全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(2): 205-210(2013)
收稿日期: 2012-09-05; 修回日期: 2012-12-25
基金项目: 国家重点基础研究发展计划(2010CB951503; 2013CB127700); 国家自然科学基金(31271987); 农业部财政专项(2130108)
通讯作者: 周益林,研究员,主要从事小麦白粉病研究; E-mail: ylzhou@ ippcaas. cn。
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■研究简报
小麦白粉菌 HSP70 基因的克隆
及高温胁迫对其表达的影响
邢淑莲, 周益林∗, 段霞瑜, 邹亚飞
(中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)
Cloning of heat shock protein gene, HSP70, in Blumeria graminis f. sp. tritici and
its expression under high temperature stress　 XING Shu-lian, ZHOU Yi-lin, DUAN Xia-yu,
ZOU Ya-fei　 (State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese
Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)
Abstract: The objective of this study was to detect the effect of high temperature stress on the expression of
HSP70 gene in Blumeria graminis f. sp. tritici. The cDNA sequence of HSP70 gene was cloned using RT-
PCR and RACE. The obtained cDNA sequence contained a 1 947 bp open reading frame (ORF) and encoded
a sequence of 648 amino acids residues. The molecular mass was estimated as 70. 5 kDa and isoelectric point
(pI) 4. 84. The gene contained the signature sequences of HSP70 family. Real-time quantitative PCR was
used to analyze the expression of HSP70 gene of B. graminis f. sp. tritici after the treatments of heat shock
(28℃) in different time. The results showed that the mRNA expression of HSP70 gene of B. graminis f. sp.
tritici was significantly up-regulated after heat shock at 28℃. The expression level of HSP70 gene reached the
maximum (11. 6 times of the control) after 60 minutes, and then decreased. It was inferred that HSP70 gene
might play an important role in B. graminis f. sp. tritici to high temperature.
Key words: Blumeria graminis f. sp. tritici; HSP70; gene clone;high temperature stress; real-time quanti-
tative PCR
文章编号: 0412-0914(2013)02-0205-06
　 　 小麦白粉病是由专性寄生菌 Blumeria grami-
nis f. sp. tritici引起的一种重要的气传真菌病害,
该病曾于 1990 - 1991 年两年在我国发生大流行,
近年来其发生面积也一直维持在 500 万公顷以上,
给我国小麦生产造成了严重的损失。 已有的研究
结果表明,温度不但影响小麦白粉病的发生和流
行,而且温度胁迫作用还会对白粉病菌群体产生影
响,从而使病菌群体对温度的敏感性降低。 目前已
发现在我国白粉病菌群体中存在抗高温或耐高温
的菌株,而且这些菌株在较高的温度下其寄生适合
度要高于对温度高敏感性的菌株[1]。 由于病菌群
体对温度敏感性的变化有可能影响病害越夏和越
冬的范围,进而影响病害的发生和流行程度,因此,
有必要对其耐高温的分子机制进行研究,这对于了
解小麦白粉菌对温度的适应性以及气候变暖对此
病害发生和流行的长期影响具有重要的意义。
热激蛋白(heat shock protein, HSP)是细胞或
生物体在受热或受病原体及其他理化因素等刺激
　
植物病理学报 43 卷
后所产生的一类在生物进化中最保守的蛋白。 据
分子量不同,HSP 可分为 HSP100、HSP90、HSP70、
HSP60 以及小分子量热休克蛋白,其中 HSP70 是
最保守、最重要、最受关注的一族。 不少研究表明,
编码 HSP70 的基因与生物体的耐热性和抗寒性密
切相关。 目前有关真菌 HSP70 的研究还比较少,
Montero-Barrientos等[2]的研究表明,哈茨木霉菌
(Trichoderma harzianum) T34 经热激后,HSP70 基
因表达量增加。 HSP70 蛋白的表达调控主要发生
在转录水平,因此通过检测细胞中 HSP70 基因
mRNA含量能代表 HSP70 蛋白的表达情况。
为了探讨 HSP70 在小麦白粉菌耐高温胁迫中
的作用,本研究通过 RACE 技术克隆了小麦白粉
菌 HSP70 基因的 cDNA 序列,并利用实时荧光定
量 PCR 技术从 mRNA 转录水平测定了高温胁迫
对小麦白粉菌 HSP70 基因表达的影响。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
供试的小麦白粉菌株于 2008 年在北京房山区
采集获得(编号为:08-10-3-1),经单孢纯化后由本
实验室保存。
1. 2　 试剂
TRIzol 试 剂 购 自 Invitrogen 公 司; 5′-Full
RACE Kit、3′-Full RACE Core Set Ver. 2. 0 、TaKa-
Ra LA Taq、SYBR © Premix Ex TaqTM购自 TaKa-
Ra公司;DNA胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购
自北京天根生物公司;反转录试剂盒 (RevertAidTM
First Strand cDNA Synthesis Kit) 购自 Fermentas公
司;引物由北京六合华大基因公司合成。
1. 3　 总 RNA的提取及 cDNA第一链的合成
在经热激诱导后的白粉菌孢子粉中加入玻璃
珠和 TRIzol 试剂,震荡破碎。 按 TRIzol 试剂说明
书提取总 RNA。 cDNA 第一链的合成采用 TaKa-
Ra RACE试剂盒里的反转录操作进行。
1. 4　 引物设计和 PCR反应
据 Li设计的一对扩增真菌 HSP70 基因的简
并引物扩增小麦白粉菌 HSP70 基因的核心片段序
列(表 1)。 据此核心片段序列用 Primer 5. 0 软件
分别设计 RACE 5′和 3′端引物扩增 HSP70 基因的
5′和 3′末端序列(表 1)。 Outer PCR 反应体系(50
μL):cDNA 2 μL、1 × cDNA dilution bufferⅡ8 μL、
10 × LA PCR bufferⅡ4 μL、10 μmol / L 正反向引
物各 2 μL、MgCl2 (25 mmol / L)3 μL、TaKaRa LA
Taq (5 U / μL) 0. 25 μL、ddH2O 28. 75 μL。 PCR
扩增程序:94℃预变性 3 min;94℃变性 30 s,55℃
退火 30 s,72℃延伸 2 min,20 个循环;72℃延伸 10
min。 以 Outer PCR 产物为模板,进行 Inner PCR
扩增反应,PCR反应体系(50 μL):Outer PCR反应
液1 μL、10 × LA PCR BufferⅡ5 μL、10 μmol / L正
反向引物各 2 μL、MgCl2(25 mmol / L)5 μL、dNTP
mixture (2. 5 mmol / L) 8 μL、TaKaRa LA Taq(5
U / μL)0. 5 μL、ddH2O 26. 5 μL。 扩增条件同上。
1. 5　 PCR产物的克隆与测序
PCR产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后用
DNA纯化试剂盒纯化回收,克隆于 pMD-18T 载体
上,再转化到大肠杆菌内由华大基因测序。
1. 6　 序列分析及同源性比较
在 NCBI 网站: http: / / www. ncbi. nlm. nih.
gov /对序列进行同源比对分析,寻找开放阅读框。
用 DNAStar 软件进行序列拼接及翻译。 在 EX-
PASY网站:http: / / www. expasy. ch / tools /进行蛋
白质家族位点分析。
1. 7　 标准品的制备及双标准曲线的建立
根据本文获得的小麦白粉菌 HSP70 基因核
心序列及 NCBI上小麦白粉菌 18S rRNA 基因序
列(GenBank 号:AB022375. 1)分别设计其 Real-
time PCR特异引物(表 1)。 按 Xu 等的方法,制
备两种重组质粒,检测浓度并计算质粒拷贝数。 将
两种重组质粒依次按 10 倍 ~ 105 倍 5 个梯度稀释
后进行实时荧光定量 PCR扩增,然后根据 Ct值制
作标准曲线。 随后将 5 个浓度的样品保存在 -
70℃作为标准样品。 实时荧光定量 PCR扩增体系
(25 μL)为:cDNA 1 μL、上下游引物(10 μmol / L)
各 1 μL、 SYBR © Premix Ex TaqTM 12. 5 μL、
ddH2O 9． 5 μL。实时荧光定量PCR循环条件:95℃
602
　
　 2 期 　 　 邢淑莲,等:小麦白粉菌 HSP70 基因的克隆及高温胁迫对其表达的影响
Table 1　 Primer sequences used in the cDNA cloning and real-time quantitative PCR
Primer Sequence (5′-3′ )
Degenerate primer
Forward: GCTGTHRTYACHGTYCCAGCTTAYTTC
Reverse: RGCDACRGCYTCRTCNGGRTTRAT
5′ RACE gene specific outer primer GGGTTCCGCCGTTGAAGTAAT
5′ RACE adaptor outer primer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
5′ RACE gene specific inner primer GCGGGTGATAGAGGTGTAGAAGT
5′ RACE adaptor inner primer CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
3′ RACE gene specific outer primer GAAGATTTTGACAACCGCCT
3′ RACE adaptor outer primer TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
3′ RACE gene specific inner primer TTCAACGGCAAGGAACCCAACA
3′ RACE adaptor inner primer CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG
HSP70 gene real-time quantitative PCP primer
Forward: CTGCGCAGACTAAGAACCGCT
Reverse: TTTCGCGTCGGCAAGAACACG
18S rRNA reference gene specific primer
Forward: TAGTTGGTGGAGTGATTTGT
Reverse: CGTTGGCTCTGTCAGTGTAG
预变性 30 s,95℃变性 5 s,60℃退火 20 s,共 45 个
循环。
1. 8　 小麦白粉菌 HSP70 基因表达的定量检测
将 18℃正常培养 8 d的新鲜小麦白粉菌,转入
28℃条件下,分别热激处理 10、30、60 和 120 min。
热激结束后收集小麦白粉菌孢子粉并用液氮迅速
冷冻,按照 1. 7 的方法制备模板 cDNA,并进行实
时荧光定量 PCR检测。 每个处理重复 3 次。
1. 9　 数据分析
利用 SAS统计分析软件单因素方差分析法,
对不同时间处理下小麦白粉菌 HSP70 基因荧光相
对表达量结果的差异显著性进行分析。 显著性检
验水平为 P =0. 05。
2　 结果
2. 1　 小麦白粉菌 HSP70 序列分析
通过克隆获得小麦白粉菌 HSP70 cDNA 序
列,GenBank登录号为 JQ917466,全长 2 216 bp,开
放阅读框为 1 947 bp,编码 648 个氨基酸,理论分
子量为 70. 5 kDa,理论等电点为 4. 84,推导的氨基
酸序列包含 HSP70 蛋白家族高度保守的 3 个标
签:7-14( IDLGTTYS)、195-208( IFDLGGGTFDVS-
LL)和 332-346( IVLVGGSTRIPRIQK)。 细胞质中
高度保守的 HSP70 C末端标志性基序 EEVD 位于
645-648(图 1)。
利用 NCBI 站点上的 BLAST 软件分析表明,
小麦白粉菌 HSP70 基因编码的氨基酸序列与其他
真菌 Glarea lozoyensis、Grosmannia clavigera、深绿
木霉菌 Trichoderma atroviride 和球毛壳菌 Chaeto-
mium globosum HSP70 氨基酸序列的同源性分别
为 94% 、90% 、90%和 89% 。
2. 2　 高温胁迫对小麦白粉病菌 HSP70 基因表达
的影响
高温胁迫下(28℃ ) ,小麦白粉菌 HSP70 基
因的相对表达量如表 2 所示。 小麦白粉菌在在
未经高温胁迫时,即处理 0 min 时 HSP70 的转
录水平量较少,经内参校正后的标准含量仅为
0 . 000 009 58。 经高温(28℃ )胁迫以后,小麦
白粉菌 HSP70 的转录水平量增加,且在热激
30min 时即达显著性水平 ( P≤0 . 05 ) ,在热激
60 min 时达到最高峰,经内参校正后的标准含
量为 0 . 000 111,为对照样品的 11 . 6 倍。 随后,
HSP70 的转录水平量开始下降。
702
　
植物病理学报 43 卷
Fig. 1　 HSP70 cDNA sequences and deduced amino acid sequences
of Blumeria graminis f. sp. tritici
Note:The signature sequences of HSP70 family are underlined; the cytoplasmic HSP70 carboxyl
terminal region (EEVD) is shown in a grey box; The stop codon is indicated with asterisk.
802
　
　 2 期 　 　 邢淑莲,等:小麦白粉菌 HSP70 基因的克隆及高温胁迫对其表达的影响
Table 2　 Detection of HSP70 gene expression in Blumeria graminis f. sp. tritici
under high temperature stress
Processing
time / min
Initial copies / copies·μL -1
HSP70 18SrRNA
The ratio of initial copies
HSP70 / 18S rRNA
The relative expression
level of HSP70 gene
0 1. 26 ×105 ±8. 46 ×103 1. 31 ×1010 ±6. 12 ×108 0. 000 009 58 c 1
10 3. 73 ×105 ±3. 65 ×104 2. 37 ×1010 ±4. 35 ×108 0. 000 015 70 c 1. 64
30 1. 77 ×106 ±3. 84 ×105 3. 24 ×1010 ±9. 72 ×109 0. 000 054 50 b 5. 68
60 2. 42 ×106 ±4. 27 ×105 2. 18 ×1010 ±3. 61 ×108 0. 000 111 00 a 11. 6
120 1. 97 ×106 ±2. 11 ×105 2. 32 ×1010 ±7. 70 ×108 0. 000 085 10 ab 8. 89
Note: The data about initial copies in the table are mean ± SE. The means within the same column followed by different
letters are statistically significant at the 0. 05 level. The ratio of initial copies and relative expression levels of HSP70 gene
in the table are mean.
3　 讨论
本研究克隆了小麦白粉菌 HSP70 基因 cDNA
序列,翻译后得到的氨基酸序列含有 HSP70 蛋白
家族的 3 个典型标签 7-14( IDLGTTYS)、195-208
( IFDLGGGTFDVSLL ) 和 332-346 ( IVLVGG-
STRIP-RIQK),而且与其他真菌 HSP70 氨基酸序
列具有较高的同源性,同源性达 88% ~ 94% 。 因
此该基因编码的蛋白质属于 HSP70 蛋白家族。 另
外,在 C末端是高度保守的细胞质特异性 EEVD
调控基序,说明它是一种细胞质 HSP70。
热休克蛋白 HSP70 包括组成型 HSP70 和诱导
型 HSP70 两种类型,组成型 HSP70 在正常条件下
表达活跃,但不能对外界胁迫产生任何的响应,大
多对维持细胞基本生理功能和形态有重要作用;而
诱导型 HSP70 不含内含子,在正常生理条件下不
存在或表达量低,但能被强烈诱导起着保护机体的
分子伴侣作用[3]。 本研究克隆的小麦白粉菌
HSP70 基因在受到高温刺激后表达量迅速上升,
说明该基因是诱导型 HSP70 基因。
大量研究表明,诱导型热激蛋白的累积决定着
真核生物细胞的耐热性。 热激条件下,生物体大部
分正常蛋白的合成受到抑制,热激蛋白开始合成,
合成的热激蛋白可保护机体蛋白质免遭损伤或修
复已受损伤的蛋白质,从而对生物体起到保护作
用[4]。 本研究通过实时荧光定量 PCR 发现,28℃
高温处理 10 min 后,小麦白粉菌体内 HSP70 基因
的相对表达量就提高了 1. 64 倍,而且随着热激时
间的延长,表达量增大,因此推测 HSP70 基因在小
麦白粉菌耐高温中有重要作用。 但表达量在热激
120 min后下降,这可能是 HSP70 对机体的保护作
用不是无休止的,当应激超过一定强度时,变性蛋
白产生过多超过了 HSP70 的忍耐范围,影响细胞
功能,引起细胞死亡。 另外热激蛋白的大量合成需
要消耗大量的物质和能量,导致维持细胞正常生长
的蛋白质合成受阻,威胁细胞的生存[5]。 因此超
出一定范围后 HSP70 基因的表达量开始下降。
HSP70 基因的功能不仅和耐热有关,在生物
体受到其他不良环境(如低温、紫外胁迫等)影响
时,其表达量也会发生变化。 本研究只是研究了在
小麦白粉病菌中高温胁迫对其表达的影响,推测该
基因和小麦白粉菌抵抗高温胁迫有关。 至于该基
因是否和小麦白粉菌抵抗或耐受其他胁迫有关,还
需要进一步研究。 另外不同温度下,对温度敏感性
不同的小麦白粉菌之间 HSP70 基因的表达量是否
存在差异,也需要进一步研究证实。
参考文献
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Chinese) [J] . Ecology of Domestic Animal(家畜生
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责任编辑:曾晓葳
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