全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 42(5): 541-545(2012)
收稿日期: 2011-08-25; 修回日期: 2012-06-08
基金项目: 教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-07-0520); 国家自然科学基金资助项目(30871620)
通讯作者: 李向东,教授,主要从事植物病毒学及病害防治研究; E-mail: xdongli@sdau. edu. cn;
邵云华,副教授,主要从事林木病理学研究; E-mail: shaoyunhua@163. com。
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췍研究简报
棣棠丛枝病相关植原体的分子鉴定
常文程1, 李向东1*, 邵云华1*, 徐加利2, 竺晓平1
( 1 山东农业大学植物保护学院植物病理学系, 泰安 271018; 2 山东省泰安市植保站, 泰安 271000)
Molecular identification of the phytoplasma associated with kerria witches’ -broom
CHANG Wen-cheng1, LI Xiang-dong1, SHAO Yun-hua1, XU Jia-li2, ZHU Xiao-ping1 ( 1Department of Plant
Pathology, College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China; 2 Tai’an Plant Protection Sta-
tion, Tai’an 271000, China)
Abstract: By using universal primers for phytoplasmal 16S rRNA and tuf genes, two specific fragments of
1 243 bp and 842 bp in length were amplified with nested-PCR from the DNA of kerria showing witches’ -
broom symptom. The fragments were sequenced and subjected to identity and phylogenetic analysis. The re-
sults indicated that the 16S rRNA and tuf gene of phytoplasma isolate from kerria witches’ -broom (KWB)
shared the highest identities of 99. 4% and 99. 5% , respectively, with paulownia witches’ -broom phytoplasma
(PaWB) belonged to subgroup D of aster yellows group (16SrI-D) . In the phylogenetic trees constructed
with 16S rRNA and tuf genes, KWB was clustered with phytoplasmas of 16SrI-D. The 16S rRNA gene of
KWB had identical patterns with a 16SrI-D phytoplasma for Alu Ⅰ, Hha Ⅰ, Mse Ⅰ and Taq Ⅰ in the vir-
tual RFLP analysis. All these results indicated that the phytoplsama associated with kerria witches’ -broom was
belonged to the subgroup D of aster yellows group (16SrI-D) .
Key words: kerria; phytoplasma; 16S rRNA; nested-PCR; tuf gene
文章编号: 0412-0914(2012)05-0541-05
植原体(Candidatus Phytoplasma)是一种没有
细胞壁的原核微生物,主要由取食韧皮部的昆虫
(叶蝉、飞虱等)传播, 也可由菟丝子寄生和嫁接等
途径传播,常常引起植株黄化、丛枝、花器变态、萎
缩等症状。 迄今为止,世界上报道的植物植原体病
害有 1 000 余种,仅我国就有 100 多种,造成巨大
损失。
由于植原体尚不能进行体外培养,对其生物学
特性了解较少。 近年来,分子生物学的迅速发展极
大地推动了植原体的鉴定和分类研究。 植原体的
一些保守序列,如 16S rRNA 序列、核糖体蛋白基
因(rp)、延伸因子基因( tuf)、16S-23S rRNA 间区
序列(16S-23S rRNA space region)、转运蛋白基因
(SecY)等,在植原体检测和鉴定中的应用越来越
多[1]。 2004 年,国际比较菌原体学研究组 ( IR-
PCM )将植原体划分为 17 个组, 24 个候选种, 至
少 40 个亚组,并制订了相应的分类标准, 认为 16S
rRNA 基因核苷酸一致率低于 97. 5%的植原体就
可确认为不同种[1]。 有些植原体的 16S rRNA 基
因核苷酸一致率高于 97. 5% ,但是介体种类、寄主
种类特异性和症状等有明显不同, 也可定为不同
株系。
植物病理学报 42 卷
棣棠(Kerria japonica)为蔷薇科棣棠花属落
叶灌木,别名蜂棠花,原产我国华北至华南,对土壤
要求不严,性喜温暖、半阴之地,比较耐寒。 棣棠是
一种观赏植物,其花可入药,有消肿、止痛、止咳、助
消化等作用。 本文对表现丛枝症状的棣棠及与其
相关的植原体进行了鉴定。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试样品 表现丛枝症状的棣棠样品采自
山东五莲;阳性对照泡桐丛枝植原体(PaWB)由本
实验室保存。
1. 1. 2 主要试剂 克隆载体 pMD18-T 购自
TaKaRa公司,PCR产物回收试剂盒、聚合酶、连接
酶及其他分子生物学试剂产品均购自全式金公司。
1. 2 总 DNA的提取
取表现丛枝症状的棣棠枝条韧皮部,参照 Qi
等[2]的方法提取总 DNA,于 -20℃保存备用。
1. 3 16S rRNA和 tuf基因的 PCR扩增
利用巢式 PCR 扩增植原体 16S rRNA 和 tuf
基因。 其中 16S rRNA 先用通用引物 R16mF2 /
R16mR1 进行第 1 轮扩增,扩增产物按 1∶ 20 稀释
后取 1 μL为模板,用 R16F2 / R16R2 进行第 2 轮扩
增(表 1) [3,4]。 tuf 基因分别用通用引物 fTuf1 /
rTuf1 和 fTufu / rTufu[5] (表 1)进行第 1 轮和第 2
轮扩增。
1. 4 PCR产物的克隆与序列分析
PCR产物回收后连接 pMD18-T载体,连接产
物转化大肠杆菌 DH5ɑ 感受态细胞。 挑取平板上
的白色菌落培养,提取质粒。 经 PCR 鉴定为阳性
的重组质粒送上海博尚生物技术有限公司测序。
将所得序列输入 GenBank 进行 Blast 检索,利
用 DNASTAR和 DNAMAN进行核苷酸序列分析,
利用MEGA5. 0 构建系统进化树。 采用 pDRAW32
对所得到的 16S rRNA 序列与 GenBank 中相应序
列进行虚拟 RFLP分析。
2 结果与分析
2. 1 16S rRNA和 tuf基因 PCR扩增结果
以表现丛枝症状的棣棠总 DNA 为模板,经巢
式 PCR扩增其 16S rRNA 和 tuf 基因,得到了植原
体特有的长度约为 1. 2 kb 和 800 bp 的片段,而从
健康棣棠植株 DNA 中不能扩增出这些片段,说明
表现丛枝症状的棣棠中存在植原体。 此植原体命
名为棣棠丛枝植原体(Kerria witches’ -broom phy-
toplasma, KWB)。
2. 2 序列测定
通过测定 2 个 PCR 反应获得的 2 ~ 4 个克隆
的序列,确定了 KWB 的 16S rRNA 扩增片段含有
1 243个核苷酸(JN031513),G +C含量为 46. 98% ,
tuf基因扩增片段含 842 个核苷酸 ( JN033200),
G + C含量为 37. 89% 。
2. 3 16S rRNA和 tuf 基因的一致率和系统进化
分析
将 KWB与 GenBank中 18 个植原体分离物的
16S rRNA序列进行比对,发现 KWB 与其他组植
原体 16S rRNA序列的一致率较低,而与翠菊黄化
Table 1 Nucleotide sequences of primers used in amplifying 16S rRNA and tuf gene
Target sequence Primer name Primer sequence Tm / ℃ Reference
16S rRNA
R16mF2 5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′ 60 [3]
R16mR1 5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′ 60 [3]
R16F2 5′-ACGACTGCTAAGACTGG-3′ 55 [4]
R16R2 5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′ 55 [4]
tuf gene
fTuf1 5′-CACATTGACCACGGTAAAAC-3′ 53 [5]
rTuf1 5′-CCACCTTCACGAATAGAGAAC-3′ 55 [5]
fTufu 5′-CCTGAAGAAAGAGAACGTGG-3′ 55 [5]
rTufu 5′-CGGAAATAGAATTGAGGACG-3′ 53 [5]
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5 期 常文程,等:棣棠丛枝病相关植原体的分子鉴定
组(16SrI组)植原体一致率较高,其中与泡桐丛枝
植原体(PaWB)的一致率高达 99. 4% 。 根据 16S
rRNA核苷酸序列构建的系统进化树中, KWB 与
16SrI-D 亚组中的山药黄化植原体聚为一簇
(图 1)。
将 KWB与 GenBank中 11 个植原体分离物的
tuf基因核苷酸序列进行比对和系统进化分析。 结
果表明,KWB 与 16SrI-B 亚组的翠菊黄化植原体
和 16SrI-D 亚组的泡桐丛枝植原体 tuf基因核苷酸
序列一致率均为 99. 5% 。 但根据 tuf 基因核苷酸
序列构建的系统进化树中,KWB 聚类到 16SrI-D
亚组(图 2)。
2. 4 16S rRNA虚拟 RFLP分析
对 16S rRNA序列进行虚拟 RFLP分析:KWB
(图 3-A)与 16SrI-A 亚组的番茄巨芽病相关植原
体(图 3-B)和 16SrI-E亚组的蓝莓矮化病相关植原
体(图 3-F)有不同的 Hha Ⅰ酶切图谱;与 16SrI-C
亚组三叶草绿变病相关植原体 (图 3-D ) 和
16SrX组苹果丛簇病相关植原体(图3-G)有不同
Fig. 1 Phylogenetic tree constructed with the 16S rRNA sequences
of kerria witches’ -broom and other 18 phytoplasmas
Fig. 2 Phylogenetic tree constructed with the nucleotide sequences of tuf genes
from kerria witches’ -broom and other 11 phytoplasmas
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Fig. 3 Virtual RFLP analysis of 16S rRNA of phytoplasma associated
with kerria witches’ -broom and other closely related groups
MW: PhiX174 DNA-HaeⅢ DⅠgest; A: Kerria witches’ -broom; B: Tomato big bud (AY180955,16SrI-A);
C: Maryland aster yellow (AF322644, 16SrI-B); D: Clover phyllody (AY265217, 16SrI-C);
E: Dioscorea oppositifolia yellow (FJ263630,16SrI-D); F: Blueberry stunt (AY265213, 16SrI-E);
G: Apple proliferation phytoplasma (AJ542541,16SrX); H: Japanese Hydrangea phytolasma (D12581, 16SrXI) .
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5 期 常文程,等:棣棠丛枝病相关植原体的分子鉴定
的 Alu Ⅰ、Hha Ⅰ、Mse Ⅰ酶切图谱;与日本绣球绿变病相
关植原体(图 3-H)Alu Ⅰ、Hha Ⅰ、Mse Ⅰ、Taq Ⅰ酶切图谱
均不同。 KWB比 16SrI-B 亚组的马里兰翠菊黄化植原体
(图 3-C)少一个Mse Ⅰ酶切位点,而与 16SrI-D亚组山药黄
化植原体(图 3-E)的 Alu Ⅰ、Hha Ⅰ、Mse Ⅰ、Taq Ⅰ酶切图
谱均相同。
3 结论与讨论
IRPCM植原体 /螺原体工作组认为 16S rRNA
的核苷酸一致率低于 97. 5 %就可确认为不同候选
种。 本研究利用巢式 PCR 扩增到了与棣棠丛枝病
相关植原体(KWB)的 16S rRNA 和 tuf 基因,发现
KWB与 16SrI 组植原体 16S rRNA 基因的核苷酸
一致率均在 98 %以上,与泡桐丛枝植原体(16SrI-
D 亚组)一致率高达 99. 4% ;KWB 与泡桐丛枝植
原体 tuf 基因的核苷酸一致率为 99. 5% ,而且在根
据 16S rRNA 基因和 tuf 基因构建的系统进化树
中,KWB都聚类 16SrI-D 亚组中,说明与棣棠丛枝
病的相关植原体属于 16SrI-D 亚组。 这是关于棣
棠植原体病害的首次报道。
本文利用虚拟 RFLP 对棣棠植原体 16S rRNA
基因序列进行分析,发现 KWB 与山药黄化植原体
(FJ263630)有相同的 Alu Ⅰ、Hha Ⅰ、Mse Ⅰ、Taq
Ⅰ限制性酶切图谱。 进一步说明了棣棠丛枝植原
体属于 16SrI-D亚组。
参考文献
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责任编辑:于金枝
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