全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(5): 546鄄550(2011)
收稿日期: 2010鄄12鄄28; 修回日期: 2011鄄05鄄22
基金项目: 国家自然科学基金项目(30971875); 国家公益性行业(农业)科研项目(201003067)
通讯作者: 王中康,教授,主要从事分子微生物学研究; Tel: 023鄄65120489, E鄄mail: zkwang646@sina. com。
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研究简报
柑橘黄龙病兼性厌氧型伴生细菌的
分离及优势菌群分析
李颜方1, 殷幼平1, 王玉玺2, 李 佳1, 陈世伟3, 王中康1*
( 1重庆大学生物工程学院基因工程研究中心, 重庆 400030; 2农业部全国农业技术推广服务中心, 北京 100126;
3广西利添生物科技发展(合浦)有限公司, 北海 536128)
Isolation of facultative anaerobic and entophytic bacteria companioned Huanglong鄄
bing pathogen鄄infected citrus tissues and determination of dominant bacterial
populations摇 LI Yan鄄fang1, YIN You鄄ping1, WANG Yu鄄xi2, LI Jia1, CHEN Shi鄄wei3, WANG
Zhong鄄kang1 摇 ( 1Bioengineering College, Chongqing University, Chongqing 400030, China; 2Ministry of Agriculture,
Agricultural Technique Extension and Service Center, Beijing 100126, China; 3Lucky Team Biotech Development (Hepu)
Ltd.,Co. Hepu,Beihai 536128, China)
Abstract: To analyze the diversity of entophytic bacteria and find the companion microbe in Huanglongbing
pathogen鄄infected and healthy citrus plant tissues, various parts of citrus tissues were collected from different
locations of citrus planting areas. The facultative anaerobic and entophytic bacteria were isolated and identified
based on bacterial morphology, physiology, biochemistry characteristics and PCR鄄DGGE analysis (denaturing
gradient gel electrophoresis, analysis of the sequence of 16S rRNA V6鄄V8 fragment) . By the directional isola鄄
tion of the facultative anaerobic and entophytic bacteria and 16S rDNA amplification methods, total 12 genera
of bacteria were identified from 19 cultivable bacterial populations. The dominant bacterial population were
Bacillus sp. ( IF: 21. 03% ), Planococcus sp. ( IF:20. 69% ) and Pseudomonas sp. ( IF:17. 44% ) in healthy
citrus tissues, while Curtobacterium sp. ( IF: 29. 07% ), Bacillus sp. ( IF: 23. 12% ), Microbacterium sp.
( IF: 21. 09% ) in infected citrus plants. Based on the results of DGGE, 9 genera of cultured bacteria were
identified. The dominant bacteria population was Serratia sp. ( IF: 28% ), and Pantoea sp. ( IF: 14% )was
second only to it. ‘Candidatus Liberibacter asiaticus爷 was found only in tangerine pith of deformed orange
fruit, which suggested that the contents( > 1% )of Huanglongbing were more in diseased fruits. The density
and species of entophytic bacteria were also observed in remarkable difference between infected and healthy
citrus plants according to the DGGE profiles.
Key words: Huanglongbing; entophytic bacteria; directional isolation; 16S rDNA diversity analysis;
文章编号: 0412鄄0914(2011)05鄄0546鄄05
摇 摇 柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的
病害,主要由难人工培养的韧皮杆菌所引起
(Candidatus Liberibacter asiaticus) [1]。 近年的研
究结果表明黄龙病发病组织内除了韧皮杆菌外,还
摇
摇 5 期 李颜方,等:柑橘黄龙病兼性厌氧型伴生细菌的分离及优势菌群分析
可能有促进或抑制黄龙病菌生长的伴生性细
菌[2,3]。 国内外已有不少关于植物内生细菌的研
究报道[4],但关于柑橘内生细菌的报道较少。 本
研究旨在以多年生发病与健康柑橘植株的内生细
菌为研究对象,采用定向分离方法培养兼性厌氧型
内生细菌,利用基于 16S rRNA 的 PCR鄄DGGE 宏
基因组学方法分析比较柑橘健株与病株内生菌群
的差异,旨在发现与黄龙病伴生的功能性内生细
菌。
1摇 材料与方法
试验用的材料采自广东、贵州、福建、云南、浙
江、广西六省市的柑橘黄龙病区,包括发病和健康
样品。 以柑橘植株的叶片中脉、根韧皮部、枝条韧
皮部、树皮韧皮部、果实桔络为分离对象,分离纯化
柑橘植株的内生细菌。 对优势菌进行形态和生理
生化测定以及基于 16S rDNA的分子鉴定,并按可
数性原则对平板上的目标菌落计数,同类型菌落与
总菌落数的比例为该菌属的相对丰度。
内生菌菌落丰富度( cfu·g -1 FW) = 平板菌
落数 伊稀释倍数 伊102
对柑橘内生细菌进行 16S rDNA鄄DGGE 分析:
取来自广西合浦县的病健柑橘植株样品进行表面
灭菌,分别提取叶片中脉、根韧皮部、枝条韧皮部、
树皮韧皮部、果实桔络的内生细菌基因组 DNA,进
行 PCR鄄DGGE 分离。 使用软件 Quantity One鄄1鄄D
分析柑橘内生细菌 DGGE 分离图像。 因为 DGGE
分离得到的条带的亮度与 DNA 含量呈正比关系,
所以利用每个条带的亮度值对该列所有条带平均
亮度值的比值 Pi,计算 Shannon鄄Weaver 多样性指
数(H) [5]。
H = -鄱pilnpi
数据分析采用 DPSv3. 01 软件数据处理系统,
显著性分析采用 Duncan新复极差法。
2摇 结果和分析
2. 1摇 柑橘兼性厌氧型内生细菌的分离鉴定结果
对分离得到的内生细菌根据菌落形态和菌体
差异纯化和镜检,最终获得 19 株可培养的兼性厌
氧型内生细菌。 对优势菌进行形态和生理生化测
定以及基于 16S rDNA的分子鉴定,结果表明其属
于 12 个属。 菌株 GX21、GX34 为 Kluyvera sp. 菌
属;菌株 GX22、GX24、GX35、GX36 为芽孢杆菌属
(Bacillus sp. );菌株 GX23 为短芽孢杆菌属(Bre鄄
vibacillus Shida);GX25 属于动性球菌属(Plano鄄
coccus sp. );GX26 为 Pseudoclavibacter helvolus;
GX27 为微杆菌属(Microbacterium sp. );GX28 为
Tatumella 菌 属; GX29、 GX39 是 假 单 胞 菌 属
(Pseudomonas sp. );GX30、GX31、GX33 是短小杆
菌属;GX32 属于泛菌属(Pantoea punctata),GX37
属于克雷伯菌属;GX38 属于肠杆菌(本实验室在
前期研究中得到 20 株好氧型内生细菌,本研究中
得到的兼性厌氧型细菌在前期编号基础上顺次排
序)。 不同样品之间内生细菌的菌落数量范围为
2. 19 伊104 ~ 1. 33 伊106 cfu·g -1FW (表 1)。 由表
1 可知,内生细菌在柑橘不同组织的菌落数和种群
数量均有差异,其中以病根中内生细菌类群最多,
种群密度也最大,多达 1. 33 伊 106 cfu·g -1 FW。
感病柑橘植株内生细菌菌落数量远大于健康植株
组织。 样品的内生细菌菌落数量与种群数量之间
没有必然的线性关系。
Table 1摇 Distribution of entophytic bacteria in the healthy and Huanglongbing
pathogen鄄infected citrus plants
Sample
Bacterial colony No. (cfu·g -1 FW) Species of entophytic bacteria
Infected Healthy Infected Healthy
Midrib 2. 76 伊105 8. 12 伊104 16 14
Root 1. 33 伊106 2. 11 伊105 18 15
Stern 6. 79 伊105 2. 19 伊104 14 12
Bark 8. 33 伊105 2. 33 伊104 15 14
Fruit 8. 19 伊105 1. 07 伊105 16 13
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2. 2 摇 内生细菌优势种群在健康和感病植株中的
分离频率
对 56 份来自广东、贵州、福建、云南、浙江、广
西六省区的柑橘样品组织经共计 250 次分离,对分
离到的内生细菌纯化后进行分类,计算不同类型菌
属的分离频率(图 1)。 病株中短小杆菌属( IF:
29. 07% )、芽孢杆菌属( IF: 23. 12% )、微杆菌属
( IF: 21. 09% )分离频率比较高,短小杆菌属是病
株中的最优势菌属;健株中芽孢杆菌属 ( IF:
21郾 03% )、动性球菌属( IF: 20. 69% )、假单胞菌属
( IF: 17. 44% )分离频率比较高。 芽孢杆菌属在病
健植株组织中出现的频率都比较高,是柑橘内生细
菌的优势菌属。 假单胞菌属在健康植株内生细菌
中所占的比例大于病株,而短小杆菌属在病株中的
含量大大增加,说明柑橘发病对其内生菌群组成及
优势菌类别都有明显影响。
Fig. 1摇 Isolation frequency of dominant ento鄄
phytic bacteria in healthy and Huang
longbing pathogen鄄infected citrus
plants
A: Pseudomonas sp. ; B: Curtobacterium sp. ; C: Mi鄄
crobacterium sp. ; D: Bacillus sp. ; E: Planococcus sp. ; F:
Others. DS: Diseased samples; HS: Healthy samples.
2. 3 摇 柑橘内生细菌的变性梯度凝胶电泳
(DGGE)图谱分析
对柑橘内生细菌的 DGGE 图谱进行分析(图
2),结果表明,感病和健康柑橘植株不同组织包含
的不可培养细菌类群存在较大差异。 DGGE 分析
的不同样品的条带数较少,这可能是用 EB 染色灵
敏度较低所致。 对各组织样品中 50 条明显的条带
测序比对发现,共包含 9 个属 15 种不同的细菌类
群,包括沙雷氏菌属(28% ),泛菌属(14% ),不动
杆菌属 ( 10% ),节细菌属 ( 8% ),诺卡氏菌属
(10% ),黄单胞菌属(10% ),假单胞菌属(8% ),甜
菜果胶杆菌 Pectobacterium betavasculorum(6% ),
亚洲韧皮杆菌 ‘Candidatus Liberibacter asiaticus爷
(2% ),Uncultured bacterium clone (4% )。 条带 4
和条带 8 在感病和健康柑橘图谱中均稳定存在,测
序结果表明二者分别是诺卡氏菌属和节杆菌属。
条带 11 和 12 分别代表黄单胞菌属和假单胞菌属,
只在病株的图谱中存在。 条带 13 在病果中出现,
序列测定显示为柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberi鄄
bacter asiaticus)。 DGGE 图谱中只有占样品菌群
总量 1%以上的细菌才能出现条带[5],因此可以表
明,发病植株病果中黄龙病菌含量是最高的,而根、
叶、树皮等组织中的带菌量并不大。 Shannon鄄
Weaver多样性指数分析各组织中细菌多样性可
知,病根中细菌的多样性最高达到 2. 5,健果的细
菌多样性最低为 1. 90,表明病根的内生细菌菌群
比较丰富(P <0. 05)(图 3)。
3摇 讨论
本研究分离了广东、贵州、福建、云南、浙江、广
西六省市的样品,结果表明柑橘植株组织内存在丰
富的兼性厌氧型内生细菌,但发病与健康柑橘植株
的内生细菌,同种样品的不同组织中内生细菌的数
量、种类及优势属都存在差异。 菌群丰富度依次为
病根 >病树皮 >病果 >病枝条 >健根 >健树皮 >
病叶 >健枝条 >健叶 >健果。 感病柑橘植株内生
细菌菌落丰富度大于健康植株,可能由于黄龙病菌
的侵染,引发了与之有互作关系的菌量增加[3]。
PCR鄄DGGE分离的黄龙病感病柑橘植株先经
实时荧光定量检测验证为阳性,在对 DGGE 图谱
的分析中发现,只在病果 DGGE 图谱条带测序中
发现 ‘ Candidatus Liberibacter asiaticus 爷。 采用
PCR鄄DGGE方法,只有分离效率占样品菌群总量
1%以上的细菌才能在 DGGE 图谱中出现条带,表
明病果组织中黄龙病菌的含量最高,柑橘其他组织
中黄龙病菌的丰度远远低于病果,因此罹病果实组
织可以作为黄龙病菌人工培养的首选试验材料。
16S rDNA鄄DGGE 方法与常规培养方法得到
的细菌种群类型相比,结果差别比较大。 以定向分
离培养方法得到的兼性厌氧型内生细菌,优势菌属为
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摇 5 期 李颜方,等:柑橘黄龙病兼性厌氧型伴生细菌的分离及优势菌群分析
Fig. 2摇 DGGE analysis of 16S rDNA fragments of different citrus plant samples
A: Original DGGE profile of entophytic bacteria of citrus plants; B: Original profile labeled by Quantity One鄄1鄄D software and
red bands corresponding to black鄄white bands were excised from the gels for sequence analysis. DL: Leaf vein of diseased sam鄄
ple; HL: Leaf vein of healthy sample; DR: Root of diseased sample; HR: Root of healthy sample; DS: Stem of diseased sam鄄
ple; HS: Stem of healthy sample; DB: Bark of diseased sample; HB: Bark of healthy sample; DF: Fruit of diseased sample;
HF: Fruit of healthy sample.
Fig. 3摇 Shannon鄄Weaver of different citrus plant samples
DL: Leaf vein of diseased samples; HL: Leaf vein of healthy samples; DR: Root of diseased samples; HR: Root of healthy
samples; DS: Stem of diseased samples; HS: Stem of healthy samples; DB: Bark of diseased samples; HB: Bark of healthy
samples; DF: Fruit of diseased samples; HF: Fruit of healthy samples(P <0. 05) .
芽孢杆菌属和短小杆菌属, PCR鄄DGGE 分析结果
显示沙雷氏菌属、泛菌属为优势菌属。 这表明分离
培养方法获得的细菌并不一定是样品中的优势种。
这种现象与非培养方法中 DNA 提取时有些革兰
氏阳性细菌破壁困难,PCR 偏差,及分离培养时一
些细菌容易在特定培养基平板中生长有关。 基于
定向分离得到的细菌尽管多样性有限,但是可以得
到纯培养菌株,能够对功能菌株进行研究。 将定向
分离兼性厌氧菌与 PCR鄄DGGE 结合使用,弥补分
离培养无法分析不可培养细菌的不足,可以更深入
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摇
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的研究柑橘内生细菌群落的多样性。
参考文献
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L. africanus爷, and ‘Ca. L. americanus爷 associated
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责任编辑:
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李晖
《耕耘鄄章琦稻病抗性研究选集》简介
章琦研究员是我国著名植物病理学家,从 20 世纪 70 年代初,开始从事水稻病害综合防治和抗病
育种;80 年代以来,随着国内外水稻抗病性研究的发展,从寄主和病原菌两个层面开展交叉、并行研
究,形成了一套水稻抗病性遗传改良应用基础研究系统。
章琦研究员追求真知,独辟蹊径、勤于思考、著述颇丰。 计有 61 篇论文选入本书,见证了作者近
半个世纪以来在科研工作中承前启后、勤奋耕耘的历程。 它涵盖了水稻抗病育种、抗性遗传研究、抗
病新基因的鉴定与应用、白叶枯病致病性分化及群体遗传结构等内容,并从其专著《水稻白叶枯病抗
性的遗传及改良》中,选择了本人撰写的部分论文。 这是一部综合植物病理、遗传、分子生物技术等
学科,论述了水稻对主要病害的抗性及其遗传改良的理论结合实践的著作;也包括了经作者整理、分
析、概括,将国内外学者一个多世纪来,对水稻白叶枯病抗性遗传改良的理解与阐述。 《选集》还对研
究立项、选材和方法、分析与展望等方面加以详尽表述。 多数论文兼具中英文摘要和图表。 是一部农
业科学研究院校从事作物抗病性遗传研究师生及相关专业学者的良师益友。 全书图文并茂,也附加
作者研究和学术活动经历照片,反映了作者刻苦专研、永不言弃、开拓研究的耕耘人生,或许对青年学
子奋发图强有所启迪。
该书为平装 16 开本,105 万字,单价 110. 00 元。 中国农业出版社 2010 年 7 月出版。 ISBN978鄄7鄄
109鄄14524鄄5。 需要者可向中国农业出版社订购。 地址:北京市朝阳区麦子店街 18 号 楼,邮政编码:
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