꎮ 由系统发育树可以看出ꎬ保山、临沧
ＳＣＷＬ植原体与 ＧｅｎＢａｎｋ中已有的泰国、斯里兰卡
ＳＣＷＬ植原体处于同一分支上ꎬ亲缘关系比夏威夷
ＳＣＷＬ植原体的更近ꎮ 所检测的云南甘蔗样品
ＳＣＷＬ植原体均归为一个类群ꎬ属于 １６Ｓｒ ＸＩ组ꎮ
３　 结论与讨论
　 　 通过对 ４８ 份疑似 ＳＣＷＬ 甘蔗样品 Ｎｅｓｔ￣ＰＣＲ
检测及测序分析ꎬ证实云南保山、临沧蔗区出现的疑
似 ＳＣＷＬ症状是由 １６Ｓｒ ＸＩ组中的 ＳＣＷＬ植原体引
起的ꎬ其与 ＧｅｎＢａｎｋ中公布的 ＳＣＷＬ植原体基因组
序列高度同源ꎬ同源性在 ９９􀆰 ０５％~１００％之间ꎮ
　 　 本研究仅对云南不同地区部分 ＳＣＷＬ 植原体
１６Ｓ￣２３Ｓ ＩＳＲ序列进行了初步分析ꎬ要进一步明确
ＳＣＷＬ植原体是否存在不同地区、不同品种间的株
系分化及遗传多样性ꎬ还需通过扩大样品的检测数
量ꎬ测定核糖体蛋白(ｒｐ)基因、延伸因子( ｔｕｆ)基因、
１６Ｓ ｒＤＮＡ间区序列等具有较大变异性的基因或区
域ꎬ以获取更加丰富的分子生物学信息来加以证实ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ＳＣＷＬ ｓａｍｐｌｅｓ
Ｍ: Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １￣１９: Ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ＳＣＷＬ ｓａｍｐｌｅｓꎻ ＰＣ: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ＮＣ: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ＣＫ: Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ.
９５５
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ２　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄꎬ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ
ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ (ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｗｈｉｔｅ ｌｅａｆ ｆｒｏｍ Ｂａｏｓｈａｎ ａｎｄ
Ｌｉｎｃａｎｇꎬ Ｙｕｎｎａｎ) ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ
Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａｎ ｏｕｔｇｒｏｕｐ ｓｐｅｃｉｅｓ.
　 　 ＳＣＷＬ是易随种苗进行传播的危险性病害ꎬ其
对甘蔗产业的发展有潜在威胁ꎮ 因此ꎬ有必要加强
对良繁基地扩繁种苗和引进及外调甘蔗品种的
ＳＣＷＬ检疫和监测ꎬ严禁从发生区和发生田块调
种、留种ꎬ从源头上控制 ＳＣＷＬ 扩散蔓延ꎮ 同时ꎬ
要加强对发病区的检查ꎬ及时发现并挖除烧毁病
株ꎬ病田避免宿根连作ꎬ发病株率达 １５％以上蔗园
不宜宿根ꎬ以此对 ＳＣＷＬ进行有效防控ꎮ
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责任编辑:于金枝
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