全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$#""")$"!*
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收稿日期$!"#$)"&)"(
&修改稿收到日期$!"#$)#")!(
基金项目$国家自然科学基金" %#!"##$%
#&海南省自然科学基金"
%#%",#
#&中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费重点项目
"
#,%""!!"##"!$# 作者简介$康桂娟"
#1(%
#!女!博士!助理研究员!主要从事橡胶树分子生物学研究
2)34.5
$640 77 8. - 840!"#" ! #!,+9:3 " 通信作者$曾日中!博士!研究员!主要从事橡胶树产胶生理生化与分子生物学研究
2)34.5
$;0<=< ! 45. > 80+9:3 巴西橡胶树 123!4$%
基因克隆和表达分析
康桂娟!黎
!
瑜!曾日中"
"中国热带农业科学院橡胶研究所!农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室和省部共建国家重点实验室培育基地
)
海南
省热带作物栽培生理学重点实验室!海南儋州
*&#&%&
#
摘
!
要$该研究以巴西橡胶树为实验材料!从橡胶树胶乳 9?@A 中克隆了 @AB 转录因子基因" !"#$%!$#完整开 放阅读框" CDE #!并通过酵母实验和实时荧光定量 FBD 技术!进行转录激活活性分析和表达分析结果显示$"
#
#
!"#$%!$
基因
CDE
为
##,&G
H
!编码
%((
个氨基酸!在
@
端第
&
"
#&$氨基酸之间含有一个典型的 @AB 结构域 " ! #酵母实验表明! IG@AB!$
具有转录激活活性!转录激活区在高度变异
B
端!具备了
@AB
转录因子的基本特
征"
%
#序列比对和系统进化分析表明!
IG@AB!$蛋白属于 @AB 转录因子家族中的 JKF 亚族"$
#实时荧光定
量
FBD
分析结果发现!
!"#$%!$
基因在叶中的表达量显著高于其他部位&割胶和茉莉酸"
LA
#处理均能够诱导
!"#$%!$
表达上调研究认为!
!"#$%!$
基因可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程
关键词$巴西橡胶树& @AB 转录因子&基因克隆&表达分析&转录激活活性 中图分类号$
M&(*
&
M&(,
文献标志码$A &"()*(!+, - .)//#"("0123!4$%1)()0."21)5)$2($6-*-)/6-6
NA@OO8.
-
840
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P4G:=4T:=
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7>
40XOS0ST.9DS/:8=9SYT.5.<4T.:0
%
ZT4TSNS
>
P4G:=4T:=
>
W=SSX.0
7
W4/S:UB85T.[4T.:0\F;
>
/.:5:
7>
U:=J=:
H
.945B=:
H
/
!
D8GGS=DS/S4=9;K0/T.T8TS
!
B;.0S/SA94XS3
>
:UJ=:
H
.945A
7
=.985T8=45Z9.)
S09S/
"
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!
B;.04
#
34/5.*65
$J;S];:5S: H S0=S4X.0 7 U=43S " CDE # /S ^ 8S09S:U!"#$%!$]4/95:0SXU=:39?@A:U!&&( ")(*+,+&-*+*54TS_ ! 40XT;ST=40/9=. H T.:04549T.[4T.:049T.[.T > 40XS_ H =S//.:0 H =:U.5S:UIG@AB!$]S=S94=)
=.SX:8T8/.0
7
DS45)T.3SFBD40X
>
S4/T4//4
>
/
>
/TS3+J;S=S/85T/.0X.94TSXT;4T
$" # # !"#$%!$;4/40CFD :U##,&G H ! S09:X.0 7 4 H =:TS.0].T;%((43.0:49.X/+KT ( /@)TS=3.045=S 7 .:0;4X49:0/S=[SX@ABX:34.0 U=:343.0:49.X&T:#&$+
"
!
#
QS4/T4//4
>
/;:]SXT;4TIG@AB!$H =:TS.0 H ://S//SXT=40/9=. H T.:04549T.[4) T.:049T.[.T > 40XT;S49T.[4T.:0X:34.0]4/5:94TSX.0T;S;. 7 ;5 > X.[S= 7 S0TB)TS=3.045=S 7 .:0.0 > S4/T4//4 > / > /TS3+ " % # ZS ^ 8S09S45. 7 03S0T40X H ; > 5: 7 S0ST.94045 > /./=S[S45SXT;4TIG@AB!$]4/43S3GS=:U4@AB
T=40/9=.
H
T.:0U49T:=U43.5
>
GS5:0
7
.0
7
T:JKF/8G
7
=:8
H
+
"
#
#
J;S=S45)T.3SFBD.0X.94TSXT;4TS_
H
=S//.:05S[)
S5:U!"#$%!$.05S4[S/]4//.
7
0.U.940T5
>
;.
7
;S=T;40T;4T.0:T;S=
H
4=T/:UT;S=8GGS=T=SS+J;SS_
H
=S/)
/.:0:U!"#$%!$.054TS_]4/.0X89SXG
>
T4
HH
.0
7
40X
-
4/3:0.949.X
"
LA
#
+J;S=S/85T//8
77
S/TSXT;4T!".
#$%!$34
>
GS.0[:5[SX.0=S/
H
:0/ST:/T=S//40XXS[S5:
H
3S0T45
H
=:9S//S/.0=8GGS=T=SS+
7)
8
9".!/
$!&&(")(*+,+&-*+* & @ABT=40/9=. H T.:0U49T:= & 7 S0S95:0.0 7 & S_ H =S//.:04045 > /./ & T=40/49T.[4T.:0 49T.[.T > !! 植物特有的 @AB " @AV ) AJAE# % ! 和 BYB! # 转录因子组成了植物基因组中最大的转录因子家族 之一!其典型特征是在编码蛋白的 @ 端具有一个由 大约 #," 个氨基酸残基组成的高度保守的 ?@A 结 合区*** @AB 结构域" @ABX:34.0 #!该结构域可 以分成从 A 到 2* 个亚结构域+#)!, @AB 蛋白的 B 端在氨基酸长度和组成上都存在极大差异!是转录 激活调控区+%)$,部分
@AB
转录因子的
B
末端还
具有跨膜结构域"
T=40/3S3G=40S3:T.U/
!
JV/
#!是
膜结合
@AB
转录因子+*)(,到目前为止!通过对基
因组的深入分析发现在拟南芥"
$)("+/0 1 *+*23(,+. (-( # + * ,中有 ##& 个 @AB 转录因子基因!水稻" 4) 5 . 6(*(2+( # + * ,有 #*# 个!毛果杨" 70 1 8,8*2)+9309(). 1 ( # + 1 ,有 #,% 个!大豆" :, 5 9+-&;(< # + #" ,有 #*! 个! 苹果" =(,8*/0;&*2+9( # + ## ,中发现 #(" 个!马铃薯 " >0,(-8;28"&)0*8; P+ # + #! ,中发现 ##" 个!粟米 " >&2()+(+2(,+9(P+ # + #% ,中有 #$&
个!番茄"
>0,(-8;
,
5
90
1
&)*+98;
#
+
#$,有 #"$
个!大白菜"
?)(**+9()(
1
(
P+//
H
+
1
&@+-&-*+*
#
+
&
,中有
!"$个!香蕉" =8*((98. ;+-(2( # + #* ,中有 #&! 个 @AB 转录因子不仅家族成员众多!还具有多种 生物学功能研究发现 @AB 家族转录因子广泛参 与调控植物体生长发育)生物和非生物胁迫应答以 及激素信号转导过程+!!$!,!#,)!%,大豆
:;#$%""$
可以通过促进生长素信号!抑制
AWA
信号!从而促
使侧根的发育!适应水胁迫环境+!#,
R;8
等+#,,研究
发现番茄
@AB
转录因子
>,#$%$
可以通过影响乙
烯合成和类胡萝卜素积累正向调控果实成熟过程
美国黑杨木材形成相关
@AB
转 录 因 子
72).
A#B#?.*
的过表达会促进纤维细胞壁增厚+#&,在
玉米胚乳中!
C;(#$%%, 与多种淀粉合成基因共表 达!其瞬时表达会引起淀粉合成相关基因的表达上 调+#(,研究还发现部分 @AB 家族转录因子的诱导 表达可显著提高植物体的耐旱)耐冷和抗盐能 力+#1)!"!$)!1,!以及对病虫害的抵御能力+%")%#,因此!
@AB
转录因子不仅是当前植物基因功能及表达网络
调控研究中的热点!而且已经成为通过基因工程技术
提高作物抗逆性和品质改良的重要候选基因+!$)!&!1, 本项目组根据前期从橡胶树胶乳的 9?@A 文 库得到的 2ZJ 序列!通过搜索橡胶树基因组! FBD 克隆验证!共得到了 %% 个巴西橡胶树 @AB 转录因 子基因生物信息学分析发现! !"#$%!$基因启 动子区域具有茉莉酸响应元件以及大量逆境胁迫诱 导相关的顺式调控元件!推测 !"#$%!$基因可能 参与了橡胶树逆境胁迫应答过程在此基础上!对 !"#$%!$读码框" CDE #进行了克隆验证和生物信 息学分析!利用酵母表达系统分析了该转录因子的 转录激活功能!并通过实时荧光定量 FBD 技术对其 表达特征进行了分析!为进一步研究 IG@AB!$
转
录因子的功能及其在橡胶树抗逆育种中的应用提供
依据
#
!
材料和方法
:+:
!
材
!
料
本实验所用植物材料均来自中国热带农业科学
院试验农场巴西橡胶树无性系-热研
&)%%)1&
(割
制为
#
%
!
树围)
%X
割
#
刀!无乙烯利刺激材料处
理$" # #采集正常割胶橡胶树的不同组织样品"叶) 花)树皮和胶乳#!直接置于液氮冻存!用于总 D@A 提取" ! #割胶处理选用成龄且树围已达到开割标 准的未开割橡胶树!按照正常割制! %X 割 # 刀!共采 割 & 次!采收第 # 刀)第$
刀和第
&
刀胶乳液氮冻
存!用于
D@A
提取"
%
#乙烯利和茉莉酸处理选择
成龄未开割橡胶树!在每株橡胶树割线下方涂
"+*`
乙烯利"
2J
#和
!
7
含
"+%`
茉莉酸"
LA
#的羊毛脂
"预先在橡胶树割线下方刮去外周木栓层#!涂水或
羊毛脂做为对照!在采胶前
(
)
%,
)
&!;
处理!同一时
间采集胶乳
:+$! 方 ! 法 :;$;:
!
总
<=3
提取和
6>=3
合成
!
橡胶树胶乳和
各个组织总
D@A
提取参照曾日中等+%!,的方法实
验所用
9?@A
根据
DS[S=TA.X
JV
E.=/TZT=40X9?)
@AZ
>
0T;S/./N.T
试剂盒说明!利用试剂盒内附带
的随机引物合成
9?@A
第一链和第二链
:;$;$
!
橡胶树
123!4$% 基因克隆及序列分析 ! 根据本项目组转录组测序得到的 !"#$%!$基因 2ZJ 序列!搜索巴西橡胶树基因组通过 OZ?Z 网 站" ;TT H$%%
7
/X/+9G.+
H
68+SX8+90
%
.0XS_+
H
;
H
#分析
基因内含子和外显子序列!拼接得到
!"#$%!$
基
因
CDE
"开放读码框#序列!并据此设计
CDE
克隆
的特异性引物
IG@AB!$E 和 IG@AB!$D
"表
#
#!
以反转录
9?@A
为模板克隆
!"#$%!$
基因
CDE
全长
FBD
反应条件为
1$a 预变性$3.0
&
1$a 变性 %"/ ! ,"a 退火 %"/ ! &!a 延伸 !3.0 ! %$
个循
环&
!a
延伸
#"3.0
扩增产物经
#+!`
凝胶电泳
回收后连接
H
V?)#(JbS9T:=
转化大肠杆菌感受态
细胞
?I*
#
!挑取阳性克隆测序
使用
@BWK
数据库中
CDEU.0XS=
"
;TT
H
$%% ]]]+ *&%! #! 期 !!!!!!!!!!!!! 康桂娟!等$巴西橡胶树
!"#$%!$
基因克隆和表达分析
表
:
!
本实验所用引物
J4G5S#
!
F=.3S=/8/SX.0T;./S_
H
S=.3S0T
引物名称
F=.3S=043S
序列
F=.3S=/S
^
8S09S
"
*c)%c
# 注释
A00:T4T.:0
IG@AB!$E IG@AB!$D
AJOOBAAOJJBAOJABAO
BAJOJAOJJBBJAAJJBA
读码框
FBD
扩增
A3
H
5.U.94T.:0:UCDE
FOWNW?)IG@AB!$)EE FOWNW?)IG@AB!$)ED
7!!88BAJOOBAAOJJBAOJABAO
77!844JBAJOJAOJJBBJAAJJBA
CDE
转录激活活性分析
J=40/49T.[4T.:049T.[.T
>
4045
>
/./:UCDE
FOWNW?)IG@AB!$)@E FOWNW?)IG@AB!$)@D
7!!88BAJOOBAAOJJBAOJABAO
77!844JOABJJJBBBJJBAAJJJAB
@ABX:34.0
转录激活活性分析
J=40/49T.[4T.:049T.[.T
>
4045
>
/./:U@ABX:34.0
FOWNW?)IG@AB!$)BE FOWNW?)IG@AB!$)BD
7!!88BOAOOOAAOBAOAAOJA
77!844JBAJOJAOJJBBJAAJJBA
B)
端转录激活活性分析
J=40/49T.[4T.:049T.[.T
>
4045
>
/./:UB)TS=3.045
DJ)IG@AB!$E DJ)IG@AB!$D
JOAABBJJOOOAJBJJBBJO
BBJOAJBBOJJJBOAAJOJJ
荧光定量
FBDDS45)T.3SFBD
DJ)IG#(Z=D@AE
DJ)IG#(Z=D@AD
OBJBOAAOABOAJBAOAJAB
JJBAOBBJJOBOABBAJAB
内参基因
DSUS=S09S
7
S0S
09G.+053+0.;+
7
:[
%
7
:=U
%
7
:=U+;T35
#分析
!"#$%!$
基
因序列
CDE
!并推导基因编码的氨基酸序列保守
功能域分析利用
@BWK
的
B??
数据库"
;TT
H
$%% ]]]+ 09G.+053+0.;+ 7 :[ % ZT=89T8=S % 9XX % ]= H /G+9 7 . #和 K0TS=) F=:Z940$
软件"
;TT
H
$%% ]]]+SG.+49+86 % J::5/ % H U4 % . H =/940 %#通过 ?@AVA@ " [*+#" #和 V2OA*+# 软 件" ]]]+3S 7 4/:UT]4=S+0ST #进行多重并构建系统进 化树 :;$;?
!
@4=3&$% 转录因子的转录激活活性分析 ! 转录激活活性分析方法参照 R;40 7 + #( ,和 Q8 + #1 , 根 据保守功能域预测 IG@AB!$
完整编码序列"
IG)
@AB!$)E #) @ 端 @AB 域" IG@AB!$)@
#和
B
端
"
IG@AB!$)B #序列片段设计 FBD 克隆引物"表 # #将 IG@AB!$)E
)
IG@AB!$)@ 和 IG@AB!$)B
序列片段分别插入到酵母表达载体
H
OWNJ&
中的
OAP$?@A 结合域" OAP$W?
#通过转化酵母
Q!IO:5X
后 获 得 融 合 表 达 蛋 白
H
OWNJ&)IG)
@AB!$)E ) H OWNJ&)IG@AB!$)@
和
H
OWNJ&)IG)
@AB!$)B 将 FBD 鉴定的重组转化子和 H OWNJ& 空载对照接种到 Z? % )J= H ) Z? % )J= H % )I./ % )AXS 和 Z? % )J= H % )I./ % )AXS % d) # ) 7 45 "$"
$7 % 3P #培养基 上! %"a 倒置培养 % " *X !通过观察它们在不同缺 陷型培养基上的生长情况分析各个融合表达蛋白的 转录激活活性 :;$;%
!
123!4$% 基因的表达分析 ! 利用实时荧 光定量 FBD 技术分析 !"#$%!$基因在不同组织) 割胶)乙烯利和茉莉酸刺激下的表达模式参照 P. 等+%%,!以 !"#(>)D#$
作为内参基因!同时进行定
量分析!所用引物见表
#
采用
J464=4
公司实时荧
光定量
FBD
试剂盒
ZQWDF=S3._2_E(
F
JV
%
"
FS=US9T
DS45J.3S
#!在
WKC)DA?
公司的
BEd1,DS45)J.3S
Z
>
/TS3
进行荧光定量!数据采用
!

##
%
J方法分析!采
用
?FZ
软件"
b&+"*
#进行显著性分析
!
!
结果与分析
$;: ! 橡胶树 123!4$%
基因克隆及序列分析
根据巴西橡胶树
!"#$%!$
基因
2ZJ
序列及
搜索橡胶树基因组结果!设计
CDE
序列扩增引物!
通过
FBD
扩增与测序获得巴西橡胶树
!"#$%!$
的完整读码框!经过分析该基因的
CDE
为
##,&
G
H
!其编码由
%((
个氨基酸组成的蛋白质!推测蛋
白质的分子量为
$%+*(%6? 用 @BWKB?? 数据库 和 K0TS=F=:Z940$
软件分析发现!该蛋白在第
&
"
#&$氨基酸之间存在一个 @AB 类转录因子特有的 @AB 保守结构域"图 # # 用 @S. 7 ;G:=) - :.0T.0 7 方法构建 IG@AB!$
与
其他植物
@AB
蛋白系统进化树系统进化分析中
#&
个分属于
@AB
家族转录因子不同亚族的
@AB
蛋白均来自
@BWK
蛋白数据库
@AB
转录因子的
归类依照
C:64
方法+%$,系统进化树结果"图 ! #显 示 IG@AB!$
与拟南芥
@AB
转录因子
JBb).0TS=)
49T.0
7H
=:TS.0
"
JKF
#同属于
JKF
亚族
根据系统进化树结果!通过
?@AVA@b*+#"
对
IG@AB!$和与之关系较近的拟南芥 @JP( 和 JKF !粟米 Z.@AB 和大麦 I[K?2E!@AB 蛋白进行 多重比对!结果"图 % #发现这些蛋白 @ 端高度保守 的 @AB 结构域可以划分 A " 2* 个亚结构域!而在 B 端存在较大差异这与已报道的 @AB 结构特点 相符合+#)!,$;$! 橡胶树 @4=3&$%
在酵母中的转录激活活性
分析
具有转录激活域和转录激活活性是一个转录因
子最基本的特征
C:64
等+%$,提出 @AB 蛋白家族 的 转录激活域是在 B 末端为了检测 IG@AB!$
,&%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 图 # ! !"#$%!$基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列 下划线部分为 @AB 保守结构域& " 为终止密码子 E. 7 +# ! @895S:T.XS/S ^ 8S09S40XXSX89SX43.0:49.X/S ^ 8S09S:U!"#$%!$U=:3!G")(*+,+&-*+* J;S@ABX:34.0./80XS=5.0SX & " 3S40//T: H 9:XS:U43.0:49.X/ 图 ! ! IG@AB!$
与其他植物
@AB
蛋白系统进化树
左边数字表示
W::T/T=4
H
[458S
&括号内为氨基酸登录号&框中标示为橡胶树
@AB
转录因子
E.
7
+!
!
F;
>
5:
7
S0ST.9T=SS:UIG@AB!$].T;:T;S=@ABT=40/9=. H T.:0U49T:=/U=:3X.UUS=S0T H 540T/ @83GS=/:0T;S5SUT3S40W::T/T=4 H [458S & J;S499S//.:0@:+]4/ 7 .[S0.0G=496ST/ & IG@AB!$./34=6SXG
>
G:_
&&%!
#!
期
!!!!!!!!!!!!!
康桂娟!等$巴西橡胶树 !"#$%!$基因克隆和表达分析 图 % ! IG@AB!$
与其他
@AB
蛋白的多重比对
A
"
2+
标出
@AB
结构域中的
*
个保守亚结构域
E.
7
+%
!
V85T.
H
5S/S
^
8S09S45.
7
03S0T:UIG@AB!$40X/:3S:T;S=@AB H =:TS.0/ J;S5:94T.:0/:UT;SU.[S;. 7 ;5 > 9:0/S=[SX/8GX:34.0/ " AT:2 # 4=S80XS=5.0SX 转录激活活性! H OWNJ&)IG@AB!$)E
)
H
OWNJ&)
IG@AB!$)@ ) H OWNJ&)IG@AB!$)B
融合表达蛋白
以及
H
OWNJ&
空载对照转化酵母菌株
Q!IO:5X
将
阳性转化子分别接种到
Z?
%
)J=
H
)
Z?
%
)J=
H
%
)I./
%
)
AXS
和
Z?
%
)J=
H
%
)I./
%
)AXS
%
d)
#
)
7
45
培养基上培养
结果"图
$#显示!在 Z? % )J= H 培养基上! H OWNJ&)IG) @AB!$)E
)
H
OWNJ&)IG@AB!$)@ ) H OWNJ&)IG) @AB!$)B
和空载对照均能正常生长!而在
Z?
%
)J=
H
%
)
I./
%
)AXS
培养基上只有
H
OWNJ&)IG@AB!$)E 和 H OWNJ&)IG@AB!$)B
能正常生长!且在
d)
#
)
7
45
存
在时显示蓝色这说明
IG@AB!$编码的蛋白含有 转录激活域!能够与载体中的 OAP$?W
结合激活报
告基因的转录通过对基因全长!
@AB
域端或
B
端的缺失确定
IG@AB!$的转录激活域是在 B 末 端"图$
#
$;? ! 123!4$%
基因表达分析
分析
!"#$%!$
基因在橡胶树不同组织中的
表达特性!荧光定量结果"图
*
!
A
#显示!该基因在橡
胶树胶乳)树皮)雌花)雄花及叶片中均表达!在胶乳
中的表达量较低!叶片中的表达量最高!是胶乳中表
达量的
("
余倍
分析割胶对
!"#$%!$
基因表达的影响水平!
(&%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 图$
!
IG@AB!$转录激活活性分析 E. 7 +$
!
J=40/49T.[4T.:049T.[.T
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巴西橡胶树作为天然橡胶的主要经济来源!对
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转录因子的研究已有报道邱琼等+%*,从巴
西橡胶树无性系
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康桂娟!等$巴西橡胶树 !"#$%!$基因克隆和表达分析 B末端!与已报道的 @AB 转录因子特征相符+#)!,这 表明 IG@AB!$
是一个
@AB
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树中发挥转录因子的功能系统进化分析显示
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@AB!$转录因子与拟南芥 JKF 同属于 JKF 亚家 族已有研究表明 JKF 通过与芫菁皱缩病毒" T8=) 0. H 9=.065S[.=8/ ! JBb #外壳蛋白相互作用!不仅可 以调控拟南芥中 JBb 的累积速率!还影响了水杨 酸途径和其它防御反应信号的正确传导!在宿主防 御反应中发挥重要作用!是针对 JBb 基础防卫反 应中的一个关键因子+%()%1, 割胶具有机械伤害和排胶双重作用!随着割胶 刀次增加 !"#$%!$表达上调!推测其可能参与橡 胶树的胁迫应答和胶乳再生的调控过程 LA 不仅 对植物次生代谢具有重要调控作用!而且还是病原 微生物)激发子及诱导植物防卫基因表达的信号分 子天然橡胶的生物合成过程是一种典型的植物类 异戊二烯次生代谢!前人研究发现 LA 能够诱导橡 胶树的乳管分化并促进橡胶生物合成+$")$#,!本研究 中! LA 处理后 !"#$%!$的表达先下调后显著上 调!推测可能参与了橡胶树的胶乳代谢和防卫反应 过程本研究分离获得了一个巴西橡胶树 JKF 亚 家族 @AB 转录因子!并对其转录激活功能和表达 特征进行了分析!这为进一步研究 @AB 转录因子 在橡胶树生长发育)胁迫应答和胶乳代谢中的功能 奠定了基础 参考文献! + # , ! FYDA@KNZ ! ZAIYFF ! ZDKbAZJAbAFZ ! &2(,+@AB H =:TS.0/$
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