全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(1): 31-36(2011)
收稿日期: 2009-10-25; 修回日期: 2010-10-23
基金项目: 国家自然科学基金项目(30871625); 高等学校学科创新引智计划项目(B07049)
通讯作者: 吴云锋,教授,主要从事植物病毒学和分子植物病理学研究; Tel: 13991119706, Fax: 029-87092716, E-mail: wuyf@nwsuaf.
edu. cn
第一作者: 张春平(1986 - ),女,河南安阳人,硕士,主要从事植原体分类与鉴定研究; Tel: 18729544523, E-mail: zhangchph@ nwsuaf.
edu. cn。
竹小叶病植原体的分子鉴定
张春平1, 武占敏1, 李正男1, 张 珏2, 宋加贵1, 杨 洋2, 吴云锋1*
( 1西北农林科技大学植保学院与陕西省农业分子生物学重点实验室,植保资源与病虫害治理教育部重点实验室,
杨凌 712100; 2西北农林科技大学生命科学学院, 杨凌 712100)
摘要: 2008 年在杨凌采集到具有典型植原体侵染症状的菲白竹,应用植原体 16S rRNA 基因的通用引物对 R16mF2 /
R16mR1和 R16F2n / R16R2 对其进行检测,巢式 PCR得到约 1. 2 kb的特异性片段。 对扩增片段进行测序并进行系统进化
树分析,结果表明,该病原属于翠菊黄化组(Candidatus Phytoplasma asteris),与该组成员同源性均在 98%以上。 随后用
16Sr Ⅰ组和Ⅴ组特异引物对 R16(Ⅰ)F1 / R16(Ⅰ)R1 和 R16(Ⅴ)F1 / R16(Ⅴ)R1 也证明其属于翠菊黄化组,RFLP 分析表
明该植原体属于 16SrⅠ-B亚组。 植原体侵染菲白竹在中国属首次报道。
关键词: 竹小叶病; 植原体; 16S rRNA基因; RFLP; 系统进化分析
Identification of phytoplasma associated with bamboo little leaf disease 　 ZHANG
Chun-ping1, WU Zhan-min1, LI Zheng-nan1, ZHANG Yu2, SONG Jia-gui1, YANG Yang2, WU Yun-feng1
( 1Plant Protection and Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Yangling 712100, China; 2College of Life
Science, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)
Abstract: Typical symptoms of phytoplasma infection were observed in Sasa fortunei (van Houtte)Fiori du-
ring a disease survey in Yangling. Using 16S rRNA universal phytoplasma primer pairs R16mF2 / R16mR1and
R16F2n / R16R2, 1. 2 kb specific fragment was obtained from bamboo with symptoms of little leaf and stunt.
The fragment was sequenced and subjected to RFLP and phylogenetic analyses. The strain obtained from bam-
boo was belonged to “Candidatus Phytoplasma asteris” and shared identities of more than 98% with other
members in this group. Group specific primer pairs R16(Ⅰ)F1 / R16(Ⅰ)R1 and R16(Ⅴ)F1 / R16(Ⅴ)R1
confirmed that the strain was a member of group “Candidatus Phytoplasma asteris” . And it also revealed that
no complex infection was existed. RFLP analysis showed that the phytoplasma was a member of 16SrⅠ-B
subgroup. This is the first report of phytoplasma infection in S. fortunei (van Houtte)Fiori.
Key words: bamboo little leaf; phytoplasma; 16S rRNA gene; RFLP; phylogenetic analysis
中图分类号: S432　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2011)01-0031-06
　 　 植原体(Candidatus Phytoplasma)是寄居韧皮
部的一种原核生物,在世界范围内引起多种林木、
果树和花卉病害[1]。 它们属于柔膜菌纲,至今不
能人工培养,主要由取食植物韧皮部的叶蝉、飞虱
等昆虫传播,常常引起植株丛枝、黄化、花变叶、顶
枯等症状[2]。 由于植原体不能培养,给其分类鉴
定造成很大不便。 随着分子生物学的发展,植原体
分类现在主要依据分子生物学方法。 主要方法有
聚合酶链式反应(PCR),限制性内切酶片段长度
多态性(RFLP)以及进化比较[3]。 选择植原体通
用或某个种特异的 PCR 引物,扩增 16S rRNA 基
因 ,然后对 PCR 产物进行 RFLP分析,这样可以对
　
植物病理学报 41 卷
植原体中相近的种进行分类[4],RFLP 分析是目前
为止在植原体分类中应用最广、最精确的方法。 自
1967 年日本学者土居养二首次发现植原体至今,
世界上报道的植原体病害多达 300 多种[5],我国
报道的有 74 种[6 ~ 8]。
菲白竹属于竹亚科,赤竹属,低矮竹类。 植株
低矮,叶片秀美,常植于庭园观赏;栽作地被、绿篱
或与假石相配都很合适;也是盆栽或盆景中配植的
好材料。 菲白竹适应性很强,喜温暖、湿润气候,耐
阴、耐寒,也能耐高温,在偏酸性和沙质土壤中长势
很好,但在瘠薄的土壤中也能顽强生存[9]。 现今
在中国作为观赏植物普遍种植。
本研究采用 PCR技术对表现小叶症状的竹子
植株进行植原体检测, 分别用植原体 16S rRNA通
用引物对 R16F2n / R16R2 和 16SrⅠ组特异引物对
R16(Ⅰ)F1 / R16(Ⅰ)R1[10]从样品中获得特异性
片段,并对扩增得到的 16S rDNA片段进行克隆及
测序,将 R16F2n / R16R2 的产物序列与已知的植原
体 16Sr 各组中的代表性植原体进行序列同源性比
较,确定植原体株系的分类地位。 接着运用 RFLP
技术对其进行进一步分类。 现将研究结果报道
如下。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
表现小叶症状的竹子样品和无症状的竹子样
品均采自陕西杨凌一植物园;克隆载体 pMD18-T
simple vector、限制性内切酶购自 TaKaRa 公司,
Taq 聚合酶购自 Fermentas 公司,Escherichia coli
JM109 菌株,阳性对照枣疯和苦楝丛枝病样品为本
实验室保存。
1. 2　 竹小叶病的分子检测
用改进的 CTAB法[11]提取感病和健康竹叶片
以及阳性对照的总 DNA。
利用植原体 16S rDNA 通用引物对 R16mF2
(5′-CATGCAAGTCGAACGA-3′) / R16mR1 ( 5′-
CTTAACCCCAATCATCGAC-3′) [3]为扩增引物,
以提取的总 DNA 及空白对照双蒸水为模板扩增
第 1 次, 然 后 以 通 用 引 物 对 R16F2n ( 5′-
GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′)和 R16R2 (5′-
TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′) [3] 为
巢式 PCR扩增引物,以第 1 次扩增产物为模板进
行第 2 次扩增。 两次扩增的条件均为:94℃预处理
3 min;以 94℃ 1 min,55℃ 1 min,72 ℃ 1 min先进
行 4 个循环,然后以 94℃ 0. 5 min, 50℃ 1 min, 以
及 72℃ 2 min 进行 24 个循环,最后 72℃ 延伸
10 min。 用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物,
EB染色,在紫外灯下成像。
以 R16mF2 / R16mR1 的产物为模板,用 16Sr
RNAⅠ组和Ⅴ组特异引物对 R16(Ⅰ) F1(5′-TA-
AAAGACCTAGCAATAGG-3′) / R16 (Ⅰ) R1 ( 5′-
CAATCCGAACTGAGACTGT-3′)和 R16 (Ⅴ) F1
(5′-TTAAAAGACCTTCTTCGG-3′) / R16 (Ⅴ) R1
( 5′-TTCAATCCGTACTG AGACTACC-3′) [11] 分
别进行巢式 PCR扩增。 扩增条件参照文献[12]稍
作改动:94℃预处理 3 min;94℃ 1 min,50℃ 1 min,
72 ℃ 75 s进行 30个循环,最后 72℃ 延伸 5 min。
1. 3　 PCR产物的 RFLP分析
在 37℃下,分别用限制性内切酶 AluⅠ, Mse
Ⅰ和 RsaⅠ等对巢式 PCR扩增产物进行酶切,以枣
疯病和苦楝丛枝病样品为对照。 酶切产物经 8%
聚丙烯酰胺胶电泳检测,硝酸银染色,白光处理成
像,并与 Lee等[3]报道的相关酶切图谱进行比对。
运用 pDRAW 32[13]比较分析竹小叶植原体 16S
rRNA 与淡竹丛枝 16S rRNA ( GenBank No.
AB242433),竹丛枝 16S rRNA ( GenBank No.
AY635145)。
1. 4　 PCR产物的克隆与序列分析
PCR产物纯化回收后与 pMD18-T simple vec-
tor在 16℃连接 2 h,4℃过夜。 连接产物转化大肠
杆菌 JM109 感受态细胞,挑取筛选平板上的白色
菌落培养,任选 3 个经 PCR 鉴定为阳性的重组质
粒送至上海英骏生物技术有限公司测序。 将所得
DNA序列提交 GenBank 并进行 BLAST 比对检
索,与 NCBI 上已知序列进行同源性比较,采用
MEGA4 软件对所得到的核苷酸序列与 GenBank
中相关序列进行比较和分析,构建系统进化
树[14,15]。
2　 结果与分析
2. 1　 竹小叶病株症状表现
发病的竹子为菲白竹 [ Sasa fortunei ( van
23
　
　 1 期 张春平,等:竹小叶病植原体的分子鉴定
Houtte) Fiori ],生长在陕西杨凌一个植物园。 感
病植株叶片变小,叶片没有光泽,植株矮化,成簇状
(图 1)。 发病植株成片状分布,在竹丛中形成一个
涡旋中心。
2. 2　 PCR扩增结果
利用 16S rDNA 通用引物从表现小叶症状的
竹样品及阳性对照中均扩增出长度约 1. 2kb 与预
期目标片段大小相符的目标片段,而从健康竹子总
DNA和双蒸水中均未扩增出特异条带。 说明表现
小叶症状的竹子是被植原体感染。
利用组内特异引物对 R16 (Ⅰ) F1 / R16 (Ⅰ)
R1 扩增出约 1. 1 kb的特异性片段,而用 R16(Ⅴ)
F1 / R16(Ⅴ)R1 没有扩增出特异性条带。 说明采
集的病样中存在 16SrⅠ组植原体。
2. 3　 序列测定与 RFLP分析
测序所得 3 个克隆的序列同源性均大于
99. 8% ,将其中任一个序列提交 GenBank (Gen-
Bank No. FJ501958)。 该序列含有 1 246 个核苷
酸,G + C的含量为 46. 95% 。 将该序列登录 NCBI
网站进行 BLAST搜索,发现其与翠菊黄化组成员
同源性最高,均超过 98% 。 引物对 R16 (Ⅰ) F1 /
R16(Ⅰ)R1 扩增片段序列(GQ433361)含有 1 097
个核苷酸,G + C 的含量为 47. 13% 。 RFLP 图谱
(图 2 )分析表明,竹小叶病植原体与苦楝丛枝植
原体酶切条带相同,而与枣疯植原体的条带不同。
运用 pDRAW 32 进行虚拟酶切发现竹小叶植原体
与淡竹丛枝酶切图谱一致,而与竹丛枝稍有差异,
缺少 1 个 MseⅠ酶切位点(图 3)。
2. 4　 16S rRNA基因的系统进化树和序列一致性
分析
根据竹小叶植原体与 GenBank 中的 24 个代
表 14 个植原体小组和 5 个 16SrⅠ亚组植原体的
16S rRNA基因构建系统进化树(图 4)。 竹小叶植
原体与 16SrⅠ组植原体归入 1 个大的分支,并且与
淡竹丛枝(AB242433)和泡桐丛枝(FJ263622)植
原体亲缘关系最近。
3　 讨论
本研究采用植原体 16S rRNA 基因的通用引
物,通过巢式 PCR扩增得到 1 246 bp的片段,表明
自然表现小叶症状的菲白竹是由植厚体侵染引起
的。 该植原体的核酸序列与 16SrⅠ组的核苷酸一
致性均在 98%以上。 通过 RFLP方法分析,我们将
该植原体归为 16SrⅠ-B亚组。 进化树分析结果进
一步证明了之前的归类。 目前,在中国西北地区报
道的植原体侵染多为Ⅰ组和Ⅴ组,故在本研究中我
们选用了这两组的特异性引物来检测植原体是否
存在复合侵染。 Ⅰ组特异引物对从表现症状的竹
子样品中扩增出 1 097 bp的特异片段,而用Ⅴ组特
异引物没有特异片段出现。 进一步证明了侵染竹
子的植原体是翠菊黄化组。
Fig. 1　 Symptom of bamboo little leaf
A: Symptom of bamboo little leaf in field; B: Diseased leaves of bamboo little leaf.
33
　
植物病理学报 41 卷
Fig. 2 　 RFLP analyses of phytoplasma
16S rDNAs(R16F2n / R16R2 nested
PCR products)
DNA products were digested with MseⅠ, AluⅠ, RsaⅠ.
Lane 1,4,7: Bamboo little leaves; Lane 2,5,8: Chinaberry
witches′broom, CWB; Lane 3,6,9: Jujube witches′ broom,
JWB; M: X174 RFI DNA HaeⅢ digest; Fragment sizes
(bp) from top to bottom: 1 353, 1 078, 872, 603, 310,
281, 271, 234, 194, 118, 72.
　 　 植原体的鉴定与分类是植原体研究的热点,
Lee等[3]采取 17 种限制性内切酶对 34 个植原体
株系的 16S rRNA 基因的 PCR 扩增产物进行
RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
分析,结果将 34 个植原体株系划分为 14 个主要的
组( 16Sr 组),同年,Seemüller 等[16]通过观察 57
个植原体株系的 16S rRNA 基因全长或者是近全
长序列同源性比较分析构建形成的系统发育进化
树中发现,在由植原体单独形成的一个进化枝内表
现出 20 个明显不同的亚进化枝。 其中翠菊黄化组
(AY组, 16SrⅠ)是植原体中最大的组,组内植原
体变化最大,在全世界分布最广[17 ~ 19],在世界范围
内能引起 100 多种经济作物病害。 最早基于 16S
rRNA和核糖体蛋白基因( rp)的系统进化研究就
是针对 AY 组中的 Oenothera hookeri 株系所开展
的[20]。
Fig. 3 　 Virtual RFLP of Henon bamboo wit-
ches′ broom (HBWB), bamboo wit-
ches′ broom (BWB) and bamboo lit-
tle leaf ( BLR) with MseⅠ, AluⅠ,
RsaⅠ
　 　 我国植原体病害发生严重,Qiu 等[21]研究了
20 种感染植原体的植物,其中翠菊黄化组占的比
率较大,说明我国植原体病害翠菊黄化占主导地
位。 植原体侵染竹子在我国并非第一次报道,现在
已知的有北京及广东的凤尾竹丛枝、刺竹丛枝[21],
云南的竹丛枝[22]等,本研究中引起竹小叶病害发
生的植原体与之前所报道的竹丛枝植原体同属翠
菊黄化组,但 16S rRNA基因与之前所报道的竹丛
枝差异较大,同源性仅为 98. 56% ,远远低于其与
淡竹丛枝[23]99. 68%的同源性。 并且本报道中竹
子的症状与之前报道的竹丛枝也有较大差异,竹丛
枝一般表现为枝节丛生,呈典型“鸟巢”状,丛生枝
较细弱,节间短缩,叶片稍有黄化;而竹小叶则表现
为节间缩短,叶片变小,不似正常叶片有光泽。 这
说明本报道中的植原体与之前中国所报道的竹丛
枝植原体不同,而有可能与韩国侵染竹子的植原体
同属一种。
43
　
　 1 期 张春平,等:竹小叶病植原体的分子鉴定
Fig. 4　 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of bamboo little leaves and related
phytoplasmas constructed with the Neighbor-Joining method
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责任编辑:曾晓葳
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