全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(5): 542鄄545(2011)
收稿日期: 2010鄄10鄄12; 修回日期: 2011鄄06鄄20
通讯作者: 张 猛,河南省特聘教授,主要从事真菌分类和植物真菌病害研究; Tel: 13526799036, E鄄mail: zm20066@126. com。
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研究简报
河南省一例西瓜果实腐烂病病原鉴定
王昌亮, 武海燕, 张 猛*
(河南农业大学, 郑州 450002)
Identification of pathogenic fungus of watermelon fruit rot in Henan Province
WANG Chang鄄liang, WU Hai鄄yan, ZHANG Meng摇 (Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)
Abstract: In September of 2009, watermelons stored in low temperature conditions for 7 days were rotted
and caused above 90% losses in Kaifeng. The fungus was isolated from diseased tissues and the morphological
characteristics, pathogenicity and DNA sequence of 5. 8S rDNA鄄ITS were studied. The fungus was identified
as Colletotrichum orbiculare based on the morphological characteristics. DNA sequence of 5. 8S rDNA鄄ITS of
the isolate was 100% homologous with the other 5. 8S rDNA鄄ITS sequences of C. orbiculare in GenBank. In鄄
oculated watermelon with this isolate could produce the same symptoms as naturally infected plants. Reisola鄄
tion of the fungus from lesions on inoculated fruit confirmed that the causal agent was C. orbiculare which
caused watermelon rot during the storage period.
Key words: watermelon; post鄄harvest disease; anthracnose; pathogen identification; 5. 8S rDNA鄄ITS
文章编号: 0412鄄0914(2011)05鄄0542鄄04
摇 摇 西瓜营养丰富、甘味多汁、清爽解渴,堪称“夏
季水果之王冶。 我国西瓜生产面积和产量均居世
界第一,西瓜已成为我国重要的经济作物之一。 近
年来,由于连作重茬,导致西瓜病害日益加重,严重
制约西瓜产业的发展[1]。 瓜类炭疽菌[Colletotri鄄
chum orbiculare (Berk. & Mont. ) Arx]引起的西
瓜腐烂病几乎在世界各瓜区均有发生,一旦发病就
会造成严重的损失[2]。 以往对炭疽病病原的分
类、鉴定,主要是基于形态学特性、致病性测定的传
统方法。 近年随着分子技术的广泛运用,炭疽菌的
分子检测方法日益完善,炭疽菌的部分种 C. acu鄄
tatum、C. gloeosporioides和 C. fragariae ITS 序列
分析均已设计出特异性引物,提高了检测速度[3];
利用 ITS 序列分析及 RAPD 转 SCAR 标记对 C.
orbiculare设计出 2 对引物,建立了双重 PCR 反应
检测体系[4]。 我国对西瓜炭疽病的鉴定和检测主
要在苗期和生长期,冷库贮藏期的西瓜炭疽病病原
鉴定及检测报道较少。
2009 年 9 月,河南开封一低温贮藏库西瓜贮
藏 7 d后发生腐烂,病瓜率达 90%以上,损失巨大。
该批西瓜入库时均表面光滑,无发病症状,7 d 后
发现症状:初期西瓜表面有隆起的淡绿色小点,近
圆形,随后为黄褐色,或暗褐色,病斑凹陷,后期表
面有褐色黏稠物,病处裂开(图 1)。 为了确定引起
该批西瓜腐烂的病原,对样品分别进行保湿培养和
组织分离,纯化病原物,同时进行致病性检测;形态
观察鉴定和核糖体 5. 8S rDNA鄄ITS的序列分析。
1摇 材料与方法
1. 1摇 病原物的分离培养与保存
1. 1. 1摇 病原菌的分离摇 (1)发病严重的果面直接
挑取孢子黏团分离病原;(2)发病相对较轻的病斑
进行常规的保湿培养后分离病原;(3)刚发病的果
面采用常规组织分离法,分离病原。 将分离得到的
摇
摇 5 期 王昌亮,等:河南省一例西瓜果实腐烂病病原鉴定
全部菌株纯化后,保存于 4益冰箱备用。
1. 2摇 致病性检测
用 70%的酒精对从市场上买到的健康西瓜进
行表面消毒,用直径 3 mm 的打孔器打取培养 7 d
后的菌落边缘,将打取的菌饼分别接种于针刺和未
针刺的健康西瓜果皮表面,并用无菌的培养基贴到
西瓜表面做对照,每个处理重复 10 次,接种后的西
瓜室温内保湿培养,5 d后观察。
1. 3摇 病原菌鉴定
纯化后的病菌接种于 PDA平板。 26益恒温,12
h光照 /黑暗条件下培养 5 d 后观察病菌菌丝生长、
菌落形态、大小、颜色;待平板长出分生孢子盘时制
作玻片,Olympus BX40 显微镜下观察分生孢子盘、
分生孢子梗、分生孢子的形态特征,鉴定病菌。
1. 4摇 5. 8S rDNA鄄ITS的 PCR扩增与测序
1. 4. 1摇 DNA的提取 摇 将单孢纯化的病原菌菌株
放在铺有玻璃纸膜的 PDA 培养基上,培养 7 d 后
收集玻璃纸膜上的菌丝,菌丝经干燥冷冻后低温保
存,用于后续研究。 保存的菌丝用液氮研磨后按照
DNA小量提取试剂盒(产品编号:DK621,上海莱
枫生物技术有限公司) 步骤提取基因组 DNA。
1. 4. 2 摇 5. 8S rDNA鄄ITS 的 PCR 扩增 摇 选择真菌
通用引物:ITS1 和 ITS4 扩增 5. 8S rDNA鄄ITS全序
列及 18S rDNA和 28S rDNA的部分序列。 扩增反
应体系 25 滋L:12. 5 滋L 2 伊 Taq PCR Master Mix
(产品编号: PT103,上海莱枫),引物各 1 滋L
(5 mmol / L) ( TaKaRa 合成),模板 DNA 1 滋L
(10 ng) ,9 . 5 滋L ddH2 O 。反应程序 :9 5益 30 s ,
55益 30 s,72益 1 min, 33 个循环。
1. 4. 3摇 PCR 产物纯化和测序 摇 PCR 产物按照试
剂盒(产品编号:DK411,上海莱枫)步骤进行纯
化,纯化后 PCR产物送河南省农科院用 ABI 3130
仪器双向测序,确保序列准确性,测序引物为 ITS1
和 ITS4。
1. 4. 4摇 序列分析和数据处理 摇 对测得的双向序
列,运用软件 DNAStar的 SeqMan进行拼接。 拼接
后的序列剪去引物两端的碱基后得到完整的 5. 8S
rDNA鄄ITS序列,与 GenBank 中相关数据( http: / /
www. ncbi. nlm. nih. gov / blast)进行同源性比较,
应用 Clustal X1. 8 软件将其与同源序列进行多重
比对,结果利用 MEGA4. 1 软件(邻近法 Neighbor鄄
joining和最大简约法 Maximum parsimony)构建系
统发育树。 所得序列已提交 GenBank,序列登录号
为 HM989875。
2摇 结果分析
2. 1摇 病原菌的分离和纯化
直接挑取法,保湿培养法和组织分离法得到 5
个病原菌菌株,纯化后观察比较,发现各菌株形态
特征一致,编号 ZM67 以备后续工作。
2. 2摇 致病性检测
针刺接种 5 d后接种菌块处开始出现稍凹陷,
淡黄色,水渍状病斑;8 d 后接种处明显凹陷,病斑
扩大,呈现褐色,并有白色菌丝和粉红色粘状物;
11 d后凹陷处龟裂,病斑连片腐烂,伴有腐烂气味
散出;未经针刺接种的处理比针刺发病晚 2 d,对照
处理无病状。 回接后症状与自然情况下发病的症
状基本一致(图 1、图 2)。
Fig. 1摇 Watermelon rot symptoms from natu鄄
rally infected fruit
1: Early phase; 2: Interim phase; 3: Last phase; 4: Yellow
dope at the last phase.
Fig. 2摇 Watermelon rot symptoms with stab鄄
bing inoculation
1: At day 5; 2: At day 8; 3: At day 11; 4: Control.
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摇
植物病理学报 41 卷
2. 3摇 病原菌鉴定
PDA培养基上菌落生长速度较快,菌落不规
则,气生菌丝开始为灰白色,随后略显橙红色,7 d
后长出载孢体,盘状,开始红褐色,后变为黑褐色,
刚毛散生、暗褐色,直立,2 ~ 3 个隔膜。 分生孢子
梗无色,无隔膜,顶生分生孢子。 分生孢子圆柱形,
单胞无色,两端钝圆(4 ~ 6)滋m 伊 (5 ~ 19)滋m(图
3),常聚集在一起呈橘红色粘团。 参照《真菌鉴定
手册》及《植物病原真菌学》将该病原真菌初步鉴
定为 C. orbiculare 。
2. 4摇 核糖体 5. 8S rDNA鄄ITS序列分析
利用 ITS1 和 ITS4 引物正反向测序,运用软件
拼接后得到的 5. 8S rDNA鄄ITS 基因序列长度为
567 bp(包含两端引物)。 将病原物的该基因序列
在 GenBank中进行同源性比较,发现与 C. orbicu鄄
lare(AB269941 / AB275876)同源性为 100% 。 选
用镰刀菌作为 ITS 系统发育树的外群(图 4)对相
关近似种序列构建系统发育树,研究结果发现炭疽
菌各种都有单独的分支, HM989875 与 C. orbicu鄄
lare处于同一分支上,从而进一步确定该病原菌为
C. orbiculare。
Fig. 3 摇 Morphological characterisics of
conidia, acervulus and conidio鄄
phores
A: Conidia; B: Part of acervulus; C: Conidiophores.
Fig. 4摇 Phylogenetic analysis of ZM67(HM989875) inferred from
5. 8S rDNA鄄ITS sequences
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摇
摇 5 期 王昌亮,等:河南省一例西瓜果实腐烂病病原鉴定
3摇 结论与讨论
核糖体转录间隔区( ITS),是介于 18S rDNA、
5. 8S rDNA和 28S rDNA之间的区域,该区域进化
速率较编码区快,在种内不同菌株间高度保守,而
在真菌的种间存在着丰富的变化,可以为研究真菌
的系统发育、分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传
信息[2]。 目前对炭疽菌属 ITS 区的研究也有较多
报道,对炭疽菌属种鉴定也趋于成熟,根据 ITS 序
列对炭疽菌属设计出的特异性检测引物也取得显
著进展[3]。 本研究采用分子鉴定技术,测定了该
病原菌的 5. 8S rDNA鄄ITS 序列,序列分析结果与
形态鉴定结果一致,进一步证实这次引起开封贮藏
期西瓜腐烂病的病原为 C. orbiculare。
开封这批西瓜收获时表面光滑无病害症状,入
冷库贮藏 7 d后开始发病,引起贮藏期西瓜大量腐
烂的病原经鉴定后确定为 C. orbiculare,这与引起
西瓜田间炭疽病的病原属于同一种,这批西瓜贮藏
期发病的原因,可能是因为引起西瓜腐烂的病原菌
潜伏在收获的西瓜内,贮藏一段时间后,开始发病;
也有可能是因为冷库未做好消毒工作,冷库内有引
起西瓜腐烂的病原菌存在。 建议收获前对西瓜进
行潜伏病原菌检测,一旦发现病原,及时进行药剂
喷雾防治,常用药剂与方法为 25%嘧菌酯(阿米西
达)1 500 倍,或 20%噻菌酮 500 倍液,亦或 80%炭
疽福美可湿性粉剂 800 倍液,喷雾 1 ~ 2 次。 同时,
西瓜入库前需做好贮藏冷库的消毒工作。
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责任编辑:于金枝
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