全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(５): ５２０￣５２９(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０６￣０６ꎻ 修回日期: ２０１５￣０５￣１４
基金项目: 国家“８６３”计划(２０１２ＡＡ１０１５０１)ꎻ北京市林业科学技术推广项目[京园绿推(２０１１)０３号]
通讯作者: 田国忠ꎬ研究员ꎬ主要从事植原体研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｔｉａｎｇｚ＠ｃａｆ.ａｃ.ｃｎ
第一作者: 任争光ꎬ男ꎬ博士ꎬ主要从事植物病原细菌学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｇｒｅｎ２００５＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０５.０１０
实时荧光定量 ＰＣＲ(ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ)检测不同
抗枣疯病枣树品种嫁接接穗中的植原体浓度
任争光１ꎬ 王 合２ꎬ 林彩丽１ꎬ 刘 曦２ꎬ 宋传生１ꎬ
冯术快３ꎬ 于少帅１ꎬ 卢绪利３ꎬ 田国忠１∗
( １中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所ꎬ国家林业局森林保护学重点实验室ꎬ北京 １０００９１ꎻ
２北京市林业保护站ꎬ北京 １０００２９ꎻ ３北京市昌平区园林绿化局ꎬ北京 １０２２００)
摘要:在枣疯植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ 片段内设计并合成引物对 ＤＺ１６ＳＦ￣２ / ＤＺ１６ＳＲ￣２(扩增 １９０ ｂｐ 片段)ꎬ用重组质粒 ｐＭＤ１８￣
ＤＺ１６Ｓ为模板建立标准曲线ꎬ并建立枣疯植原体实时荧光定量 ＰＣＲ(ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ)检测体系ꎮ 溶解曲线分析显示:该引物
特异性好ꎬ该体系对质粒模板的检测灵敏度达 １０２ ｃｏｐｉｅｓ / μＬꎮ 利用该体系对不同月份、不同发病级别的嫁接接种枣树接穗
样品进行植原体含量测定ꎮ 通过对高抗品种‘星光’ꎬ中抗品种‘黑腰子枣’、‘嘎嘎枣’和‘葫芦枣’ꎬ感病品种‘月光枣’、
‘马牙枣’、‘莲蓬子’、‘北流西冬枣’和高感品种‘大红袍枣’嫁接到发病‘冬枣’砧木上所表现出的不同病级、病情指数和
病原浓度比较结果发现ꎬ表现无症状的样品中植原体的含量在每克鲜重 １０５ ~ １０６个ꎬ发病Ⅰ ~Ⅱ级枝条中植原体浓度在
１０６ ~１０７个 / ｇꎬⅢ~Ⅳ级发病枝条含量在 １０７ ~１０８个 / ｇ鲜重ꎬ而 Ｖ级发病枝条达到每克鲜重 １０９个ꎬ表明接种发病的接穗症
状严重度与其体内植原体浓度积累密切相关ꎮ 高抗枣疯病‘星光’品种嫁接接穗体内病原浓度明显低于感病品种ꎬ而且有
较多‘星光’接穗嫁接的发病砧木症状有所减轻ꎬ植原体浓度也有所降低ꎮ 本研究可为探索枣树品种的抗病机制、抗病性鉴
定及枣疯病植原体的防治提供参考ꎮ
关键词:枣疯病ꎻ 植原体ꎻ 抗病品种ꎻ 实时荧光定量 ＰＣＲꎻ 嫁接传病
Ａ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ (ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ) ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｊｕｊｕｂｅ
ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒａｆｔｅｄ ｊｕｊｕｂｅ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｓｃｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ＲＥＮ Ｚｈｅｎｇ￣ｇｕａｎｇ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｈｅ２ꎬ ＬＩＮ Ｃａｉ￣ｌｉ１ꎬ ＬＩＵ Ｘｉ２ꎬ ＳＯＮＧ Ｃｈｕａｎ￣ｓｈｅｎｇ１ꎬ ＦＥＮＧ
Ｓｈｕ￣ｋｕａｉ３ꎬ ＹＵ Ｓｈａｏ￣ｓｈｕａｉ１ꎬ ＬＵ Ｘｕ￣ｌｉ３ꎬ ＴＩＡＮ Ｇｕｏ￣ｚｈｏｎｇ １ ( １Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｅｃｏｌｏｇｙꎬ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００２９ꎬ
Ｃｈｉｎａꎻ ３Ｃｈａｎｇｐｉｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｅｒ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０２２００ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’￣ｂｒｏｏｍ (ＪＷＢ) ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ Ｊｕｊｕｂｅ ｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅ. Ｉｎ ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙꎬ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ＤＺ１６ＳＦ￣２/ ＤＺ１６ＳＲ￣２ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄꎬ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ａｍｐｌｉｆｙ １９０ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＪＷＢ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｂｙ ＰＣＲ. Ｔｈｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ (ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ) ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｐＭＤ１８￣ＤＺ１６Ｓ ａｓ ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ
ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ. Ａｌｌ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ＤＺ１６ＳＦ￣２/ ＤＺ１６ＳＲ￣２ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉ￣
ｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＪＷＢ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ. Ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘ ｗｅｒｅ ｑｕａｎ￣
ｔｉｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒａｆｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｓｃｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒａｄｅｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ￣
ｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ＪＷＢ￣ｈｉｇｈｌｙ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒ ‘Ｘｉｎｇｇｕａｎｇ’ꎻ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｖ. ‘Ｈｅｉｙａｏｚｉｚａｏ’ꎬ ‘Ｇａｇａｚａｏ’ ａｎｄ
５期 任争光ꎬ等:实时荧光定量 ＰＣＲ(ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ)检测不同抗枣疯病枣树品种嫁接接穗中的植原体浓度
‘Ｈｕｌｕｚａｏ’ꎻ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｖ. ‘Ｙｕｅｇｕａｎｇｚａｏ’ꎬ ‘Ｍａｙａｚａｏ’ꎬ ‘Ｌｉａｎｐｅｎｇｚｉｚａｏ’ ａｎｄ ‘Ｂｅｉｌｉｕｘｉｄｏｎｇｚａｏ’ ａｎｄ ｔｈｅ
ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｖ. ‘Ｄａｈｏｎｇｐａｏｚａｏ’ . Ｉｎ ｇｅｎｅｒａｌꎬ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｓｃｉｏｎｓ
ｗｅｒｅ ａｂｏｕｔ １０５－１０６ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｇｒａｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓꎬ １０６－１０７ ａｎｄ １０７－１０８ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｇｒａｍ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒａｄｅⅠ~
Ⅱａｎｄ Ⅲ~Ⅳ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｃｉｏｎｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ａｎｄ ｕｐ ｔｏ １０９ ｐｅｒ ｇｒａｍ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｅｖｅｒｅ ｇｒａｄｅ Ｖ ｄｉｓｅａｓｅｄ
ｓｃｉｏｎｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｊｕｊｕｂｅ ｓｃｉｏｎｓ ｗａｓ
ｃｌｏｓｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌ ｗｉｔｃｈｅｓ’￣ｂｒｏｏｍ ｓｙｍｐｔｏｍｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＪＷＢ￣ｈｉｇｈｌｙ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒ ‘Ｘｉｎｇｇｕａｎｇ’ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｃｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓꎬ ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ ｔｈｅ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ‘Ｘｉｎｇ￣
ｇｕａｎｇ’ ｓｃｉｏｎｓ ｃａｕｓｅｄ ａ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ａｎｄ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ. Ｔｈｉｓ
ｗｏｒｋ ｗｉｌｌ ｇｉｖｅ ｔｈｅ ｈａｎｄｓ ｏｆ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｊｕｊｕｂｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍꎬ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｌｐ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ
ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｄｉｓｅａｓｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍꎻ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａꎻ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒꎻ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲꎻ ｇｒａｆｔ
ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ
中图分类号: Ｓ４３２.４ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０５￣０５２０￣１０
枣树是我国重要的经济林树种之一ꎬ种植广
泛ꎮ 枣果营养丰富ꎬ富含糖份、维生素 Ｃ 及铁钙等
矿物质元素ꎬ深受人们喜爱ꎮ 因其抗逆性强ꎬ可以
兼顾经济和生态效益ꎬ是我国重要的特色优势果树
之一ꎮ 然而由枣疯植原体引起的枣疯病( Ｊｕｊｕｂｅ
ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｄｉｓｅａｓｅꎬＪＷＢ)在各树龄枣树田间
条件下发生普遍ꎬ导致叶片黄化、小枝丛生、花器返
祖、果实畸形ꎬ严重者 １ ~ ３ 年即可整株枯死ꎬ经济
损失巨大[１ꎬ ２]ꎮ
植原体 ( Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａꎬ原称 Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ￣ｌｉｋｅ
ｏｒｇａｎｉｓｍꎬ简称 ＭＬＯ)ꎬ是一类无细胞壁的植物病
原细菌ꎮ 该病菌主要存在于植物筛管细胞和介体
昆虫体内ꎬ通过营养繁殖材料(接穗、砧木、根蘖苗
及嫁接苗)和介体昆虫进行传播[３]ꎮ 由于枣疯病
的自然传播媒介主要是传毒昆虫叶蝉ꎬ而通过消灭
传毒昆虫的方法防止枣疯病的传播和蔓延在生产
上很难实施ꎬ另外枣树一旦染病后很快整株带毒和
终身带毒ꎬ利用剪除病枝和四环素类抗生素药物滴
注等治疗方式也无法避免其复发ꎮ 脱毒苗木的应
用也不能避免其再次受到感染ꎮ 筛选抗病种质资
源ꎬ选育抗病优良品种ꎬ是目前防治枣疯病最为经
济有效的措施[４]ꎮ 本研究选取北京市枣树主要栽
培品种ꎬ以及河北农业大学中国枣研究中心选育的
抗病品种‘星光’为试材ꎬ通过嫁接接穗的方法将
各品种接穗嫁接到北京市昌平区重症疯枣园中ꎬ并
调查嫁接后枣接穗的发病情况ꎮ 最后以枣疯植原
体为研究对象ꎬ建立非特异性实时荧光 ( ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｉ)定量 ＰＣＲ检测体系ꎬ检测不同枣树样品接
穗中的植原体含量ꎬ探索枣树品种抗性与植原体浓
度之间的关系ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 质粒、菌株和枣树接穗、砧木
ＣＴＡＢ植物基因组 ＤＮＡ快速提取试剂盒购自
北京博迈德生物技术有限公司ꎻＰＣＲ 产物纯化试
剂盒、质粒提取试剂盒、ＲＴ￣ＰＣＲ 试剂盒 ＳｕｐｅｒＲｅａｌ
ＰｒｅＭｉｘ Ｐｌｕｓ ( ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ)和大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉ￣
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α 感受态细胞购自天根生物科技公
司ꎻ克隆载体 ｐＭＤ１８￣Ｔ ｖｅｃｔｏｒ 购自宝生物(大连)
有限公司ꎮ
待测枣树接穗品种见表 １ꎬ各品种接穗均为健
康枣树上采集ꎻ选择的砧木为‘冬枣’品种ꎮ 检测
时用健康枣树样品作为阴性对照ꎬ健康枣树样品采
自北京市海淀区娘娘府干休所内未表现任何症状
的枣树上ꎬ经直接和巢氏 ＰＣＲ均未检测到植原体ꎮ
１.２ 砧木选择及嫁接方法
‘星光’品种嫁接时间为 ２０１１ 年 ５ 月ꎬ其余样
品接穗的嫁接时间为 ２０１２年 ５月(表 １)ꎮ 嫁接地
点选择北京市昌平区北流村重症疯枣园中ꎬ砧木品
种为感病‘冬枣’ꎬ砧木发病级别均在 ＩＶ 至 Ｖ 级ꎬ
其中‘北流西冬枣’品种为疯枣园中表现为抗枣疯病
‘冬枣’树上采集的接穗ꎮ嫁接方法选用劈接的方
１２５
植物病理学报 ４５卷
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｓｃｉｏｎｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ
Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｙｐｅ Ｇｒａｆｔ ｄａｔｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｇｒａｆｔｉｎｇ
Ｄａｈｏｎｇｐａｏ ＨＳ ２０１２.０５ ３
Ｍａｙａｚａｏ Ｓ ２０１２.０５ ８
Ｂｅｉｌｉｕｘｉｄｏｎｇｚａｏ Ｓ ２０１２.０５ ４
Ｙｕｅｇｕａｎｇｚａｏ Ｓ ２０１２.０５ １０
Ｌｉａｎｐｅｎｇｚｉｚａｏ Ｓ ２０１２.０５ １４
Ｈｅｉｙａｏｚｉｚａｏ Ｒ ２０１２.０５ ６
Ｇａｇａｚａｏ Ｒ ２０１２.０５ ９
Ｈｕｌｕｚａｏ ＭＲ ２０１２.０５ ９
Ｘｉｎｇｇｕａｎｇ ＨＲ ２０１１.０５ ２２
ＨＳ＝ｈｉｇｈ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅꎻ Ｓ＝ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅꎻ Ｒ＝ｒｅｓｉｓｔａｎｔꎻ ＭＲ＝ｍｏｄｅｒａｔｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅꎻ ＨＲ＝ｈｉｇｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ.
式[５]ꎬ在砧木上中下分别选取合适发病枝干进行
嫁接ꎬ每棵砧木上嫁接同一品种接穗ꎬ每种样品嫁
接 １０~１５个接穗(接穗成活个数见表 １)ꎮ 将‘星
光’接穗分别嫁接在多株砧木上ꎬ每个砧木嫁接不
同数量的接穗ꎮ ‘星光’１为 １ 号砧木 ２０１１ 年嫁接
后至 ２０１２年 ５月份存活 １ 个‘星光’接穗ꎻ‘星光’
２为 ２号砧木共存活 ６个接穗ꎻ‘星光’４ 为 ４ 号砧
木存活 ８个接穗ꎬ‘星光’８为 ８号砧木存活 ７ 个接
穗ꎮ 田间调查时间始于 ２０１２ 年 ５ 月初ꎬ采样和植
原体定量检测时间从 ２０１２年 ７月开始ꎬ此时距‘星
光’品种嫁接 １３个月ꎬ其余品种嫁接 ２个月ꎮ 根据
枣疯病分级标准调查发病情况ꎬ计算病情指数ꎬ接
穗枝叶进行室内常规 ＰＣＲ和 ＲＴ￣ＰＣＲ检测ꎮ
１.３ 枣疯病分级和病情指数计算
接穗发病级别分为 ５ 级[６]ꎮ ０ 级ꎬ无明显症
状ꎻＩ 级ꎬ新发枝花梗明显延长ꎬ或顶梢叶变小、变
淡ꎬ小叶比率低于整枝的 １０％ꎻⅡ级ꎬ新梢小叶、节
间缩短、腋芽明显伸长或花变叶比率达 １１％ ~
２０％ꎻⅢ级ꎬ丛枝小叶比率达 ２１％ ~ ５０％ꎻⅣ级ꎬ丛
枝小叶比率达 ５１％ ~ ９０％ꎻⅤ级ꎬ丛枝小叶比率达
９１％~１００％(图 １)ꎮ 各品种接穗的病情指数计算
公式:
病情指数＝∑(病级
×该病级接穗数)
调查总接穗数×最高病级
×１００
１.４ 枣疯植原体 ＤＮＡ的提取与常规 ＰＣＲ检测
称取枣树幼嫩枝梢顶部枝叶 １~ ２ ｇꎬ用液氮冷
冻并充分研磨混匀ꎬ取 ０.１５ ｇ 研磨粉末ꎬ用 ＣＴＡＢ
植物基因组 ＤＮＡ快速提取试剂盒进行总 ＤＮＡ 的
提取ꎬ以此 ＤＮＡ为模板进行 ＰＣＲ检测ꎮ 常规 ＰＣＲ
方法(直接 ＰＣＲ和巢氏 ＰＣＲ)参考文献[７]和[８]ꎮ
１.５ 荧光定量 ＰＣＲ 检测体系的建立与枣树带病
样品检测
利用植原体特异性引物 Ｒ１６ｍＦ２ / Ｒ１６ｍＲ１[７]
ＰＣＲ 扩增‘冬枣’发病砧木(病级为 Ｖ 级)样品
ＤＮＡꎬ得到 １.４ ｋｂ大小的枣疯植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ片
段ꎬ将其克隆到 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体上得到质粒
ｐＭＤ１８￣ＤＺ１６Ｓꎬ测序后在 １.４ ｋｂ 片段内部分别设
计 引 物 对 ＤＺ１６ＳＦ￣２ / ＤＺ１６ＳＲ￣２ ( ５′￣ＡＡＧＴ￣
ＧＴＣＧＧＧＧＣＡＡＣＴＣＧＧＴＡ￣３′ / ５′￣ＴＧＡＴＡＡＣＣＴＣ￣
ＣＡＣＴＡＴＡＴＴＴＣＴＡＴＡＧＣＴ￣３′ꎬ扩增片段大小为
１９０ ｂｐ )ꎮ 用 ＤＮＡＭＡＮ 软 件 计 算 重 组 质 粒
ｐＭＤ１８￣ＤＺ１６Ｓ的分子量ꎬ根据质粒 ＤＮＡ 浓度ꎬ依
照公式计算每微升含有质粒的拷贝数ꎮ 最后以质
粒 ｐＭＤ１８￣ＤＺ１６Ｓ的梯度稀释液为模板进行实时
荧光(ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ)定量 ＰＣＲꎬ建立标准曲线ꎮ
同时分别用直接和巢氏 ＰＣＲ 的方法ꎬ以质粒
ｐＭＤ１８￣ＤＺ１６Ｓ的梯度稀释液为模板进行扩增ꎬ比
较分析 ３ 种 ＰＣＲ 的检测灵敏度ꎮ 对枣树样品
ＤＮＡ进行荧光定量 ＰＣＲ检测ꎬ用荧光定量 ＰＣＲ仪
自带软件进行溶解曲线分析并计算 ＤＮＡ 样品中
对应的植原体数量ꎮ 将得出的植原体含量除以
ＤＮＡ提取时组织的重量ꎬ再除以 ２(植原体中 １６Ｓ
ｒＤＮＡ 为双拷贝[９] )ꎬ就是单位组织鲜重中的植原
体含量ꎬ每个样品设 ３个重复ꎮ 质粒拷贝数的计算
公式:
质粒拷贝数＝ ＤＮＡ浓度
ＤＮＡ摩尔质量
×６.０２Ｅ＋２３
２２５
５期 任争光ꎬ等:实时荧光定量 ＰＣＲ(ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ)检测不同抗枣疯病枣树品种嫁接接穗中的植原体浓度
Ｆｉｇ. １ Ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｓｃｉｏｎｓ ｏｆ ｊｕｊｕｂｅ
Ｆｉｖｅ ｇｒａｄｅｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ: ａꎬ ０ ｇｒａｄｅ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｆｌｏｗｅｒｓꎬ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙꎻ ｂꎬ ｇｒａｄｅ Ｉ ｗｉｔｈ
ｔｈｅ ｐｅｄｉｃｅｌ ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙꎻ ｃꎬ ｇｒａｄｅ Ⅱ ｗｉｔｈ ｐｈｙｌｌｏｄｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｗａｓ ｆｒｏｍ １１％ ｔｏ ２０％ꎻ
ｄꎬ ｇｒａｄｅ Ⅲꎬ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｌｌｏｄｙ ｏｒ ｔｈｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ｂｒｏｏｍ ｗａｓ ２１％－５０％ꎻ ｅꎬ ｇｒａｄｅ Ⅳꎬ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｇｏｔ ｔｏ
５１％－９０％ꎻ ｆꎬ ｇｒａｄｅ Ⅴ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｂｅｔｗｅｅｎ ９１％ ａｎｄ １００％.
荧光定量 ＰＣＲ 所用仪器为 Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ ６０００
(ＣＯＲＢＥＴＴꎬ Ａｕｓｔｒａｌｉａ)ꎮ ＰＣＲ反应体系 ２５ μＬꎬ含
有 １２.５ μＬ ２×ＳｕｐｅｒＲｅａｌ ＰｒｅＭｉｘ Ｐｌｕｓ (ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
Ⅰ)ꎬ上下游引物终浓度均为 ３ μｍｏｌ / ＬꎬＤＮＡ模板
１ μＬꎬ补充 ｄｄＨ２Ｏ至 ２５ μＬꎮ ＰＣＲ反应条件:９５℃
预变性 １５ ｍｉｎꎻ９５℃变性 １０ ｓꎬ ５５℃退火 ２５ ｓꎬ
７２℃延伸 ２０ ｓꎬ４０个循环ꎻ７２℃至 ９５℃进行溶解曲
线检测ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 实时荧光定量 ＰＣＲ标准曲线的建立
以‘冬枣’砧木发病样本 ＤＮＡ为模板ꎬ用直接
ＰＣＲ 的方法扩增到枣疯植原体 １. ４ ｋｂ 的 １６Ｓ
ｒＤＮＡ片段ꎬ将其克隆到 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体上得到重
组质粒 ｐＭＤ１８￣ＤＺ１６Ｓꎬ经测序和对克隆序列
Ｂｌａｓｔｎ比对分析发现ꎬ该序列与 ＮＣＢＩ 中其他枣疯
植原体ꎬ如 Ｘｉａｎｇｓｈａｎ、 Ｐｉｎｇｙｉ、 ＬＫ１ 菌株的 １６Ｓ
ｒＤＮＡ 序 列 ( ＧｅｎＢａｎｋ 登 录 号: ＦＪ５７３２２９、
ＦＪ１５４８４６、ＥＵ９９９７４３)相似率达 ９９％ꎮ
对构建的重组质粒 ｐＭＤ１８￣ＤＺ１６Ｓ 进行纯化ꎬ
最后计算出 １ μＬ质粒 ＤＮＡ溶液含有 ３.１７×１０９个
质粒ꎮ 以该质粒梯度稀释液 (３. １７ × １０８ ~ ３. １７ ×
１０２)为模板ꎬ用引物对 ＤＺ１６ＳＦ￣２ / ＤＺ１６ＳＲ￣２ 进行
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量 ＰＣＲꎬ建立有效的标准曲
线(拷贝数对数与 Ｃｔ值相关性 Ｒ２ ＝ ０.９９８)图 ２￣Ａꎮ
溶解曲线分析结果显示:ＤＺ１６ＳＦ￣２ / ＤＺ１６ＳＲ￣２ 扩
增带病样品溶解曲线峰较为单一ꎬ健康枣树 ＤＮＡ
样品检测未出现溶解曲线峰 (图 ２￣Ｂ)ꎬ表明
ＤＺ１６ＳＦ￣２ / ＤＺ１６ＳＲ￣２引物特异性理想ꎮ
２.２ 实时荧光定量 ＰＣＲ检测植原体灵敏度
分析了 ３ 种 ＰＣＲ(直接、巢氏和实时荧光定量
ＰＣＲ)检测灵敏度ꎬ结果显示当 ＤＮＡ 模板浓度在
３.１７×１０５ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ 时ꎬ直接 ＰＣＲ 已无法扩增出产
物ꎬ巢氏 ＰＣＲ的扩增灵敏度能达到 ＤＮＡ 模板浓度
为 ３.１７×１０４ ｃｏｐｉｅｓ / μＬꎬ比直接 ＰＣＲ提高了 １００倍ꎬ
而荧光定量 ＰＣＲ 在 ＤＮＡ 模板浓度为 ３. １７ ×１０２
ｃｏｐｉｅｓ / μＬ时仍有良好的荧光信号ꎬＣｔ值 ３４.４７(小于
３５)ꎬ说明荧光定量 ＰＣＲ比直接和巢氏 ＰＣＲ灵敏度
高ꎬ本试验建立的荧光定量 ＰＣＲ检测体系检测枣疯
植原体的限度为 ３.１７×１０２ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ(表 ２)ꎮ
３２５
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ２ Ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ (Ａ) ｏｆ ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ (Ｃｔ) ｖａｌｕｅｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ
ｏｆ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐＭＤ１８￣ＤＺ１６Ｓ ＤＮＡ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｍｅｌｔ ｃｕｒｖｅｓ
(Ｂ) ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ＤＺ１６ＳＦ￣２ / ＤＺ１６ＳＲ￣２
Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ: １ꎬ Ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ ｏｆ ｐＭＤ１８￣ＤＺ１６Ｓꎻ ２ꎬ Ｄｉｓｅａｓｅｄ ｊｕｊｕｂｅ ＤＮＡꎻ ３ꎬ Ｈｅａｌｔｈｙ ｊｕｊｕｂｅ ＤＮＡ.
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔꎬ ｎｅｓｔ ａｎｄ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ＪＷＢ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ
ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ (３.１７×) / μＬ
１０８ １０７ １０６ １０５ １０４ １０３ １０２ ＮＣ
ＲＴ￣ＰＣＲ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ －
Ｃｔ ｖａｌｕｅ １２.６５ １６.１８ １８.９２ ２３.２３ ２７.３０ ３１.１０ ３４.４７
Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ ＋ ＋ ＋ － － － － －
Ｎｅｓｔ ＰＣＲ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － －
ＮＣ: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ “＋”: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔꎻ “－”: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔ.
２.３ 不同品种接穗嫁接样品中的植原体浓度比较
２０１１年 ５月嫁接存活的高抗品种‘星光’接穗
在 ２０１２年 ５月初开始调查时皆未发病ꎬ且开始萌
芽ꎬ其嫁接砧木可见上一年枯死病枝ꎻ到 ６ 月份全
部正常展叶、开花ꎬ个别枝条出现花梗延长现象ꎬ７
月份接穗未见典型病症ꎬ并有枝条正常结果ꎮ ２０１２
年 ５月嫁接的不同品种接穗当月中旬萌芽、展叶ꎬ
但症状皆不明显ꎻ６ 月份开始发病ꎬ表现为花梗延
长、腋芽萌生、叶片变小或褪绿ꎻ７ 月份进入发病盛
期ꎬ症状加重ꎬ其中抗性品种‘嘎嘎枣’接穗分化较
为明显ꎬ接穗在 ０~Ⅴ发病级间各有表现ꎬ而高感品
种‘大红袍枣’所有接穗发病均在Ⅳ级以上ꎮ 因 ７
月份不同品种间的症状分化最明显ꎬ故选择此时采
集嫁接接种后的样品做实时荧光定量检测对象ꎬ以
期获得对不同品种抗性的客观判断ꎮ 对各品种接
穗 ７月份发病级样品中植原体含量检测结果显示
(表 ３):大部分样品无论抗病性程度高低在未表现
症状(０ 级)时的枝条中植原体的含量在每克鲜重
１０５ ~１０６个ꎬⅠ~Ⅱ级发病枝条含量 １０６ ~ １０７个ꎬⅢ~Ⅳ
级发病枝条含量 １０７ ~ １０８个每克鲜重ꎬ而 Ｖ 级发病
枝条一般达到每克鲜重 １０９个植原体ꎮ 高抗品种‘星
光’ꎬ植原体浓度达到 ２.１７×１０７时仍旧没有发病迹
象ꎮ ‘黑腰子枣’带菌含量达 ８.３０×１０８个 / ｇ 鲜重时ꎬ
其症状表现只有Ⅱ级ꎬ这意味着抗病‘星光’、‘黑腰
子枣’具有耐受更高浓度植原体的能力ꎬ表现为一定
的耐病性ꎮ 感病品种‘月光枣’其发病枝条呈现 ０级
和Ⅱ、Ⅲ级分布ꎬ体内植原体含量却皆维持在 １０６个数
量级ꎬ即在低浓度下就可表现出较高的发病级别ꎬ这
与该品种的感病性相吻合ꎮ 高感品种‘大红袍枣’
和‘冬枣’砧木中植原体含量高达 １０９个每克鲜重ꎬ
表明它们对植原体抵抗能力低且非常适宜植原体的
繁殖ꎮ 健康枣树样品中未检测到植原体ꎮ
４２５
５期 任争光ꎬ等:实时荧光定量 ＰＣＲ(ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ)检测不同抗枣疯病枣树品种嫁接接穗中的植原体浓度
２.４ ‘星光’品种抗病性表现与植原体浓度关系
对嫁接传病的‘星光’品种接穗周年生长和病
状调查发现(图 ３、表 ４)ꎬ‘星光’接穗的数量不仅
影响自身的发病表现ꎬ还影响砧木的症状表现ꎮ
‘星光’１号ꎬ仅嫁接 １个接穗ꎬ随着时间的推移ꎬ接
穗对枣疯植原体的抵抗能力逐渐减弱ꎬ且叶片黄化
和叶卷现象明显ꎬ在 ９月份病情指数一度达到 ６０ꎬ
但在 １０月份随着气温的下降ꎬ‘星光’１ 号病情指
数又开始回落ꎮ 而‘星光’２、４、８ 号分别嫁接成活
了 ４、８ 和 ７ 个接穗ꎬ接穗的抗病表现较好ꎬ为不发
病或发病较轻(‘星光’８ 号)ꎮ 至 ７ 月初ꎬ‘星光’１
号砧木发病已达 Ｖ 级ꎬ７ －１０ 月份病情指数均为
１００ꎮ 而‘星光’２、４、８ 号砧木 ７ ~ ８ 月份发病明显
较轻(表 ４)(未嫁接前各砧木发病均为 Ｖ 级)ꎻ其
中表现最好的 ８号砧木ꎬ１ 枝与接穗最近的砧木枝
条 ７月份尚未表现病症(０ 级) (表 ５)ꎮ 至 ９ 月和
１０月份这些砧木病情指数才整体上升ꎬ这可能与
植原体数量的累积增加ꎬ砧木抵抗能力下降或后期
‘星光’接穗抵抗能力变弱有关ꎮ
Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｊｕｊｕｂｅ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｉｎｇ
ｉｎ Ｊｕｌｙ ａｆｔｅｒ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｏｎｔｏ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ
Ｓａｍｌｐｅ
Ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｃｉｏｎｓ
ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｇｒｅｅｓ (ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｇｒａｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ)
０ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
Ｄａｈｏｎｇｐａｏｚａｏ (ＨＳ) － － － － ３.９０×１０８ ３.３３×１０９
Ｂｅｉｌｉｕｘｉｄｏｎｇｚａｏ (Ｓ) － － ７.３０×１０７ ９.４５×１０８ ４.３８×１０９ －
Ｌｉａｎｐｅｎｇｚｉｚａｏ (Ｓ) － １.３０×１０６ １.６３×１０６ ２.５８×１０８ ６.１０×１０７ ５.２０×１０８
Ｍａｙａｚａｏ (Ｓ) ４.３７×１０５ １.１９×１０７ － １.１２×１０７ － －
Ｙｕｅｇｕａｎｇｚａｏ (Ｓ) ４.４５×１０６ － ２.６９×１０６ ２.２２×１０６ － －
Ｈｕｌｕｚａｏ (ＭＲ) １.９９×１０５ ８.７０×１０７ － １.４３×１０８ － －
Ｈｅｉｙａｏｚｉｚａｏ (Ｒ) － １.８３×１０６ ８.３０×１０８ － － －
Ｇａｇａｚａｏ (Ｒ) ２.３８×１０６ ２.５４×１０６ ７.６０×１０６ １.１２×１０７ ８.６０×１０７ ４.４６×１０９
Ｘｉｎｇｇｕａｎｇ (ＨＲ) ２.１７×１０７ － － － － －
Ｈｅａｌｔｈｙ ｊｕｊｕｂｅ ０ － － － － －
Ｄｏｎｇｚａｏ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ(Ｓ) － － － － － ２.８０×１０９
ＨＳ＝ｈｉｇｈ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅꎻ Ｓ＝ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅꎻ Ｒ＝ｒｅｓｉｓｔａｎｔꎻ ＭＲ＝ｍｏｄｅｒａｔｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅꎻ ＨＲ＝ｈｉｇｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ.
Ｔａｂｌｅ ４ Ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ‘Ｘｉｎｇｇｕａｎｇ’ ｓｃｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｎｔｈｓ ｉｎ ２００２
Ｓａｍｌｐｅ
Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｎｔｈ
Ｊｕｌ. Ａｕｇ. Ｓｅｐ. Ｏｃｔ.
Ｘｇ１ ０.０ ２０.０ ６０.０ ４０.０
Ｒｓｔ１ １００.０ １００.０ １００.０ １００.０
Ｘｇ２ ０.０ ０.０ ０.０ ０.０
Ｒｓｔ２ ７０.０ ６０.０ ８０.０ ８０.０
Ｘｇ４ ０.０ ０.０ ０.０ ０.０
Ｒｓｔ４ ２８.０ ３０.０ ２８.６ ６０.０
Ｘｇ８ ０.０ ０.０ ５.７ ８.６
Ｒｓｔ８ ２０.０ ４０.０ １００.０ ９０.０
Ｘｇ:Ｘｉｎｇｇｕａｎｇꎻ Ｒｓｔ: Ｔｈｅ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋ ｆｏｒ Ｘｉｎｇｇｕａｎｇ ｓｃｉｏｎｓ ｇｒａｆｔｉｎｇ.
５２５
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ３ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｙｍｐｔｏｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｖ ‘Ｘｉｎｇｇｕａｎｇ’ ｓｃｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ
ｄｕｒｉｎｇ ２０１２ ａｆｔｅｒ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｏｎｔｏ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ‘Ｄｏｎｇｚａｏ’ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ ｉｎ ２０１１
ａ: Ｔｒｅｅ Ｘｉｎｇｇｕａｎｇ (Ｘｇ)１ ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｓｃｉｏｎ ａｎｄ ｄｅａｄ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓｈｏｏｔ ｉｎ Ｍａｙ ２ꎬ ２０１２ꎻ ｂ: Ｔｒｅｅ Ｘｇ１ ａｎｄ
Ｘｇ２ ｉｎ Ｍａｙ ２４ꎻ ｃ ＆ ｄ: Ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｘｇ４ ｓｃｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋ ｏｆ ｇｒａｄｅ Ｉ ｉｎ Ｊｕｎｅ ８ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ
ｅ ＆ ｆ: Ｘｇ１ ａｎｄ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｓｃｉｏｎ ｏｆ Ｘｇ４ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｎｏｒｍａｌ ｆｒｕｉｔｓ ｉｎ Ｊｕｌｙ ５ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ ｇ ＆ ｈ: Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｓｃｉｏｎ (ｕｐ)
ａｎｄ ｇｒａｄｅ ＩＶ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋ (ｄｏｗｎ) ｏｆ Ｘｇ８ ａｎｄ ｓｙｍｐｔｏｍ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋ ｏｆ Ｘｇ４ ｉｎ Ａｕｇｕｓｔ ２ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ
ｉ ＆ ｊ: Ｇｒａｄｅ ＩＩ ｓｃｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋ ｉｎ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ４ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ ｋ ＆ ｌ: Ｙｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｘｇ１ ｓｃｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｌｏｄｙ ｏｆ Ｘｇ８
ｓｃｉｏｎ ｉｎ Ｏｃｔｏｂｅｒ ８ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｔａｂｌｅ ５ Ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ‘Ｘｉｎｇｇｕａｎｇ’ ｓｃｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ
Ｓａｍｌｐｅ
Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒａｄｅ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｎｔｈ
Ｊｕｌ. Ａｕｇ. Ｓｅｐ. Ｏｃｔ.
Ｘｇ１ ２.１７×１０７(０) ４.３２×１０９(Ⅰ) １.８８×１０９(Ⅲ) ３.４８×１０９(Ⅱ)
Ｒｓｔ１ ２.８０×１０９(Ⅴ) ２.２８×１０１０(Ⅴ) １.１６×１０１０(Ⅴ) ９.５５×１０９(Ⅴ)
Ｘｇ２ １.４０×１０５(０) ８.０５×１０５(０) ２.５４×１０６(０) １.８１×１０６(０)
Ｒｓｔ２ １.６５×１０８(Ⅲ) ２.１９×１０９(Ⅱ) ５.００×１０８(Ⅲ) ４.４６×１０９(Ⅳ)
Ｘｇ４ １.７２×１０５(０) ６.０５×１０５(０) ４.７１×１０６(０) １.４５×１０５(０)
Ｒｓｔ４ ７.５０×１０７(Ⅰ) ２.３６×１０８(Ⅱ) １.６６×１０９(Ⅲ) ４.３６×１０９(Ⅳ)
Ｘｇ８ ５.４５×１０５(０) ６.５５×１０６(０) ２.１４×１０８(０) ａ ３.２１×１０９(０) ａ
Ｒｓｔ８ １.９７×１０７(０) １.１４×１０９(Ⅳ) ２.０４×１０８(Ⅳ) １.９３×１０９(Ⅲ)
Ｘｇ: Ｘｉｎｇｇｕａｎｇꎻ Ｒｓｔ: Ｔｈｅ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋ ｆｏｒ Ｘｉｎｇｇｕａｎｇ ｓｃｉｏｎｓ ｇｒａｆｔｉｎｇꎻ ａ: Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ３ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓｃｉｏｎｓ (ｗｉｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ
ｇｒａｄｅ Ｉ) ａｎｄ ４ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｓｃｉｏｎｓꎬ ｏｎｌｙ ｔｈｅ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｓｃｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ.
６２５
５期 任争光ꎬ等:实时荧光定量 ＰＣＲ(ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ)检测不同抗枣疯病枣树品种嫁接接穗中的植原体浓度
‘星光’接穗和砧木中植原体实时荧光定量
ＰＣＲ检测结果见表 ５ꎮ ‘星光’１ 号接穗植原体含
量 ７月份达 ２.１７×１０７个 / ｇ 鲜重ꎬ８~ １０ 月份均高于
１.８８×１０９个 / ｇ鲜重ꎮ 而‘星光’１ 号砧木的植原体
浓度最高时达 ２.２８×１０１０个 / ｇ鲜重ꎮ 对‘星光’２号
和 ４号接穗的检测结果发现ꎬ尽管其砧木的植原体
浓度达到 １０８ ~１０９个 / ｇ鲜重ꎬ嫁接接穗的植原体含
量却一直在 １０５ ~ １０６个 / ｇ 鲜重ꎬ说明‘星光’品种
具有抑制植原体在其枝条内繁殖的能力ꎬ并且这种
能力与接穗的数量相关ꎮ 与‘星光’２ 号和 ４ 号不
同的是ꎬ‘星光’８ 号接穗后期(９ 月和 １０ 月份)植
原体浓度也达到和砧木相当的水平(１０８ ~ １０９个 / ｇ
鲜重)ꎬ该砧木嫁接的接穗中有 ３ 枝发病已达Ⅰ
级ꎬ４ 枝接穗未见发病症状ꎬ这也说明‘星光’品种
具有较强的耐病能力ꎮ
３ 讨论
据报道ꎬ我国枣树品种达 ９００ 余种ꎬ酸枣品种
或类型达 ３５个ꎬ这为选育优良抗病品种提供了丰
富的资源[１０ꎬ １１]ꎮ 目前选育抗枣疯病品种采用的抗
病性鉴定和评价方法ꎬ主要是通过嫁接接种、症状
观察和病原菌检测[６ꎬ １２]ꎮ Ｌｉｕ 等[１３]利用在病树上
嫁接待鉴定种质的高强度筛选法从骏枣变异单株
中选育出高抗枣疯病新品种‘星光’ꎬ其综合性状
良好ꎬ既可作为抗病品种进行栽培ꎬ也可用于染病
植株和感病品种的高接改造ꎮ Ｔｉａｎ 等[６]对 ２００８ ~
２０１０年收集的我国不同枣树品种(系)的健康繁殖
材料进行了筛选鉴定ꎬ认定‘骏枣’和‘壶瓶枣’为
高抗枣疯病品种ꎻ‘蛤蟆枣’、‘蜂蜜罐’为中抗品
种ꎻ‘灵宝大枣’、‘磨盘枣’及‘尜尜枣’为普抗品
种ꎻ‘金丝小枣’、‘交城酸枣’和‘尖枣’为感病品
种ꎬ‘赞皇大枣’为高感品种ꎮ 本研究通过嫁接接
种和发病调查进一步确定了 １０个不同枣树品种的
抗病性ꎬ建立了枣疯病植原体 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 荧光
定量 ＰＣＲ检测体系ꎬ并率先将该技术用于抗枣疯
病鉴定研究ꎬ明确了枣树发病级别与植原体浓度之
间的关系ꎬ证实了‘黑腰子枣’的耐病力及‘星光’
品种的高抗病能力ꎮ 建立的 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定
量 ＰＣＲ检测技术体系将是深入探讨枣树品种抗病
机理、准确筛选和评价品种抗性的重要手段ꎬ也是
筛选有效治疗药剂防控病害的有效工具ꎮ 另外ꎬ该
检测体系的检测灵敏度比常规 ＰＣＲ 有了很大提
高ꎬ可在植原体病害的检验检疫上发挥作用ꎮ
实时荧光定量 ＰＣＲ 技术依其高效性、灵敏性
及高特异性的特点ꎬ使其在植原体的检测特别是应
对含量较低样品的检测中越来越重要[１４~１８]ꎮ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量 ＰＣＲ是相对于 ＴａｑＭａｎ 探
针荧光定量 ＰＣＲ 更为经济简便的荧光定量 ＰＣＲ
技术ꎮ 但 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 荧光定量 ＰＣＲ 的缺点是
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 荧光染料能够结合所有的双链
ＤＮＡꎬ在使用 １６Ｓ ｒＤＮＡ 为靶标基因时ꎬ由于序列
的保守性强ꎬ特别是野外采集的样品ꎬ细菌 ＤＮＡ
的污染以及植物样本 ＤＮＡ 的干扰都会严重影响
检测结果ꎬ所以在 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 荧光定量 ＰＣＲ中
引物的特异性至关重要ꎮ 本研究分别在枣疯病植
原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列内部设计了 ２ 对引物
(ＤＺ１６ＳｎＦ / ＤＺ１６ＳｎＲ 和 ＤＺ１６ＳＦ￣２ / ＤＺ１６ＳＲ￣２)ꎬ
通过建立荧光定量 ＰＣＲ检测体系来检测枣疯病样
品的植原体浓度ꎬ在利用溶解曲线分析时发现引物
ＤＺ１６ＳｎＦ / ＤＺ１６ＳｎＲ特异性差ꎬ健康植物本身也出
现了溶解峰(数据未显示)ꎬ推测该引物能扩增到
植物基因组中的相似或同源基因序列ꎬ比如叶绿体
基因ꎬ或污染细菌的相关保守序列[１９]ꎬ而引物
ＤＺ１６ＳＦ￣２ / ＤＺ１６ＳＲ￣２具有较高的特异性ꎬ适合枣
疯病样品的检测ꎮ 目前ꎬ多数荧光定量 ＰＣＲ 都以
质粒模板建立标准曲线ꎬ原因是质粒模板容易操
作ꎬ定量分析方便ꎬ然而相对于质粒模板ꎬ待测样品
中含有大量的植物 ＤＮＡ 或其他干扰物质ꎬ势必会
影响 ＰＣＲ 的扩增效率ꎬ造成系统误差ꎮ 本试验建
立的荧光定量 ＰＣＲ 检测体系ꎬ很可能低估了枣树
样品中的植原体含量ꎮ 另外ꎬ本试验统一采取枣树
枝条顶部幼嫩的枝叶来提取总 ＤＮＡꎬ一方面这些
枝条韧皮部是植原体侵染繁殖最为旺盛的部位ꎬ另
一方面减小了因采样部位不同而造成不同样品间
的误差ꎬ然而ꎬ这样也出现了样品的代表性误差ꎮ
但是ꎬ鉴于植原体的严格寄生特性和嫁接接穗的生
长时间短ꎬ枝条生长量较小(一般枝条长度小于 ３０
ｃｍ)等特点ꎬ本试验建立的荧光定量 ＰＣＲ 体系对
样品检测的结果在一定程度上反映了植原体在嫁
接接穗中的扩展繁殖情况ꎮ
在抗病性筛选和植原体病害防治实践中ꎬ了解
植原体的侵染和浓度变化至关重要ꎮ 迄今ꎬ关于植
原体浓度变化与植物抗病性的相关研究报道还很
少ꎮ 本研究揭示的枣疯病组织中植原体浓度范围
７２５
植物病理学报 ４５卷
与之前侵染其他植物的植原体或细菌的定量分析
结果基本吻合ꎮ 例如ꎬ在发病为 ＩＶ至 Ｖ 级的感病
砧木及所测定的感病接穗‘大红袍枣’的植原体ꎬ
最高含量可达 １０９ ~ １０１０个 / ｇ 鲜重ꎬ其他研究报道
在植原体侵染感病的长春花和苹果体内ꎬ及感染柑
橘黄龙病韧皮部杆菌(Ｃａ. Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ)的
严重褪绿叶片内都检测到相近浓度范围的菌体数
量[２０ꎬ ２１]ꎮ 而在抗病‘黑腰子枣’等品种表现出的
较高浓度下发病症状较轻的现象ꎬ也可能反映出不
同抗性的寄主植物对不同浓度植原体的耐受能力
存在差异ꎬ或者在植原体与寄主互作过程中存在着
不同的互作方式[２２]ꎮ 以‘星光’、‘壶瓶枣’为代表
的骏枣和壶瓶枣种源具有对枣疯病的高抗特性已
被充分证实[６ꎬ １３ꎬ ２３ꎬ ２４]ꎬ并发现一些可能的抗病反
应ꎬ包括抗病相关基因、表达蛋白及代谢物质
等[１]ꎬ但要完全揭示其抗病机理尚待试验证实ꎮ
本研究对高抗品种‘星光’的调查发现ꎬ随着‘星
光’接穗数量增加ꎬ不仅很好地维持接穗自身的正
常健壮生长ꎬ而且还表现出更明显的减轻感病砧木
症状的效应ꎬ如砧木内植原体已达到 １０９个 / ｇ 鲜重
时ꎬ‘星光’２ 号和‘星光’４ 号接穗虽然已被感染ꎬ
但仍能正常开花结果ꎬ植原体含量也维持较低水平
(１０５~６个细胞)ꎮ 而‘星光’ １ 号由于接穗较少ꎬ后
期叶片黄化丛枝加重ꎬ植原体繁殖数量增加迅速ꎬ
以至于和砧木的植原体含量相当(１０９个 / ｇ 鲜重)ꎮ
但是相对于发病为 Ｖ 级的砧木ꎬ‘星光’１ 接穗发
病仍然较轻(仅为Ⅱ级)ꎮ 值得注意的是ꎬ‘星光’８
号处理ꎬ嫁接接穗虽然较多ꎬ但是在调查后期(１０
月份)植原体也逐渐繁殖至与砧木相当水平ꎬ个别
接穗出现发病症状(仅为Ⅰ级)ꎬ但仍有接穗发病
为 ０级ꎬ这反映出寄主接穗与植原体长时间较量的
复杂性和波动性ꎮ 根据上述调查结果ꎬ推断‘星
光’品种可能具有或诱导合成ꎬ并能通过输导组织
向砧木运转的抗病物质或信号来抵御植原体繁殖和
致病ꎬ比如水杨酸、酚类等次生代谢物质ꎬ以及活性
氧和植保素等ꎬ这些物质对植原体的抗性关系密
切[２４~２７]ꎻ而植原体浓度与症状严重度之间的正相关
性ꎬ可能与植原体的生长和繁殖条件或植原体效应
子分泌、运转和诱导寄主植物致病或抑制寄主的抗
病反应有关[３]ꎮ 这都是值得深入开展的研究课题ꎮ
参考文献
[１] Ｌｉｕ Ｍ Ｊꎬ Ｚｈａｏ Ｊꎬ Ｚｈｏｕ Ｊ Ｙ. Ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ
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ｒａｌ Ｐｒｅｓｓ (北京: 中国农业出版社)ꎬ ２０１０.
[２] Ｙａｎｇ Ｈ Ｘꎬ Ｗａｎｇ Ｙꎬ Ｚｈａｏ Ｙ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌａｓ￣
ｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ( ＪＷＢ) ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｆｒｏｍ Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂａ Ｍｉｌｌ. ‘ Ｚａｎｈｕａｎｇ￣
ｄａｚａｏ’ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ
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[３] Ｓｕｇｉｏ Ａꎬ ＭａｃＬｅａｎ Ａ Ｍꎬ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｈ Ｎꎬ ｅｔ ａｌ.
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ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｏ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｓｅｃｔｓ [ Ｊ] . Ａｎｎｕａｌ
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[４] Ｓｅｅｍüｌｌｅｒ Ｅꎬ Ｈａｒｒｉｅｓ Ｈ. Ｐｌａｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ [Ａ] . Ｗｅｉｎ￣
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ｈｏｓｔｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒｓ [Ｍ] . ＵＫ:ＣＡＢＩ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇꎬ ２０１０.
１４７－１６９.
[５] Ｚｈａｏ Ｊ Ｆꎬ Ｈｕ Ｊ Ｘꎬ Ｓｏｎｇ Ｃ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ
ｍａｉｎ ｊｕｊｕｂｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｉｎ Ｆｅｎｇｔａｉ ｄｉｓｔｒｉｃｔꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ ａｇａｉｎｓｔ
ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] .
Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｅｓｔ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ (中国森林病虫)ꎬ ２０１１ꎬ ３０
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[６] Ｔｉａｎ Ｇ Ｚꎬ Ｌｉ Ｚ Ｑꎬ Ｈｕ Ｊ Ｘꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｊｕｊｕｂｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ
( ｌｉｎｅ) ａｇａｉｎｓｔ ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｎ
Ｃｈｉｎａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｃｈｉｎａ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ (林业科技开发)ꎬ ２０１３ꎬ ２７(３): １９－２５.
[７] Ｌｉ Ｙꎬ Ｔｉａｎ Ｇ Ｚꎬ Ｐｉａｏ Ｃ Ｇꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒａｐｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｆ￣
ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｒｎａｓ
ｆｒｏｍ ｓｅｖｅｒａｌ ｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ
Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学报)ꎬ ２００５ꎬ ３５
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[８] Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ Ｄ Ｅꎬ Ｌｅｅ Ｉ Ｍ. Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｂｙ ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ [ Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ. Ｍｅｄｉｔｅｒｒ.ꎬ １９９６ꎬ ３５
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[９] Ｌｅｅ Ｉ Ｍꎬ Ｄａｖｉｓ Ｒ Ｅꎬ Ｄａｗｎ Ｅ. Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ: ｐｈｙｔｏ￣
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ [ Ｊ] . Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ￣
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[１０] Ｑｕ Ｚ Ｚꎬ Ｗａｎｇ Ｙ Ｈ. Ｃｈｉｎｅｓｅ ｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅｓ: Ｊｕｊｕｂｅ ( ｉｎ
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８２５
５期 任争光ꎬ等:实时荧光定量 ＰＣＲ(ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ)检测不同抗枣疯病枣树品种嫁接接穗中的植原体浓度
[１２] Ｚｈａｏ Ｊꎬ Ｌｉｕ Ｍ Ｊꎬ Ｚｈｏｕ Ｊ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｊｕｊｕｂｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ｂｒｏｏｍ ｄｉｓｅａｓｅ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
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[１３] Ｌｉｕ Ｍ Ｊꎬ Ｚｈｏｕ Ｊ Ｙꎬ Ｚｈａｏ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｎ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｎｅｗ
ｃｕｌｔｉｖａｒ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｊｕｊｕｂｅ
ｗｉｔｃｈｅｓ ｂｒｏｏｍ ｄｉｓｅａｓｅ ‘ Ｘｉｎｇｇｕａｎｇ’ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ )
[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｓｉｎｉｃａ (园艺学报)ꎬ ２００６ꎬ ３３
(３): ６８７.
[１４] Ｌｉａｏ Ｘ Ｌꎬ Ｚｈｕ Ｓ Ｆꎬ Ｃｈｅｎ Ｈ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ
ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ｆｏｒ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ( ｉｎ Ｃｈｉ￣
ｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学
报)ꎬ ２００２ꎬ ３２(４): ３６１－３６６.
[１５] Ｔｏｒｒｅｓ Ｅꎬ Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ Ｅꎬ Ｃａｍｂｒａ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ＰＣＲ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｆｒｏｍ ａｐｐｌｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
(１６ＳｒＸ) ｇｒｏｕｐ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓꎬ
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[１６] Ｃｒｏｓｓｌｉｎ Ｊ Ｍꎬ Ｖａｎｄｅｍａｒｋ Ｇ Ｊꎬ Ｍｕｎｙａｎｅｚａ Ｊ Ｅ. Ｄｅｖｅ￣
ｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅꎬ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂａｓｉｎ ｐｏｔａｔｏ ｐｕｒｐｌｅ ｔｏｐ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｎ
ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｂｅｅｔ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅꎬ ２００６ꎬ
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[１７] Ｍａｒｔｉｎｉ Ｍꎬ Ｌｏｉ Ｎꎬ Ｅｒｍａｃｏｒａ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ‘Ｃａｎ￣
ｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｐｒｕｎｏｒｕｍ’ ｉｎ ｉｔｓ ｎａｔｕｒａｌ ｈｏｓｔｓ
[Ｊ] . Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｉｎｓｅｃｔｏｌｏｇｙꎬ ２００７ꎬ ６０(２): ２５１－２５２.
[１８] Ｈｏｕ Ｌ Ｈꎬ Ｈｕａｎｇ Ｘꎬ Ｚｈｕ Ｓ Ｆ. Ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃ￣
ｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ ｂｒｏｏｍ ｂｙ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ (生物技
术通讯)ꎬ ２０１０ꎬ ２１(１): ７０－７２.
[１９] Ｌｉｎ Ｃ Ｌꎬ Ｓｏｎｇ Ｃ Ｓꎬ Ｈｕ Ｊ Ｘꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｒｒｙ ｌｅｔｈａｌ ｙｅｌｌｏｗｓ
ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｃ] . Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ
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２０１１. ２５６.
[２０] Ｂｉｓｏｇｎｉｎ Ｃꎬ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｂꎬ Ｓａｌｍ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｐｐｌｅ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ａｐｏｍｉｃｔｉｃ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ ａｎｄ ｉｔｓ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ [Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００８ꎬ
９８(２): １５３－１５８.
[２１] Ｆｏｌｉｍｏｎｏｖａ Ｓ Ｙꎬ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｃ Ｊꎬ Ｇａｒｎｓｅｙ Ｓ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ
ｃｉｔｒｕｓ ｔｏ Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ ( ｃｉｔｒｕｓ ｇｒｅｅｎｉｎｇ ) ｕｎｄｅｒ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ [ Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ ９９
(１２): １３４６－１３５４.
[２２] Ｂｅｒｇｅｓ Ｒꎬ Ｒｏｔｔ Ｍꎬ Ｓｅｅｍüｌｌｅｒ Ｅ. Ｒａｎｇｅ ｏｆ
ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｐｌａｎｔ ｈｏｓｔｓ ａｓ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
[Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２０００ꎬ ９０(１０): １１４５－１１５２.
[２３] Ｚｈａｏ Ｊꎬ Ｌｉｕ Ｍ Ｊꎬ Ｚｈｏｕ Ｊ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ
ｙｅａｒ－ｒｏｕｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’
ｂｒｏｏｍ ( ＪＷＢ) ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ
ｊｕｊｕｂｅ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｌｖａｅ Ｓｉｎｉｃａｅ (林
业科学)ꎬ ２００６ꎬ ４２(８): １４４－１４６.
[２４] Ｔｉａｎ Ｇ Ｚꎬ Ｚｈａｎｇ Ｘ Ｊꎬ Ｌｕｏ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ
ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
ｐａｕｌｏｗｎｉａ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒａｆｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｌｖａｅ Ｓｉｎｉｃａｅ (林业科
学)ꎬ １９９９ꎬ ３５(４): ３１－３９.
[２５] Ｋｕａｉ Ｙ Ｚꎬ Ｚｈｕ Ｆ Ｐꎬ Ｘｉａ Ｚ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｖａｒｉｅｔａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｍｕｌｂｅｒｒｙ
ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ ｄｉｓｅａｓｅ [ Ｊ ] . Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓꎬ １９９９ꎬ １７: １０３－１１４.
[２６] Ｔｉａｎ Ｇ Ｚꎬ Ｘｉｏｎｇ Ｙ Ｇꎬ Ｗａｎｇ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ Ｐａｕｌｏｗｎｉａ ｔｏ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ｂｒｏｏｍ ａｇｅｎｔ
ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ￣ｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ (ＭＬＯ) ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] .
Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ (林业科学研究)ꎬ １９９４ꎬ ７(２): １５５
－１６１.
[２７] ＴｉａｎＧ Ｚꎬ Ｌｉ Ｙꎬ Ｌｉａｎｇ Ｗ Ｘꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ
ｐａｕｌｏｗｎｉａ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ
ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｅ ｉｎ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ
ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｐａｕｌｏｗｎｉａ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] .
Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｌｖａｅ Ｓｉｎｉｃａｅ (林业科学)ꎬ ２０１０ꎬ ４６(９):
９６－１０４.
责任编辑:于金枝
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